高效毛细管电泳法测定吲哚乙酸氧化酶的活力

吲哚乙酸IAA检测方法及氧化酶活性的测定吲哚乙酸IAA检测方法及氧化酶活性的测定一、原理1、吲哚乙酸产品概述:吲哚乙酸可占植物体内吲哚乙酸的50-90%，可能是生长素在植物组织中的一种储藏形式，它们经水解可以产生游离吲哚乙酸。

吲哚乙酸可刺激形成层细胞分裂;吲哚乙酸刺激枝的细胞伸长、抑制根细胞生长;促进木质部、韧皮部细胞分化，促进插条发根、调节愈伤组织的形态建成。

吲哚乙酸在器官和整株水平上，吲哚乙酸从幼苗到果实成熟都起作用。

吲哚乙酸控制幼苗中胚轴伸长的可逆性红光抑制;当吲哚乙酸转移至枝条下侧即产生枝条的向地性;当吲哚乙酸转移至枝条的背光侧即产生枝条的向光性;吲哚乙酸造成顶端优势;延缓叶片衰老;施于叶片的生长素抑制脱落，而施于离层近轴端的生长素促进脱落;吲哚乙酸促进开花，诱导单性果实的发育，延迟果实成熟。

2、试验原理:吲哚乙酸在吲哚乙酸氧化酶的作用下，被氧化破坏失去活性。

植物体内吲哚乙酸氧化酶活力的大小，对调节体内吲哚乙酸的水平，起着重要的作用，而影响植物的生长。

酶活力的大小可以其破坏吲哚乙酸的速度表示之。

吲哚乙酸的含量可用比色法测定。

二、准备仪器及药品T6新悦型分光光度计离心机恒温水浴锅天平研钵试管移液管烧杯20mmol/L磷酸缓冲液，pH6.0(见附表2)。

1mmol/L2，4—二氯酚:称取二氯酚16.3mg用蒸馏水配制成100ml。

1mmol/L氯化锰:称取MnCl?4HO 19.8mg用蒸馏水配制成100ml。

221mmol/L吲哚乙酸:称取IAA 17.5mg用少量乙醇溶解，然后将其倒于盛有约90ml蒸馏水的容量瓶中(100ml)，稀释至刻度。

吲哚乙酸试剂A或B(任备其中之一):试剂A:15ml 0.5mol/L FeCl3，300ml浓硫酸(比重为1.84)，500ml蒸馏水，使用前混合之即成，避光保存。

用时1ml样品中加入试剂4ml。

试剂B:10ml 0.5mol/L FeCl3,500ml 35%过氯酸，使用前混合之即成，避光保存。

毛细管电泳中常用的检测方法毛细管电泳中常用的检测方法毛细管电泳(C E ) 以其高效、快速的分离, 成为一种令人瞩目的分析手段。

为了便于热量散失和进行柱上检$lJ , 采用了极小内径的毛细管(≤50 umi.d.) , 这样允许进样量就很小(10 一9 g )。

如此小的进样量要求有高灵敏的检测方法, 才能进行定性、定量分析。

紫外吸收法：一般, 常用于C E 的检测器是市售的紫外和荧光检测器。

当采用紫外一可见吸收法时, 石英毛细管壁的内涂层常常用有机溶剂溶解或灼烧而刮去, 使出现一个“小窗口” , 作为柱上检测的流通池。

内径很小的毛细管使得流通池的长度也相应很小, 检测灵敏度相当有限, 尤其在生物样品分析中常常需要先行样品预富集然后再检测, 以提高灵敏度。

在使用长方形徽面的毛细管进行电泳分离分析时,柱上检测的光学流通池长度明显增大, 使检测灵敏度提高7 1 5 倍。

采用高能量的光源, 如氨灯、激光等, 可较大地提高检测灵敏度, 但费用较高, 又因可供选择使用的人射光波长范围较窄, 限制了它的应用。

荧光检测法：荧光检测的灵敏度比紫外吸收法高几个数量级。

对于有适当的激发荧光和发射荧光的供试品, 采用激光诱导荧光检测法和光电倍增管, 可使检测灵敏度大大提高, 而对于绝大多数无自然荧光的化合物, 则必须进行柱前或柱后衍生化, 才能进行荧光检测。

