玻璃化冷冻技术的研究进展

关键词 玻璃化冷冻 冷冻保护剂 辅助生殖技术 卵母细胞 胚胎 卵巢
目前，低温冷冻技术在辅助生殖领域应用广 泛，主要包括慢速冷冻（ＳＦＭ）和玻璃化冷冻。玻璃化 冷冻技术是利用体积微小的冷冻承载工具，在极快 速降温（＞２ ０００℃／ｍｉｎ）过程中，使高浓度的冷冻保 护液由液态转变为黏度很高的类似玻璃样的固态， 避免细胞内冰晶的形成，达到冷冻保护的作用，从 而显著提高细胞 ／组织冷冻后的存活力和发育能 力。其与 ＳＦＭ 相比具有明显优势，主要体现在：①无 冰晶形成，对细胞或组织冻融过程损伤小。②操作简 单，耗时短，费用低。③冻融效果好，存活率高。迄今 为止，利用玻璃化冷冻技术对人未成熟卵母细胞［１］、 成熟卵母细胞［２］、卵裂期胚胎［３］及囊胚［４］进行冷冻均 已有成功报道。综述玻璃化冷冻技术主要影响因素 及其应用。
玻璃化冷冻技术的研究进展
黑龙江中医药大学附属第一医院妇产科（１５００４０） 丛 晶综述 吴效科审校
摘 要 玻璃化冷冻技术是一种快速冷冻细胞或组织的方法，随着辅助生殖技术的发展而受到广泛关注。该项 技术具有冷冻速度快、冻融损伤小，操作简单等优点，能够提高冷冻复苏后的存活率和妊娠成功率。玻璃化冷冻技术 在临床应用中主要受到冷冻保护剂的类型和浓度、冷冻温度、冷冻速度及冷冻承载工具等一系列因素的影响。由于冷 冻对象的不同，所实施的具体方法也不尽相同。该技术目前尚未成熟，如何优化人卵母细胞、胚胎及卵巢组织的玻璃 化冷冻方案仍需要进行深入的研究。
二、冷冻承载工具 提高降温速率和增加 ＣＰＡ 浓度是玻璃化技术 发挥优势的两个密切相关的条件。前者能瞬间跨越 损伤卵母细胞或组织的敏感温度区域，避免冰晶形 成；后者可提高冷冻效率。然而在实际操作中，要达 到预期的冷冻速率并不容易。在细胞玻璃化过程中 因受生理因素限制，ＣＰＡ 浓度不能过高，否则会产 生较大毒性。因此，克服以上两个难题的关键之一 就是选择适当的冷冻承载工具。目前使用的玻璃化 冷冻工具主要包括：普通麦管（Ｓｔｒａｗ）、开放式拉细 麦管（ＯＰＳ）、封闭式拉细麦管（ＣＰＳ）、电子显微镜铜 网（ＥＭＧ）及 Ｃｒｙｏｌｏｏｐ，Ｃｒｙｏｔｏｐ 和 ＭＶＣ［２］等。其目的 就是为了使承载体积更小，有效减少冷冻液体积， 快速达到玻璃化效果，从而降低冷冻液的毒性和渗 透压效应。Ｋｙｏｎｏ 等［７］利用 Ｃｒｙｏｔｏｐ 玻璃化冷冻方法 低温冻存人成熟卵母细胞，经胞浆内单精子注射－胚 胎移植（ＩＣＳＩ－ＥＴ）技术成功降生一健康男婴。也曾 用此方法和麦管慢速冷冻技术 （Ｓｔｒａｗ－ＳＦＭ）作比 较，存活率分别是 １００％（１７ ／１７）和 ８２．２％（６０ ／７３）。 Ｋｕｗａｙａｍａ 等［８］分别用 ＩＳＤ（ｉｎ－ｓｔｒａｗ ｄｉｌｕｔｉｏｎ）、ＯＰＳ 和 Ｃｒｙｔｏｐ 进行牛 ＭⅡ期卵母细胞的玻璃化冷冻。比较 结果发现，Ｃｒｙｔｏｐ 冻存效果最好，随后将此方法应用 到人 ＭⅡ卵母细胞的玻璃化。冻融后有 ９１％的卵母 细胞表现出正常形态，经 ＩＣＳＩ 得到 ８１％的受精率， ５０％发育到囊胚阶段。利用荧光原位杂交对 ５ 枚囊 胚分析，结果都为正常的双倍体胚胎。经过 ＥＴ，获得 较为满意的妊娠率和出生率。此外，ＯＰＳ 及 ＥＭＧ 玻 璃化冷冻对人卵母细胞和囊胚的冻存效果也较为
突出［９］。 人卵母细胞的玻璃化冷冻
相对较成熟的胚胎冷冻技术，卵母细胞冻存技 术进展较缓慢，只在意大利、德国、美国段，卵母细 胞的冷冻保存方法仍主要采用 ＳＦＭ，但由于在冷冻 过程中易形成冰晶对卵母细胞造成冷冻损伤，因而 临床结果并不理想。目前，玻璃化冷冻卵母细胞已有 获得妊娠的成功案例报道［１０］。
