实验8 吲哚乙酸氧化酶活性的测定

收稿日期:1999-07-15;修回日期:1999-11-12基金项目:广东省重点攻关项目(99M 04201G)及广东省林业厅和雷州林业局资助项目(950023)的一部分作者简介:李明(1963-),女,黑龙江五常人,现为甘肃中医学院讲师. 文章编号:1001-1498(2000)05-0493-08难易生根桉树多酚氧化酶、吲哚乙酸氧化酶活性及其同工酶的比较研究李　明1,黄卓烈1,谭绍满1,莫晓勇2,林海球2,龙　腾2(1华南农业大学,广东广州　510642; 2.国家林业局雷州林业科学研究所,广东湛江　524348)摘要:尾叶桉的M L A 无性系(简称M L A)是难生根无性系,尾叶桉的U 6无性系(简称U 6)、刚果12号桉W 5无性系(简称W 5)为易生根无性系。

M L A 各器官的多酚氧化酶(PPO )活性比U 6、W 5的低,而M L A 各器官的吲哚乙酸氧化酶(I AAO )活性比U 6、W 5的高。

各树种的P PO 活性、I A AO 活性及P PO 同工酶均具有器官的特异性。

讨论了P PO 和I AAO 与不定根的发生和发展的关系。

关键词:桉树无性系;多酚氧化酶;吲哚乙酸氧化酶;扦插生根中图分类号:S 718.43;　Q 946 文献标识码:A 多酚氧化酶(po lyphenol oxidase,PPO)、吲哚乙酸氧化酶(indo acetic acid ox idase,IAAO)普遍存在于高等植物中,在植物的生长、发育中起重要的作用。

PPO 是一种含铜的酶,能催化各种酚类氧化。

IAAO 能降解吲哚乙酸(IAA),调节植物体内的IAA 水平,从而影响植物的生长发育。

据研究,植物体内的PPO 活性与植物的不定根的形成有着非常密切的联系。

Kieliszew ska-Rokicha [1]的研究指出,黑松(Pinus thunbergii Parl)在生根过程中,IAAO 的活性升高。

植物中吲哚乙酸生命学检测分析技术的研究随着科技的不断进步，生命科学领域的研究也逐渐深入。

植物作为自然界中最重要的生物之一，其在生存、繁衍、免疫防御等方面的生化过程一直备受科学家们的关注。

吲哚乙酸（Indole-3-Acetic Acid，IAA）作为植物中最常见的植物生长素之一，其作用已经被科学家们广泛研究。

而如何高效地检测和分析植物中的吲哚乙酸含量，则成为了生命科学领域中的重要课题之一。

植物中吲哚乙酸的生化过程植物中的吲哚乙酸生化过程非常复杂，包括生物合成、代谢、信号转导等多个环节。

其中，植物产生吲哚乙酸的主要途径为嫁接、花药、根系、新梢等处。

经过生物合成后，吲哚乙酸会被送到各个部位，并因受到机械、光线、温度等刺激而释放。

同时，在吲哚乙酸代谢的过程中，植物还会产生各种代谢产物，如3-吲哚醋酸（3-Indoleacetic Acid，3-IAA）、吲哚酰-L-天冬氨酸（Indoleacetyl-L-aspartic acid，IAA-Asp）等。

植物中吲哚乙酸的检测方法在植物研究领域中，检测吲哚乙酸的含量是极为重要的。

目前，常用的吲哚乙酸检测方法主要有高效液相色谱（High Pressure Liquid Chromatography，HPLC）、气相色谱质谱联用（Gas Chromatography-Mass Spectrometry，GC-MS）等。

HPLC法是目前应用最为广泛的检测方法之一，它采用了一种复杂的分离和检测技术，可以对样品进行快速的分离和定量。

而GC-MS法则是一种在高温下将样品中的化合物转化为气态，然后通过质谱分析进行检测的方法，可以对样品进行更加精确的分析。

另外，随着人类对生命科学的认识不断提高，新兴的技术也不断出现。

比如，近年来兴起的生物传感器技术，其原理是通过将感受器和传感器结合，建立起一种快速、准确的化学检测系统。

将其应用于吲哚乙酸的检测中，可以大大提高检测的准确性和效率。

例1．生长素是最早发现的一类促进植物生长的激素。

以下为研究人员利用水稻进行有关生长素的实验。

根据所学知识，回答下列问题：图1 图2（1）水稻植物生长素主要的合成部位是________________，合成的原料是________。

（2）图1表示水稻幼苗生长素浓度与其作用的关系。

研究人员测得已经表现出向光性的水稻幼苗，其向光侧的生长素浓度为f，则其背光侧的生长素浓度y的范围为______。

（3）图2表示将水稻的胚芽鞘切除尖端后，在切面一侧放置含不同浓度生长素的琼脂块，并测定各胚芽鞘弯曲生长的角度，结果发现，在一定范围内，随着生长素浓度增加，α先逐渐增大，后逐渐减小，由此可得出结论：______________。

