玻璃化冷冻

玻璃化冷冻液为VSI ( TCM199+HEPES+10%FCS+ 10%DMSO + l0%EG)和VSⅡ(TCM199+HEPES+20%FCS+20%DMSO+20%EG+0.5MSUCROSE)。

各种冷冻保护剂均具有保护作用，但效果不一样，甘油的效果较差，EG相对较好。

人卵母细胞在室温放置30 min，纺锤体就完全解聚，复温后仅25%一50%可恢复纺锤体结构，牛体外成熟卵母细胞在4℃保持10-20 min，纺锤体可完全解聚，而猪卵母细胞在4℃仅5 min，就会发生部分或完全解聚。

玻璃化冷冻和解冻冷冻：室温下将卵子在PBS+20％FCS(S)中冲洗2～3次后移入10％乙二醇(EG)+10％二甲基亚砜(DMSO)中停留30 s，然后移入20％EG十20％DMSO+0．5 mol／L糖中，用细麦管通过虹吸作用将卵吸入管中，投入液氮。

解冻：在室温下依次将卵子移入含0．4 mol／L糖、0．2 mol／I．糖、0．1 mol／L糖的S及s中，各停留3 min，再于37。

C中停留5 min，最后移入MEM中，准备体外培养成熟(IVM)当进人渗透压梯度较大的高渗溶液时，卵母细胞和卵丘细胞都大幅度收缩，造成二者牵拉、损伤，破坏了胞间连接。

比较了DPBS和TCM199对冷冻保护效果的影响，试验结果表明，二者在冷冻保护效果上无显著差异。

冷冻损伤包括两个因素:一是胞内冰晶造成的机械损伤;二是细胞在高浓度冷冻保护液中暴露时间过长造成的溶质损伤。

这些损伤的发生多在15℃和一5℃间的温度范围。

玻璃化冷冻胚胎的处理过程是影响玻璃化冷冻效果的重要因素。

冷冻前，先用预热到37 ℃, 1 M的DMSO预先处理胚胎5 min，可以使保护剂充分渗透到细胞内，并且因为保护剂浓度较低所以对胚胎产生的毒性作用小。

玻璃化溶液使用DAP213 (DMSO+丙二醇+乙酞胺)，其中DMSO为主要低温保护剂，促进渗透;丙二醇强化玻璃化形成能力;乙酞胺是毒性中和剂，降低了毒性作用。

玻璃化深低温冷冻保存气管的实验研究的开题报告
一、选题背景
气管疾病是临床常见疾病之一，在治疗过程中需要进行气管切除手术。

而切除术后的气管需要进行保存，以备后续移植使用。

传统的保存方法往往会对气管组织的质
量造成影响，因此需要研究更优异的保存方法。

二、研究目的
本研究旨在探索玻璃化深低温冷冻保存气管的方法，并评估保存后气管的生物学特性，为气管切除手术后的保存提供新的方法。

三、研究意义
当前气管保存方法一般采用传统的液氮冷冻，会对气管组织造成一定程度的损伤。

而本研究提出的玻璃化深低温冷冻保存方法能够有效地降低保存过程中冷冻所致的冻
结损伤，且保存后的气管在生物学特性上表现良好，可为气管切除手术后的保存提供
更优异的方法。

四、研究内容和步骤
1. 采集人或动物气管组织，对气管进行体外冷冻。

2. 将气管组织分为两组，一组进行传统液氮低温冷冻保存，另一组进行玻璃化深低温冷冻保存。

3. 评估两组保存后的气管组织的组织学结构、生化特性等指标，并进行对比分析。

五、预期结果
本研究预期将比较玻璃化深低温保存气管和传统方法保存气管的差异，验证玻璃化深低温保存气管的可靠性，并探索不同保存方法对气管组织的影响，为气管切除后
的保存提供参考。

六、研究难点
本研究难点主要在于探索出一种对气管组织影响较小的保存方法，并在保存后对气管组织的生物学特性进行全面的评估和对比分析。

玻璃化在食品加工中的应用1. 玻璃化技术简介玻璃化是将物料在高温下加热至熔点以上并迅速冷却，以产生具有玻璃状态特征的过程。

这种技术经常用于食品加工上，可改善食品的保质期、口感、颜色、味道等方面。

2. 玻璃化在冷藏冷冻食品中的应用冷藏冷冻食品的保质期较短，使用玻璃化可以将食品中的水分迅速冷凝成微小颗粒，使得其不能转化为冰晶，从而避免食品冻结所带来的负面效应。