间接检测法：对供试品进行衍生化的操作繁琐, 且易引入误差, 对于被测浓度极低的生物样品更是如此。

于是, 间接检测法应运而生。

间接检测就是在电泳缓冲液中加入具有检测响应的检测剂, 如发色团、荧光物质等, 作为本底响应,以产生基线信号。

供试品进样后, 供试品离子与反电荷的检测剂离子形成离子对, 或置换了检测剂的同电荷离子, 分别产生正峰和负峰,使基线信号发生改变而被检测。

在间接荧光法中, 被分析物能吸收荧光辐射或使本底荧光淬灭, 本底信号因此降低或消失而进行检测。

这种方法要求供试品必须能吸收荧光或淬灭荧光。

吲哚乙酸氧化酶检测试剂盒（IAA比色法）吲哚乙酸氧化酶检测试剂盒(IAA比色法)简介：植物体内生长素的种类很多，其中吲哚乙酸(IAA)是植物体内普遍存在的一种生长素，植物体内IAA的含量，对于植物的生长、发育、衰老、脱落等均有重要意义。

植物体内存在吲哚乙酸氧化酶(Indoleacetic acid oxida-se)，该酶是植物体内一种氧化分解吲哚乙酸的酶，吲哚乙酸氧化酶能够氧化IAA使其失去活性，从而调节体内IAA的水平，影响植物的生长。

Leagene吲哚乙酸氧化酶检测试剂盒(IAA比色法)检测原理是吲哚乙酸在吲哚乙酸氧化酶作用下形成吲哚醛，使体系中吲哚乙酸含量减少，剩余的吲哚乙酸在无机酸存在下与FeCl3作用生成红色螯合物，吲哚乙酸氧化酶活性的大小可以用其破坏吲哚乙酸的速度表示。

通过比色法(分光光度计)测定吸光度，根据对照与待测样品中吲哚乙酸含量的差值，计算出吲哚乙酸氧化酶活性水平。

该试剂盒主要用于检测植物样本、血清等中吲哚乙酸氧化酶活性，尤其适用于定量测定植物样本吲哚乙酸氧化酶活性。

该试剂盒仅用于科研领域，不宜用于临床诊断或其他用途。

组成：自备材料：1、恒温箱或水浴锅2、研钵或匀浆器3、离心管或试管4、低温离心机5、浓硫酸6、比色杯7、分光光度计操作步骤(仅供参考)：编号名称TE051350TStorage试剂(A):IAA标准(200μg/ml)25ml4℃避光试剂(B):IAA Lysis buffer250ml RT试剂(C):IAA Assay buffer60ml4℃避光使用说明书1份1、准备样品：①植物样品：将大豆或绿豆等种子置于30℃中避光萌发3-4天，选取生长一致的幼苗，除去子叶和根，留下胚轴作为材料。

取胚轴，称重，按每100mg加入适量预冷的IAA Lysis buffer的比例，冰浴情况下充分匀浆或研磨。

离心,留取上清液即为吲哚乙酸氧化酶粗提液。

短期4℃保存待用。

②血浆、血清和尿液样品：血浆、血清按照常规方法制备后可以直接用于本试剂盒的测定，保存，用于吲哚乙酸氧化酶的检测。

实验26吲哚乙酸含量与吲哚乙酸氧化酶活性的测定植物体内生长素的种类很多，其中吲哚乙酸（ 1AA ）是植物体内普遍存在的一种生长素。

于不同的生育期测定不同器官中 IAA 的含量以及 IAA 氧化酶的活性，对于研究植物的生长、发育、衰老、脱落等均有重要意义。

Ⅰ 吲哚乙酸含量的测定一、原理1947 年，我国植物生理学家汤玉玮等发现，在无机酸存在下，吲哚乙酸能与 FeCl 3 作用，生成红色的鳌合物。

该物质在 530 nm 有最大吸收峰，由此引出 IAA 的比色定量测定，此法可测出μg 量级的 IAA 。

二、实验材料、试剂与仪器设备（一）实验材料玉米种子。

（二）试剂1. IAA 标准溶液：精确称取 IAA （ A.R. ） 10 mg ，先用少量乙醇溶解，后用蒸馏水定容至 100 mL （其浓度为 100 μg/mL ）作为贮备液；然后用贮备液配成 0 （空白）、 0.5 、 1.0 、 5.0 、10.0 、 15.0 、 20.0 、 25.0 μg/mL 的系列浓度标准溶液，作为工作液（现用现配）。