（4）用单侧光照射水稻根，可引起水稻根出现背光生长的现象，其原因可能是_________。

【答案】（1）幼嫩的芽、叶和发育中的种子色氨酸（2）f<y<2f（3）在一定范围内，随生长素浓度升高，对胚芽鞘生长的促进作用先增强后减弱（4）在单侧光照射下，背光侧生长素浓度高于向光侧，由于根对生长素浓度敏感，使得背光侧生长受到抑制，而向光侧生长受促进，因此出现根的背光生长现象【解析】（3）据题图分析可知，在一定范围内，随生长素浓度升高，对胚芽鞘生长的促进作用先增强后减弱。

（4）在单侧光照射下，背光侧生长素浓度高于向光侧，由于根对生长素浓度敏感，使得背光侧生长受到优选例题植物生命活动的调节大题优练8抑制，而向光侧生长受促进，因此出现根的背光生长现象。

例2．植物的生长不仅受到激素调控，还受到光的调控。

科研人员对光和脱落酸（ABA）如何影响某植物生长进行了研究。

（1）光作为能源驱动植物进行光合作用，光合作用既为植物自身生长发育，也为其他生物的生长发育提供_________。

近年来研究发现，光还作为_________在植物体中被光敏色素（一种蛋白）捕捉，进而调控植物的生长发育。

（2）科研人员测定了野生型植株和光受体缺失突变体中ABA的含量，结果如图1所示。

第八章植物生长物质一、名词解释1. 植物生长物质：能够调节植物生长发育的微量化学物质，包括植物激素和植物生长调节剂。

2. 植物激素：在植物体内合成的、能从合成部位运往作用部位、对植物生长发育能产生显著调节作用的微量小分子物质。

目前国际上公认的植物激素有五大类，即：生长素类、赤霉素类、细胞分裂素类、脱落酸、乙烯。

也有人建议将油菜素甾体类、茉莉酸类也列为植物激素。

3. 生长调节物质：一些具有类似于植物激素生理活性的人工合成的小分子化学物质，如2，4-D、NAA、乙烯利等。

4. 燕麦试法（avena test）：亦称燕麦试验、生长素的燕麦胚芽鞘测定法。

是早期定量测定生长素含量的一种方法。

操作时，先将燕麦胚芽鞘尖端切下，置于琼脂上，经过一段时间后，在胚芽鞘中的生长素就会扩散到琼脂中。

然后将琼脂切成小块，放置于去掉尖端的胚芽鞘上，由于含有生长素的琼脂块具有促进生长的能力，因此参照琼脂块中生长素含量与燕麦胚芽鞘尖端弯曲这二者之间的定量关系，即可用于鉴定、评估生长素的活性与相对含量。

5. 燕麦单位（avena unit, AU）：指用燕麦试法对生长素进行生物测定时，所设定的生长素的相对单位，以燕麦胚芽鞘的生长弯曲度来表示。

标准如下：在温度为25℃，相对湿度为90%，作用时间为90分钟的情况下，燕麦胚芽鞘每弯曲10°所需要的生长素的量，就称为一个燕麦单位。

6. 极性运输（polar transport）：物质只能从形态学的一端向另一端运输而不能倒过来运输的现象，称为极性运输。

如胚芽鞘中的生长素只能从形态学上端（顶部）向下端（基部）进行运输。

7. 三重反应（triple response）：乙烯对黄化豌豆幼苗的生长具有抑制茎的伸长生长、促进茎或根的增粗生长和使茎横向生长（即使茎失去负向重力性生长）的三个方面的效应，是乙烯导致的典型的生物效应。

8. 偏上性生长（epinasty growth）：指植物器官上、下两部分的生长速度不一致，上部组织的生长速度快于下部组织的现象。

实验1 植物组织渗透势的测定（质壁分离法）原理当植物组织细胞内的汁液与其周围的某种溶液处于渗透平衡状态，植物细胞内的压力势为零时，细胞汁液的渗透势就等于该溶液的渗透势。