使用这种技术可以延长冷藏冷冻食品的保质期并保持其质量。

3. 玻璃化在干果和坚果中的应用干果和坚果中含有许多油脂，而油脂在加热后容易氧化并变质。

使用玻璃化技术可以将水分和油脂分离，从而避免松脆度下降和口感变质。

这种技术能够使得干果和坚果保持其优质口感并延长其保质期。

4. 玻璃化在肉类和海鲜中的应用肉类和海鲜中含有大量水分，容易导致营养成分流失，并且容易腐败。

使用玻璃化技术可以将水分转化为微小颗粒，避免水分的流失和导致腐败。

同时，这种技术还可以改善食品的口感和质地，使得食品更加美味。

5. 玻璃化在糕点和糖果中的应用糕点和糖果中往往含有大量的糖分，这些糖分容易受潮而导致粘连。

使用玻璃化技术可以将水分转化为微小颗粒，避免糖分的潮湿和降低其黏性。

同时，这种技术还可以改善糕点和糖果的外观和口感，使其更加美味。

6. 总结玻璃化技术在食品加工中具有重要的应用价值。

通过玻璃化技术，可以改善食品的口感、质感、颜色和保质期等方面，从而提高食品的品质和市场竞争力。

未来，玻璃化技术将进一步推广和应用于食品加工行业，为消费者提供更加高品质的食品。

卵母细胞和胚胎玻璃化解冻方法用途：本品用于卵母细胞和胚胎的玻璃化解冻配套。

安全解冻配套：1.1瓶4ml解冻液（TS）2.1瓶1.5ml稀释液(DS)3.1瓶1.5ml 冲洗液(WS)4.1个25mm 的培养皿(用于解冻液)5.1个6孔生殖板使用说明准备：*用载体和生殖板将解冻液放到37℃的培养箱里加温—将所有解冻液倒入生殖板里。

*用微细管吸取DS,WS1和WS2各300ul，放进培养皿。

注意：用巴斯德管吸取一个大小合适的卵母细胞（直径：140um）或者胚胎(直径：140-180um)解冻：1.迅速地将载体顶放进解冻液中，浸泡1分钟。

（图一）2.用巴斯德管吸取卵母细胞（胚胎），轻轻地将其放入DS底部，浸泡3分钟。

（图二）3.用巴斯德管吸起卵母细胞（胚胎），轻轻地将其放入WS1 底部，浸泡5分钟。

（图三）4.用巴斯德管吸起卵母细胞（胚胎），轻轻地将其放入WS2 顶部，当卵母细胞（胚胎）自动沉到底部的时候，重新再重复这一步骤。

（图四）5.将卵母细胞（胚胎）转移到装有合适培养液的培养皿中。

放进37℃的培养箱中完成恢复。

注意：卵母细胞要放置2小时，胚胎则要3小时。

质量控制测试：每一批安全解冻配套都得到以下测试：*溶液：UPS不孕不育无菌测试（SAL 10-3）LAL拉尔内毒素测试小老鼠胚胎试验（一个细胞）保存方法：*保存于4-8℃*在标签所示有效日期前，本品性质稳定。

成分：*血清替代补充*基本培养基M-199 内含的HEPES*蔗糖参考文件（此部分请看原件）.玻璃化第一部分：所需材料*玻璃化配套No.0 基础液（BS）：1.5ml x1 (只用于卵母细胞玻璃化冷冻)No.1 稀释液（ES）: 1.5ml x1No.2 玻璃化溶液（VS）: 1.5ml x2*冷冻管x4, 建议每个冷冻管最多储存3个卵母细胞或者3个胚胎*复制板x2: 6孔*冷却架(蓝盒液氮，型号：VT-CLB)*巴斯德管（型号：MT-150）*显微镜（关掉加热板）*秒表或计算器（带计算功能）*液氮（消毒过滤功能，聚四氟乙烯滤膜过滤）*镊子*显微针x2: 2-20ul, 100-1000 ul*罐子*储存罐注意：使用的巴斯德管大小要与卵母细胞或胚胎大小合适。

