下载文档原格式
人端粒酶反转录酶启动子调控的肿瘤特异性载体的构建及表达侯睿;金鑫;李和【期刊名称】《基础医学与临床》【年(卷),期】2013(033)002【摘要】目的构建由人端粒酶反转录酶(hTERT)启动子调控的具有肿瘤细胞特异性表达能力的绿色荧光蛋白质粒.方法利用PCR技术克隆hTERT基因启动子,利用分子生物学方法以该启动子替换pEGFP-C3质粒的CMV启动子,构建重组质粒(hTERTp-EGFP).用脂质体转染法将hTERTp-EGF质粒分别转染至肿瘤细胞和正常细胞,观察此两种细胞内绿色荧光蛋白的表达差异.结果成功构建重组质粒hTERTp-EGFP,转染结果显示该质粒在肿瘤细胞中表达,而在正常细胞中无明显表达.结论重组质粒hTERTp-EGFP具有肿瘤特异性表达能力.【总页数】5页(P189-193)【作者】侯睿;金鑫;李和【作者单位】华中科技大学同济医学院,湖北武汉430030;华中科技大学同济医学院,湖北武汉430030;华中科技大学同济医学院,湖北武汉430030【正文语种】中文【中图分类】R34【相关文献】1.构建Alb启动子调控HBEGF肝特异性表达的慢病毒载体及其功能验证 [J], 贾俊双;陈傍柱;林霞;刘宇;肖东;林晓琳2.Survivin基因启动子调控的肿瘤特异性表达载体的构建 [J], 白万胜;王军利;卞卡;成诗银;张惠中;刘丽3.survivin基因启动子调控的HSV-tk真核表达载体的构建及在人喉癌细胞中的特异性表达 [J], 卞卡;张惠中;高萍;王燕;成诗银4.L-plastin启动子调控下的肿瘤细胞特异性表达载体的构建及活性分析 [J], 李桂英;田宇;王磊;孙红光;杜柏榕;朱迅5.人端粒酶催化亚单位启动子调控自杀基因HSV-TK肿瘤细胞特异性表达载体的构建 [J], 唐小军;王艳萍;周清华;车国卫;陈小禾因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
hTERT启动子调控的TRAIL基因表达载体的构建及其对肝癌细胞增殖的抑制作用李金华;刘扬;王宏芳;王志成;吴嘉慧;龚守良;李娟【期刊名称】《吉林大学学报（医学版）》【年(卷),期】2010(036)005【摘要】目的:构建hTERT启动子调控的肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(TRAIL)基因表达载体,探讨其对肝癌细胞SMMC7721和肝细胞HL7702增殖的抑制作用.方法:采用分子生物学方法构建重组质粒pshuttle-TRAIL和pshuttle-hTERT-TRAIL,经PCR和酶切鉴定正确后,通过脂质体转染SMMC7721和HL7702细胞,同时转染pcDNA3.1+-GFP并用荧光显微镜检测转染效率.MTT法检测重组质粒对细胞增殖变化的影响.结果:成功构建重组质粒pshuttle-TRAIL和pshuttle-hTERT-TRAIL,荧光显微镜检测结果显示:质粒与脂质体的比例为1∶3时细胞转染效率最高.pshuttle-hTERT-TRAIL组SMMC7721细胞增殖抑制率从16 h开始明显增加,与对照组比较差异有显著性(P<0.001),且从24 h开始与pshuttle-TRAIL 组比较细胞增殖抑制率明显增加(P<0.05);但重组质粒对HL7702细胞增殖抑制率无影响.结论: hTERT启动子调控的TRAIL可明显抑制肝癌细胞的增殖,而对人肝细胞的增殖无影响,其作用效果明显优于TRAIL单基因治疗.【总页数】7页(P825-831)【作者】李金华;刘扬;王宏芳;王志成;吴嘉慧;龚守良;李娟【作者单位】吉林大学公共卫生学院,卫生部放射生物学重点实验室,吉林,长春,130021;吉林大学公共卫生学院卫生检验教研室,吉林,长春,130021;吉林大学公共卫生学院,卫生部放射生物学重点实验室,吉林,长春,130021;吉林大学公共卫生学院,卫生部放射生物学重点实验室,吉林,长春,130021;吉林大学公共卫生学院卫生检验教研室,吉林,长春,130021;吉林大学公共卫生学院,卫生部放射生物学重点实验室,吉林,长春,130021;吉林大学公共卫生学院,卫生部放射生物学重点实验室,吉林,长春,130021;吉林大学公共卫生学院,卫生部放射生物学重点实验室,吉林,长春,130021;吉林大学公共卫生学院卫生检验教研室,吉林,长春,130021【正文语种】中文【中图分类】Q78;R735.7【相关文献】1.hTERT启动子调控的TRAIL基因对乳腺癌细胞株的杀伤作用 [J], 刁建东;卢振霞;毕黎琦2.hTERT启动子驱动TRAIL基因表达载体对结肠癌HT-29细胞的抑制作用研究[J], 周联明;张学利;单远洲;张吉发;朱光辉3.hTERT启动子调控的p53基因膀胱癌细胞靶向性表达载体构建及意义 [J], 符伟军;史立新;洪宝发;王晓雄;朱晓应;潘进勇;高江平4.hTERT启动子调控的TRAIL基因载体的构建及表达 [J], 杨咏梅;曹英林;梁晓红;王文博;马榕;高立芬;徐建锋5.hTERT启动子调控的异种抗原基因α-1,3GT表达载体的构建及其在肺癌细胞中的靶向表达 [J], 朱圣明;郑鸿;秦凤;王宇;王竹;骆志国;丁珺;王艳萍因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