该溶液的浓度称为等渗浓度。

当用一系列梯度浓度溶液观察细胞质壁分离现象时，细胞的等渗浓度将介于刚刚引起初始质壁分离的浓度和尚不能引起质壁分离的浓度之间的深液浓度。

代入公式即可计算出春渗透势。

仪器药品显微镜载玻片及盖玻片镊子刀片配成0.5—0.1mol/L梯度浓度的蔗糖溶液各50ml。

称34.23g蔗糖用蒸馏水配成100ml，其浓度为1m0le/L（母液）。

再配制成下列各种浓度：0.50mol/L：吸母液25ml+水25ml0.45mol/L：吸母液22.5ml+水27.5ml0.40mol/L：吸母液20.0ml+水30.0ml0.35mol/L：吸母液17.5ml+水32.5ml0.30mol/L：吸母液15.0ml+水35.0ml0.25mol/L：吸母液12.5ml+水37.5ml0.20mol/L：吸母液10.0ml+水40.0ml0.15mol/L：吸母液7.5ml+水42.5ml0.10mol/L：吸母液5.0ml+水45.0ml操作步骤将带有色素的植物组织（叶片），一般选用有色素的洋葱鳞片的外表皮、紫鸭跖草、苔藓、红甘蓝或黑藻、丝状藻等水生植物，也可用蚕豆、玉米、小麦等作物叶的表皮。

撕取下表皮，迅速分别投入各种浓度的蔗糖溶液中，使其完全浸入，5—10分钟后，从0.5mol/L开始依次取出表皮薄片放在滴有同样溶液的载玻片上，盖上盖玻片，于低倍显微镜下观察，如果所有细胞都产生质壁分离的现象，则取低浓度溶液中的制片作同样观察，并记录质壁分离的相对程度。

实验中必须确定一个引起半数以上细胞原生质刚刚从细胞壁的角隅上分离的浓度，和不引起质壁分离的最高浓度。

在找到上述浓度极限时，用新的溶液和新鲜的叶片重复进行几次，直至有把握确定为止。

吲哚乙酸氧化酶检测试剂盒（IAA比色法）吲哚乙酸氧化酶检测试剂盒(IAA比色法)简介：植物体内生长素的种类很多，其中吲哚乙酸(IAA)是植物体内普遍存在的一种生长素，植物体内IAA的含量，对于植物的生长、发育、衰老、脱落等均有重要意义。

植物体内存在吲哚乙酸氧化酶(Indoleacetic acid oxida-se)，该酶是植物体内一种氧化分解吲哚乙酸的酶，吲哚乙酸氧化酶能够氧化IAA使其失去活性，从而调节体内IAA的水平，影响植物的生长。

Leagene吲哚乙酸氧化酶检测试剂盒(IAA比色法)检测原理是吲哚乙酸在吲哚乙酸氧化酶作用下形成吲哚醛，使体系中吲哚乙酸含量减少，剩余的吲哚乙酸在无机酸存在下与FeCl3作用生成红色螯合物，吲哚乙酸氧化酶活性的大小可以用其破坏吲哚乙酸的速度表示。

通过比色法(分光光度计)测定吸光度，根据对照与待测样品中吲哚乙酸含量的差值，计算出吲哚乙酸氧化酶活性水平。

该试剂盒主要用于检测植物样本、血清等中吲哚乙酸氧化酶活性，尤其适用于定量测定植物样本吲哚乙酸氧化酶活性。

该试剂盒仅用于科研领域，不宜用于临床诊断或其他用途。

组成：自备材料：1、恒温箱或水浴锅2、研钵或匀浆器3、离心管或试管4、低温离心机5、浓硫酸6、比色杯7、分光光度计操作步骤(仅供参考)：编号名称TE051350TStorage试剂(A):IAA标准(200μg/ml)25ml4℃避光试剂(B):IAA Lysis buffer250ml RT试剂(C):IAA Assay buffer60ml4℃避光使用说明书1份1、准备样品：①植物样品：将大豆或绿豆等种子置于30℃中避光萌发3-4天，选取生长一致的幼苗，除去子叶和根，留下胚轴作为材料。

取胚轴，称重，按每100mg加入适量预冷的IAA Lysis buffer的比例，冰浴情况下充分匀浆或研磨。

离心,留取上清液即为吲哚乙酸氧化酶粗提液。

短期4℃保存待用。

②血浆、血清和尿液样品：血浆、血清按照常规方法制备后可以直接用于本试剂盒的测定，保存，用于吲哚乙酸氧化酶的检测。

2023年河南省五市高三第一次联考理科综合能力测试一、选择题：1.N元素是各种生物进行生命活动的必需元素，下列有关叙述正确的是（）A.细菌吸收的N元素可以合成蛋白质﹑脂肪﹑核酸和ATP等物质B.根瘤菌可以将N2转化为NH3，并利用此过程中获得的能量来合成有机物C.小麦从土壤中吸收有机肥中的N元素，在此过程中有机肥中的能量流向小麦D.动物线粒体内膜N元素含量高于外膜2.免耕法是指农业生产中不松土或少松土，收获时只收割麦穗或稻穗等部位，而将经过处理后的农作物秸秆和残茬保留在农田地表，任其腐烂。