玻璃化冷冻技术名词解释
玻璃化冷冻技术是一种用于将食物或其他物品冷冻保存的技术。

它涉及将食物或物品迅速冷冻到极低的温度，以使其成为类似玻璃状的状态，从而防止冰晶的形成和物品的结晶化。

这种技术可以延长食物的保质期，并且可以在冷冻后保持食物原有的质地、口感和营养成分。

玻璃化冷冻技术的原理是在极低温下将物品迅速冷冻，使得其水分在冷冻过程中成为非晶态状态，而不是结晶状态。

这样可以避免冰晶的形成，从而减少对食物细胞结构的破坏，同时也减少了食物在解冻后的水分流失。

此外，玻璃化冷冻技术还可以应用于生物样品的保存和冷冻。

例如，利用这种技术可以有效冷冻保存细胞、组织和生物样品，以便后续的实验和研究。

这种冷冻技术在生物医学研究和医学应用领域具有重要的意义。

试管婴儿人类配子胚胎与性腺常见的冷冻方法在辅助生育技术中，最常见的是程序化慢速冷冻法，其次是玻璃化冷冻，较少用的是超快速冷冻，后两者都属于快速冷冻的范畴。

冷冻技术在不同的IVF中心有或多或少的变化，但不同的方法都可获得较好的结局。

这表明冷冻标本可以耐受一定的外界变化，只要这种变化是在细胞可以承受的范围，则细胞可以存活，发育潜能可以维持。

(一)程序化慢速冷冻法通常在程序化慢冷的液体中，各含有一种细胞渗透性冷冻保护剂和一种非细胞渗透性保护剂，于室温下，在低浓度的冷冻保护剂溶液中预平衡，然后放置在终浓度的冷冻液中。

在冷冻仪(图13–2)内于预设的程序下降温标本，经过冷冻保护剂的处理后，胞内渗透压增高，意味着细胞内液冰点下降。

由于细胞自身的特性，它在细胞内外电解质平衡时，胞内液冰点比胞外低。

程序冷冻仪图13–1程序冷冻仪图13–2在室温到植冰点之间降温，往往冰晶还未来得及形成，但此期可以发生温度休克。

温度休克al shock)是指某些细胞在降温过快时受到损伤，甚至在冷冻过程中被破坏的一种表现。

其特点是与温度变化速率有关，常发生在15℃一一5℃降温过程之间。

这可能是由于细胞膜脂类的相变，膜受损后渗透率改变；或在不同的热收缩应激反应时，细胞膜结构的断裂引起的。

卵磷脂被认为有保护作用。

冷冻液通常在达到诸如一15℃的温度而冰晶尚未形成，即处于超冷状态。

为了避免过冷状态的发展，使每一个溶液在一个特定的温度时开始冻结，使细胞脱水逐步顺利地进行，及为了控制过冷生物样品中过度大冰晶的形成作用，可通过两种方法来诱发结晶：一是向液体中加入微量冰晶，较少采。

二是较常用的植冰(seeding)：用预冷至一70℃，或更低温度的金属棒在标本溶液冰点以下2–3℃时，瞬间地接触样品容器，可以带走大量水在液相转化为固相的潜伏热，这样可以激发和协助溶液中许多小冰晶的形成。

辅助生殖中常采用的植冰温度是一6℃一– 8℃。

目前，人工植冰比冷冻仪自动植冰可靠，用冷冻过的金属镊接触的部位应避免标本刚好所在位置，以免将样品迅速降温至细胞内冰晶形成而致死，一旦看到细胞外溶液中有一个白点样的小冰晶出现，提示溶液中已有大量冰核形成，即应立刻移开金属镊，将冷冻管放回冷冻仪，数秒钟后如再次拿出冷冻管观察，则标本溶液呈白色云雾状，提示溶液中已有大量小冰品形成，提示植冰成功。

玻璃化冷冻法
基本原理是将高浓度的冷冻保护剂在超低温环境下凝固，形成不规则
的玻璃化样固体，保存了液态时正常分子和离子分布，因而在细胞内发生
玻璃化时能起到保护作用。