人成熟卵母细胞处于减数分裂的 ＭⅡ期，细胞 体积大，表面积与体积比值小，水分进出细胞膜的速 度慢，在冻融过程中极易受到细胞内外冰晶形成造 成的可逆和不可逆损伤，如皮质颗粒提前发生胞 吐，透明带变硬，纺锤体微管解聚，染色体排列异常 等［２，１１］。这些生理变化直接导致卵母细胞冻融后存 活率和受精率下降，也是卵母细胞冷冻保存技术发 展缓慢的主要原因。玻璃化冷冻对复苏后 ＭⅡ期卵母 细胞纺锤体形态和染色质排列并无明显的影响。研 究发现，卵母细胞快速解冻后，β－微管解聚，染色质 仍在赤道板浓缩。２ ｈ 后，β－微管重新聚集，纺锤体形 态正常［７］。Ａｎｔｉｎｏｒｉ 等［１２］使用 １５％ＥＧ，１５％ＤＭＳＯ，加 ０．５ ｍｏｌ ／Ｌ 蔗糖及 Ｃｒｙｏｔｏｐ 做玻璃化冷冻，解冻 ３３０ 枚 卵子，其存活率、受精率和妊娠率分别为 ９９．４％， ９２．９％和 ３２．５％。目前，很多研究均采用 Ｃｒｙｏｔｏｐ 做人 卵母细胞玻璃化冷冻［２，１０，１２－１３］，取得较为满意的结果。 因为该技术可使承载卵母细胞的玻璃化溶液终体积 低于 １ μＬ，冷冻速率达到－２３ ０００℃／ｍｉｎ，避免了冰 晶形成，而且可将渗透性 ＣＰＡ 的浓度降低 ３０％，极 大地减弱了毒性效应，最终使解冻后的卵子具有较 高的存活率、受精率和妊娠率。此外，Ｃｒｙｏｔｏｐ 玻璃化 冷冻卵母细胞似乎也不影响减数分裂中纺锤体和染 色体的排列，避免发生基因异常现象［１３］。
ＩＩ ｈｕｍａｎ ｏｏｃｙｔｅｓ ｅｆｆｅｃｔｓ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ： ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｃｏｍｐｅｔｅｎｃｅ［Ｊ］． Ｈｕｍ Ｒｅｐｒｏｄ， ２００４， １９（８）：１８６１－１８６６． ［１８］Ｂｏｌｄｔ Ｊ， Ｔｉｄｓｗｅｌｌ Ｎ， Ｓａｙｅｒｓ Ａ， ｅｔ ａｌ． Ｈｕｍａｎ ｏｏｃｙｔｅ ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ： ５－ｙｅａｒ ｅｘｐｅｒｉｅｎｃｅ ｗｉｔｈ ａ ｓｏｄｉｕｍ－ｄｅｐｌｅｔｅｄ ｓｌｏｗ ｆｒｅｅｚｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ［Ｊ］． Ｒｅｐｒｏｄ Ｂｉｏｍｅｄ Ｏｎｌｉｎｅ， ２００６， １３（１）：９６－１００． ［１９］ＭｏｒａｔóＲ， Ｉｚｑｕｉｅｒｄｏ Ｄ， Ａｌｂａｒｒａｃíｎ ＪＬ， ｅｔ ａｌ． Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｐｒｅ－ｔｒｅａｔｉｎｇ ｉｎ ｖｉｔｒｏ－ｍａｔｕｒｅｄ ｂｏｖｉｎｅ ｏｏｃｙｔｅｓ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎ ｓｔａｂｉｌｉｚｉｎｇ ａｇｅｎｔ ｔａｘｏｌ ｐｒｉｏｒ ｔｏ ｖｉｔｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ［Ｊ］． Ｍｏｌ Ｒｅｐｒｏｄ Ｄｅｖ， ２００８， ７５（１）：１９１－２０１． ［２０］Ｋｕｗａｙａｍａ Ｍ． Ｈｉｇｈｌｙ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｖｉｔｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｏｏｃｙｔｅｓ ａｎｄ ｅｍｂｒｙｏｓ： ｔｈｅ Ｃｒｙｏｔｏｐ ｍｅｔｈｏｄ［Ｊ］． Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ， ２００７， ６７（１）：７３－８０．
国际生殖健康 ／计划生育杂志 ２００８ 年 ５ 月第 ２７ 卷第 ３ 期 Ｊ Ｉｎｔ Ｒｅｐｒｏｄ Ｈｅａｌｔｈ7Ｆａｍ Ｐｌａｎ， Ｍａｙ． ２００８， Ｖｏｌ． ２７， Ｎｏ． ３