2. 试剂 A ：内含 0.5 mol/L FeCl 3 溶液 15 mL 、浓 H 2 SO 4 （比重 1.84 ） 300 mL 、蒸馏水 500 mL ，于使用前混合摇匀，避光保存， l mL 试液需加此试剂 4 mL 。

3. 试剂 B ：内含 0.5 mol/L FeCl 3 溶液 10 mL 、 35 ％高氯酸 500 mL ，于使用前混合摇匀，避光保存， l mL 试液应加此试剂 2 mL 。

试剂 A 与试剂 B 可任选一种（试剂 B 比试剂 A 灵敏）。

4. 0.1 mol/L NaOH 溶液。

5. 甲醇。

（三）仪器设备分光光度计，离心机，粉碎机，天平，水浴锅，移液管，大试管，烧杯。

三、实验步骤1. 标准曲线绘制取干洁大试管 8 支（ 0 ～ 7 号），依次加入 IAA 系列浓度工作液 2 mL ，分别加入试剂 B 4 mL （或试剂 A 8 mL ），于40 ℃温箱中暗保温 30 min （加速显色反应）；于 530 nm 下比色，以 OD 值为纵坐标，以 IAA 浓度（μg/mL ）为横坐标，绘出一条标准曲线。

高效毛细管电泳法测定有毒生物碱复旦大学药学院仲艳生物碱(alkaloids)是植物中一类重要的化学成分，大多具有生理活性，往往是许多药用植物的主要有效成分。

对于含有一些毒性较大的生物碱类的中草药，由于剂量不当或者炮制方法有误而导致中毒的情况时有发生。

目前国内外的文献报道主要集中于一种植物来源有毒生物碱的研究上，对于一次操作筛选包含几种植物来源的有毒生物碱的分析方法未见有报道。

高效毛细管电泳(HPCE)[1-3]是近年来迅速发展起来的新的分析技术，与目前常用的气相色谱法(GC)，气质联用法(GC-MS)和高效液相色谱法(HPLC)等方法相比，具有高效、快速、低成本、易操作、样品量少等特点，近年来在医学、药学、生化等领域得到了较快的发展和广泛的应用。

在20世纪90年代，CE技术被引入司法领域，用来分离了包括海洛因在内的18种违禁和管制药品。

随着这一技术的推广应用，CE已成为毒物检测中的热点。

本研究以此为切入点，用毛细管区带电泳-紫外检测(CZE-UV)系统分析了检材中常见的几种有毒生物碱。

这一通用性的方法，大大提高未知毒物的分析速度，可作为有毒生物碱初筛的方法。

1 实验部分1.1仪器与药品Beckman P/ACE MDQ毛细管电泳仪(美国Beckman公司)；未涂层石英毛细管柱(75μm×50.2cm，有效分离长度为40cm，Beckman公司)；Oasis HLB柱(1mL/30mg，Waters公司)；旋涡混合器 XW-80A；电热恒温水浴锅。

样品：乌头碱(Aconitine)、次乌头碱(Hypaconitine)、新乌头碱(Mesaconitine)、高乌甲素(Lappaconitine)、雪上一枝蒿甲素(Bullatine A)、硫酸阿托品(Atropine Sulfate)、溴甲阿托品(Atropine Methobromide)、氢溴酸东莨菪碱(Scopolamine Hydrobromide)、氢溴酸山莨菪碱(Anisodamine Hydrobromide)、茶碱(Theophylline)、马钱子碱(Brucine)、士的宁(Strychnine)、硫酸奎宁(Quinine Sulfate)、氯喹(Chloroquine)。