所保存细胞在冷冻保护液中脱水到一定程度后，则引起内源性胞质大分子如蛋白质及渗透到胞内的冷冻保护剂浓缩，从而
使细胞在剧烈的快速降温中得到保护。

人类的配子和胚胎的冷冻保存已经是人工生殖领域中一个必要的部分。

在过去这二十年中，冷冻保存技术的发展亦可反映人工生殖技术的发展程度，现在的冷冻技术已可用在冷冻保存精子、卵子和不同时期的胚胎，尤
其是玻璃化冷冻技术(Vitrification)，其不仅已获得医学界广泛的认可，并渐渐取代传统慢术冷冻法，而成为冷冻技术的最佳选择，甚而将此技术
运用在高难度的卵子、卵巢组织和人类胚胎干细胞的冷冻上。

有别於慢速冷冻法在降温的冷冻过程中会形成冰晶，进而造成胚胎的
伤害，玻璃化冷冻技术的特色就是使细胞本身及冷冻溶液在冷冻时，呈现
黏稠而不产生结晶的玻璃化状态，利用这种不结冰的原理以改善慢速冷冻
之缺点。

换言之，胚胎的冷冻保存与解冻的成败与否，不单是胚胎品质的
好坏，同时必须靠冷冻保存中有无一个完全无结冰生成的冷冻过程。

而玻
璃化冷冻其高浓度冷冻保护剂和细胞间经一定时间平衡後，细胞体积可因
脱水而减少30-50%，然後将之置入冷冻器材，再直接投入液态氮中使细胞
瞬间玻璃化，在无冰晶形成下保存，以减少细胞内结冰造成伤害。

玻璃化冷冻操作说明
1、冷冻载架和载杆做好标记
2、试剂从冰箱内拿出后室温平衡半小时使用。

3、用移液枪加70-100ul BS、ES、VS液体各一滴。

4、吸胚胎与BS中轻轻洗涤3-5次，转移到ES中。

5、胚胎在ES中1-2分钟，让胚胎自由沉到液滴底部。

6、轻轻转移胚胎的位置2次。

7、胚胎在ES中5分钟后，吸胚胎到VS中。

8、胚胎在VS中15-20秒后，吸胚胎轻轻吹吸5次左右，
轻轻的将胚胎放在载杆上，至于液氮中，从胚胎置于
VS的时间到置于液氮中，时间控制在1分钟左右，不超过1分半钟。

玻璃化解冻操作说明
1、解冻1液置于37培养箱中平衡30分钟，解冻
2、
3、4
液室温平衡30分钟。

2、找到解冻胚胎的载杆，甩一下液氮，轻轻但迅速的置于
解冻1液中1分钟。

3、胚胎在解冻2液中3分钟，中间不需要移动胚胎。

4、胚胎在解冻3液中3分钟，中间不需要移动胚胎。

5、胚胎在解冻4也中6分钟，中间轻轻转换位置3次。

6、将胚胎轻轻转移到培养液中。

玻璃化冷冻
1、玻璃冷冻原理：采用了更高浓度的冷冻保护剂处理细胞，快速降温使细胞内外液体均达到玻璃化状态。

2、玻璃冷冻分两步骤：将胚胎放入较低浓度冷冻保护剂中平衡，此过程我们可以看到细胞体积先缩小然后又重新扩大的变化。

然后将胚胎置入含较高浓度冷冻保护剂短暂平衡后，投入液氮。

3、冷冻保护剂可分为渗透性保护剂（细胞内冷冻保护剂）和非渗透性保护剂（细胞外冷冻保护剂）。

4、溶质效应：细胞外水溶液渗透压的升高会对细胞造成损伤。

5、渗透性休克：如果将胚胎直接置于相当于人体组织液渗透压的培养液中，细胞外的水分将快速进入细胞，而细胞内冷冻保护剂渗出细胞外的速度远比不上水进入细胞的速度，将造成细胞体积急剧增大甚至破裂，这种损伤称为渗透性休克。