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ａｎｄ ｔｈｅ ｔｙｐｅ ｏｆ ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ ａｄｖｅｒｓｅｌｙ ａｆｆｅｃｔ ｍｏｕｓｅ ｏｏｃｙｔｅ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ［Ｊ］． Ｈｕｍ Ｒｅｐｒｏｄ， ２００７， ２２（１）：２５０－２５９． ［１４］Ｌａｒｍａｎ ＭＧ， Ｓｈｅｅｈａｎ ＣＢ， Ｇａｒｄｎｅｒ ＤＫ． Ｃａｌｃｉｕｍ－ｆｒｅｅ ｖｉｔｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｒｅｄｕｃｅｓ ｃｒｙｏｐｒｏｔｅｃｔａｎｔ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｚｏｎａ ｐｅｌｌｕｃｉｄａ ｈａｒｄｅｎｉｎｇ ａｎｄ ｉｎｃｒｅａｓｅｓ ｆｅｒｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｒａｔｅｓ ｉｎ ｍｏｕｓｅ ｏｏｃｙｔｅｓ［Ｊ］． Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ， ２００６， １３１（１）：５３－６１． ［１５］Ｌａｎｅ Ｍ， Ｍａｙｂａｃｈ ＪＭ， Ｇａｒｄｎｅｒ ＤＫ． Ａｄｄｉｔｉｏｎ ｏｆ ａｓｃｏｒｂａｔｅ ｄｕｒｉｎｇ ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｔ ｅｍｂｒｙｏ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ［Ｊ］． Ｈｕｍ Ｒｅｐｒｏｄ， ２００２， １７（１０）：２６８６－２６９３． ［１６］Ｇｈｅｔｌｅｒ Ｙ， Ｓｋｕｔｅｌｓｋｙ Ｅ， Ｂｅｎ Ｎｕｎ Ｉ， ｅｔ ａｌ． Ｈｕｍａｎ ｏｏｃｙｔｅ ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｆａｔｅ ｏｆ ｃｏｒｔｉｃａｌ ｇｒａｎｕｌｅｓ［Ｊ］． Ｆｅｒｔｉｌ Ｓｔｅｒｉｌ， ２００６， ８６（１）：２１０－２１６． ［１７］Ｊｏｎｅｓ Ａ， Ｖａｎ Ｂｌｅｒｋｏｍ Ｊ， Ｄａｖｉｓ Ｐ， ｅｔ ａｌ． Ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｅｔａｐｈａｓｅ
不同的渗透性 ＣＰＡ 影响细胞膜的渗透性，这不 仅与各自的化学特性和温度有关，而且针对不同物 种的细胞以及发育阶段不同的细胞，ＣＰＡ 的作用也 有很大不同。研究发现，ＧＶ 期卵母细胞的玻璃化冷
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国际生殖健康 ／计划生育杂志 ２００８ 年 ５ 月第 ２７ 卷第 ３ 期 Ｊ Ｉｎｔ Ｒｅｐｒｏｄ Ｈｅａｌｔｈ7Ｆａｍ Ｐｌａｎ， Ｍａｙ． ２００８， Ｖｏｌ． ２７， Ｎｏ． ３
收稿日期：２００７－０７－０２ 修回日期：２００７－１１－１２
细胞和组织免受冷冻损伤。但由于玻璃化冷冻方法 需要较高浓度的 ＣＰＡ，易使细胞发生毒性效应和渗 透性休克，因此 ＣＰＡ 的选择及其使用的优化是玻璃 化技术应用的关键。比较常用的 ＣＰＡ 主要有 ２ 种： ①渗透性 ＣＰＡ：二甲基亚砜（ＤＭＳＯ），乙二醇（ＥＧ）， １，２－丙二醇（ＰＲＯＨ）等。②非渗透性 ＣＰＡ：蔗糖，海藻 糖，聚蔗糖（Ｆｉｃｏｌｌ），聚乙二醇（ＰＥＧ），聚乙烯吡咯烷 酮（ＰＶＰ）等。渗透性 ＣＰＡ 的作用是通过降低冰点， 取代细胞内蛋白、ＤＮＡ 和其他成分周围的水分，减 少或避免细胞内冰晶形成。非渗透性 ＣＰＡ 有利于改 善保护液的玻璃化性质，提高冷冻保护效果，也能够 通过渗透效应促进细胞脱水，稳定细胞膜，降低达到 玻璃化本身所需要的 ＣＰＡ 的用量，从而减小玻璃化 溶液的毒性。大量研究证实，玻璃化冷冻液中添加多 种渗透性 ＣＰＡ（如 ＥＧ 和 ＤＭＳＯ），以及不同类型和 比例的非渗透性 ＣＰＡ（如蔗糖、聚蔗糖等）对细胞和 组织进行玻璃化冻存的效果更好，对其解冻后的形 态和存活率无影响。一般情况下，玻璃化溶液中含有 的渗透性 ＣＰＡ 浓度大于 ３０％，非渗透性 ＣＰＡ 蔗糖 浓度通常在 ０．１～１ ｍｏｌ ／Ｌ［６］。