提倡免耕法取代传统种植方法（例如深耕、中耕松土等措施）的原因不包括（）A.增加土壤的透气性，促进根系的有氧呼吸B.传统中耕松土不利于水土保持，能增加沙尘暴的发生C.减少土壤水分蒸发，从而减少灌溉次数D.减少了农田生态系统的物质输出，使土壤肥力得以提高3.下列有关教材实验中使用的试剂和实验原理的叙述，正确的是（）A.制作人的口腔上皮细胞临时装片观察线粒体时，需在洁净载玻片中央滴一滴生理盐水B.盐酸在观察细胞有丝分裂和观察DNA和RNA在细胞中的分布实验中的作用相同C.向某溶液中加入斐林试剂，水浴加热后出现砖红色沉淀，说明该溶液中含有葡萄糖D.在提取纯净的动物细胞膜和植物细胞的质壁分离与复原实验中水的作用原理相近4.适应性免疫应答是指体内抗原特异性T/B淋巴细胞接受抗原刺激后，自身活化、增殖、分化为效应细胞，产生一系列生理效应的全过程。

适应性免疫应答的最重要特征是免疫反应的效力随着反复接触抗原而显著增强。

下列相关叙述错误的是（）A.与第一次免疫应答反应相比，机体第二次受到同种抗原刺激后所产生的抗体量更多B.适应性免疫应答可通过增加疫苗接种次数，使机体获得和维持保护机体所需的高抗体浓度C.当同种抗原进入已免疫的机体时，记忆细胞会迅速增殖、分化，产生浆细胞或效应T细胞D.抗原特异性T/B淋巴细胞可接受抗原刺激，是由于其细胞内存在特有的受体基因5.某雌雄异株的植物，其红花、白花由独立遗传的A/a，B/b基因控制（如图）。

实验26吲哚乙酸含量与吲哚乙酸氧化酶活性的测定植物体内生长素的种类很多，其中吲哚乙酸（ 1AA ）是植物体内普遍存在的一种生长素。

于不同的生育期测定不同器官中 IAA 的含量以及 IAA 氧化酶的活性，对于研究植物的生长、发育、衰老、脱落等均有重要意义。

Ⅰ 吲哚乙酸含量的测定一、原理1947 年，我国植物生理学家汤玉玮等发现，在无机酸存在下，吲哚乙酸能与 FeCl 3 作用，生成红色的鳌合物。

该物质在 530 nm 有最大吸收峰，由此引出 IAA 的比色定量测定，此法可测出μg 量级的 IAA 。

二、实验材料、试剂与仪器设备（一）实验材料玉米种子。

（二）试剂1. IAA 标准溶液：精确称取 IAA （ A.R. ） 10 mg ，先用少量乙醇溶解，后用蒸馏水定容至 100 mL （其浓度为 100 μg/mL ）作为贮备液；然后用贮备液配成 0 （空白）、 0.5 、 1.0 、 5.0 、10.0 、 15.0 、 20.0 、 25.0 μg/mL 的系列浓度标准溶液，作为工作液（现用现配）。

2. 试剂 A ：内含 0.5 mol/L FeCl 3 溶液 15 mL 、浓 H 2 SO 4 （比重 1.84 ） 300 mL 、蒸馏水 500 mL ，于使用前混合摇匀，避光保存， l mL 试液需加此试剂 4 mL 。

3. 试剂 B ：内含 0.5 mol/L FeCl 3 溶液 10 mL 、 35 ％高氯酸 500 mL ，于使用前混合摇匀，避光保存， l mL 试液应加此试剂 2 mL 。

试剂 A 与试剂 B 可任选一种（试剂 B 比试剂 A 灵敏）。

4. 0.1 mol/L NaOH 溶液。

5. 甲醇。

（三）仪器设备分光光度计，离心机，粉碎机，天平，水浴锅，移液管，大试管，烧杯。

三、实验步骤1. 标准曲线绘制取干洁大试管 8 支（ 0 ～ 7 号），依次加入 IAA 系列浓度工作液 2 mL ，分别加入试剂 B 4 mL （或试剂 A 8 mL ），于40 ℃温箱中暗保温 30 min （加速显色反应）；于 530 nm 下比色，以 OD 值为纵坐标，以 IAA 浓度（μg/mL ）为横坐标，绘出一条标准曲线。