胚胎冷冻方法包括：
1、程序冷冻法：也称平衡冷冻法，是将胚胎放入冷冻液中，慢速降温至一个较低的温度，约在-35℃到-80℃的阶段，然后将它放入液氮中，是早期冷冻时主要采用的一种方法，但程序冷冻的降温过程较长，其中胚胎细胞内的水分易在此过程中形成冰晶，在解冻复温时也有形成冰晶的风险，冰晶会机械性损伤细胞膜和细胞器的膜结构，挤压细胞的骨架，对胚胎造成冷冻损伤，因此在程序冷冻过程中，细胞受到损伤的程度较大，复苏率约在70%；
2、玻璃化冷冻：近20年在程序冷冻的基础上又进一步突破，出现了新的冷冻方法，称为玻璃化冷冻，此方法主要是采用更高浓度及极其黏稠的冷冻保护剂处理胚胎，使胚胎在冷冻的过程中，从生理温度急速降温到-196℃，胚胎细胞内外液体瞬间冻结成玻璃化固体状态。

与程序冷冻法相比，玻璃化方法冷冻过程中，胚胎细胞内的液体不会形成冰晶，从而避免了冰晶对胚胎细胞的物理化学损伤，获得了较好的冷冻效果，玻璃化冷冻胚胎复苏率通常达到95%以上，若冷冻囊胚，效果则更好，复苏率可达到99%以上，显著的高于程序冷冻方法，优势也较明显，所以越来越多的中心逐步开始使用玻璃化冷冻方法，也成为现阶段胚胎冷冻的主要方法。

D3卵裂期胚胎玻璃化冷冻技术在IVF实验室中的应用摘要】目的：比较分析程序化冷冻复苏技术以及玻璃化冷冻复苏技术在D3卵裂期胚胎保存中的应用价值。

方法：选取72例患者（共140枚胚胎）作为研究对象，对照组采用程序化冷冻复苏技术进行保存，观察组采用玻璃化冷冻复苏技术进行保存，对比两种冷冻技术的应用价值。

结果：观察组的存活率为100%，完好率为98.57%，妊娠率50.98%，种植率为30%，明显好于对照组的91.43%、65.71%、35.29%，18.75%，差异明显，有统计学意义（P<0.05）。

结论：与程序化冷冻技术相比，玻璃化冷冻技术对于D3卵裂期胚胎保存的应用价值更高，值得在临床上推广使用。

【关键词】玻璃化冷冻；程序化冷；胚胎保存【中图分类号】R714.8 【文献标识码】A 【文章编号】1007-8231（2018）20-0060-01卵裂期胚胎冷冻是辅助生殖技术中必不可少的重要方面，卵裂期胚胎冷冻技术的有效应用可以帮助患者在一个超促排卵排周期完成多次移植，从而有效提高单个助孕周期的累积妊娠率，同时可以最大程度地减少胚胎的浪费。

本文应用回顾分析法对本院生殖中心2017年8月—2018年4月本院生殖中心进行冻胚复苏移植的72例患者（共140枚胚胎）进行冷冻复苏的具体临床资料进行分析，旨在比较分析程序化冷冻技术以及玻璃化冷冻技术在D3卵裂期胚胎保存中的应用价值。

1.资料与方法1.1 一般资料选取2017年8月—2018年4月本院生殖中心进行冻胚复苏移植的72例患者（共140枚胚胎）作为研究对象，按照冷冻技术的区别分为观察组和对照组，每组均70枚胚胎，其中对照组共34例患者，年龄24～39岁，平均年龄（32.67±3.32）岁；内膜厚度平均（9.21±1.59）mm；移植个数平均为（2.31±0.68）个。

观察组共38例患者，年龄25～40岁，平均年龄（32.84±3.29）岁；内膜厚度平均（8.97±1.38）mm；移植个数平均为（2.29±0.71）个。

玻璃化冷冻法慢速冷冻法即玻璃化冷冻来自于自然的启示，科学家发现某些种类的青蛙可在冬季经历零下数十度冷冻，而在春季解冻，且机体没有任何损伤。

研究认识到，这种青蛙冷冻时体内存在丙三醇，代替水作为细胞内溶剂，而在春天苏醒后体内丙三醇消失。

“玻璃化”的概念是指水或溶液快速降温达到或低于-100℃~-110℃的温度范围时，形成一种高黏度的介于液态和固态之间、非晶体的、透明的玻璃态。

玻璃化冷冻技术的基本原理就是用高浓度的冷冻保护剂溶液将细胞内水分置换出来，经急速降温由液态转化为外形似玻璃状的非晶体化固体状态。

1985年，玻璃化冷冻鼠胚胎首先获得成功。

目前，玻璃化冷冻保存细胞已成功应用于动物卵母细胞、血细胞及胚胎，眼角膜、皮肤、血管等组织中，而人类胚胎中的应用始于1990年，目前已经获得广泛成功。

玻璃化冷冻技术是快速冷冻与高浓度冷冻保护剂相结合的结果。

快速冷却，低温时形成透明的玻璃状固体，冷却过程中黏度很高，但无冰晶形成，避免冰晶形成对细胞脂质膜及细胞骨架结构的损伤，保留细胞内外液体正常的分子和离子分布。

玻璃化冷冻主要操作步骤简单，包括：高浓度的冷冻保护剂置换细胞内外的溶液，快速降温，使溶液黏稠度极度提高并固化，放置液氮保存。

影响玻璃化冷冻效果的因素主要包括：①冷冻保护剂。

同一种组织细胞，冷冻保护剂的浓度和种类是最重要的一个影响因素。

细胞外冷冻保护剂一般采用大分子物质，如多糖类(蔗糖、海藻糖)、聚乙二醇、胎牛血清白蛋白(BSA)和Percoll 等；细胞内冷冻保护剂为具有良好穿透性的小分子物质，如二甲基亚砜、乙二醇和丙二醇。

冷冻保护剂毒性也是人们对玻璃化冷冻担心的主要问题，但迄今大量的临床和动物实验均未发现这些冷冻保存剂对动物和人类胚胎有任何不良影响；②温度下降速度。

降温速度越快越好，可直接沁入液氮的方法，降温速度约为2500 ℃/min，而使用玻璃化冷冻仪降温速度可达135000 ℃/min；③胚胎载体。

对胚胎载体的要求是胚胎周围的冷冻保存剂体积应尽量小，与液氮间隔尽量少，操作简便且不易丢失胚胎，目前常用的有：拉细的麦管、Cryotop、Cryotip、Cryoleaf、直接微滴法、电镜网和Cryoloop。

玻璃化冷冻原理嘿，朋友们！今天咱来唠唠玻璃化冷冻原理。

你说这玻璃化冷冻啊，就好像给那些需要特殊保护的东西穿上了一层超级厉害的“冰铠甲”！想象一下，细胞啊、胚胎啊这些娇贵的小家伙们，要怎么才能好好地保存起来呢？这时候玻璃化冷冻就闪亮登场啦！它可不是随随便便就把东西冻起来哦。

它就像是一个超级细心的守护者，用一种特别的方式让这些小家伙们进入一种奇妙的状态。

就好比冬天里，水会变成冰，但是玻璃化冷冻可不一样，它能让这些要被冻起来的东西瞬间变成一种类似玻璃的状态。

这可神奇了呢！为啥要这样呢？哎呀，这你就不懂了吧。

这样能最大程度地减少对它们的伤害呀。

不然，随随便便冻一下，等再拿出来的时候都不成样子了，那多可惜呀！你看啊，细胞多小啊，胚胎多珍贵啊，咱可得小心翼翼地对待它们。

玻璃化冷冻就像是一双温柔又有力的大手，稳稳地托住它们，给它们最贴心的保护。

而且哦，这个过程就像是一场精心编排的舞蹈。

各种试剂啊、温度啊、操作啊，都得配合得恰到好处，稍有一点差错，可能就前功尽弃啦！这可真不是闹着玩的呀。

咱再想想，要是没有玻璃化冷冻，好多医学研究、辅助生殖技术啥的，不都得抓瞎啦？那些渴望有个宝宝的家庭，不就少了好多希望呀？所以说呀，玻璃化冷冻可真是个大功臣呢！它让不可能变成可能，让希望的小火苗越烧越旺。

它就像黑暗中的一盏明灯，为人们照亮前行的路。

说真的，科技的力量真是太强大啦！玻璃化冷冻就是一个特别好的例子。

它让我们能更好地应对各种挑战，为人们的生活带来更多的美好和可能。

咱就得好好感谢那些研究出玻璃化冷冻技术的科学家们，是他们的智慧和努力，让我们能享受到这么厉害的技术。

总之呢，玻璃化冷冻原理可真不简单，它是现代科技的一颗璀璨明珠！咱可得好好珍惜和利用它呀！原创不易，请尊重原创，谢谢!。