hTERT启动子驱动的HSV-TK基因重组腺病毒载体的构建和制备谢于;张子祥;朱兴国;李德春【期刊名称】《苏州大学学报（医学版）》【年(卷),期】2006(26)6【摘要】目的构建人端粒酶逆转录酶启动子驱动的HSV-TK基因重组腺病毒的真核表达载体,为进一步研究其在体内外实验提供依据.方法 PDC312-TP质粒和PSUCMV-TK质粒经EcoR I,Sal I酶切连接构建PDC312-TP-TK,将质粒PDC312-TP-TK与含有5型腺病毒右臂的质粒Pbhge3通过Lipofectamine 2000共转染至293细胞,经同源重组产生重组腺病毒PSG-TP-TK,PSG-TP-TK在293细胞中大量扩增并通过氯化铯密度梯度离心法纯化,测其滴度.结果质粒PDC312-TP-TK经酶切鉴定正确,扩增得到的PSG-TP-TK经PCR扩增证实为hTERT启动子驱动的HSV-TK重组腺病毒,腺病毒滴度为1.9×1010pfu/ml.结论该实验为重组腺病毒PSG-TP-TK用于肿瘤的基因治疗打下了基础.【总页数】4页(P939-942)【作者】谢于;张子祥;朱兴国;李德春【作者单位】苏州大学附属第一医院,普外科,江苏苏州,215006;苏州大学附属第一医院,普外科,江苏苏州,215006;苏州大学附属第一医院,普外科,江苏苏州,215006;苏州大学附属第一医院,普外科,江苏苏州,215006【正文语种】中文【中图分类】R329.2+8【相关文献】1.hTERT核心启动子驱动的条件复制型腺病毒载体的构建及鉴定 [J], 倪芳;鲁茁壮;瞿成奎;胡泽斌;王立生;汪思应2.hTERT启动子调控的HSV-tk基因逆转录病毒载体的构建及SKOV3转染细胞的生物学特性观察 [J], 郭玉忠;姜国忠;李克虹;史惠蓉;王建民;薛乐勋3.hTERT启动子引导的NIS基因重组腺病毒的构建 [J], 董伟伟;谭建;王澎;李玮4.Survivin启动子驱动的LRIG1基因重组腺病毒载体的构建及鉴定 [J], 严泽军;程跃;蒋军辉;胡嘉盛;施小东;黄坚成5.Midkine启动子调控的HSV-TK基因重组腺病毒的构建 [J], 陆春明;王荣;顾红光;陆建华;杨俊涛因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
hTERT启动子调控osm基因表达在体外的抑癌作用杨义军;郑晓飞;朱捷;吕星;罗瑛;孙志贤【期刊名称】《癌症（英文版）》【年(卷),期】2003(022)006【摘要】背景与目的:肿瘤基因治疗中基因特异表达具有重要意义,构建特异表达载体是肿瘤基因治疗的基础.本研究探讨端粒酶催化亚基( human telomerase reverse transcriptase, hTERT)启动子调控抑瘤素( oncostatin M,osm)基因在端粒酶阳性肿瘤细胞中表达的特异性,以及 osm对肿瘤细胞增殖的影响.方法:构建phTERT- osm表达载体,瞬时转染肿瘤细胞;采用 RT- PCR法检测外源基因表达,用MTT法检测 osm基因表达对肿瘤细胞生长的影响.结果: hTERT启动子调控 osm 基因在端粒酶阳性 HepG2细胞中明显表达,而在正常人胚肺成纤维细胞( human embryonic lung fibroblast,HEL)中未见表达.osm的表达对端粒酶阳性 HepG2、HeLa、Glc和 A549细胞的增殖有明显的抑制作用,抑制率为 12 4%～ 46 0%;而对端粒酶阴性的 HEL细胞没有明显的影响.结论: hTERT启动子在端粒酶阳性肿瘤细胞中能明显激活 phTERT- osm载体表达 osm,并抑制肿瘤细胞的生长.【总页数】4页(P575-578)【作者】杨义军;郑晓飞;朱捷;吕星;罗瑛;孙志贤【作者单位】军事医学科学院放射医学,研究所,北京,100850;沈阳军事医学研究所,辽宁,沈阳,110031;军事医学科学院放射医学,研究所,北京,100850;军事医学科学院放射医学,研究所,北京,100850;军事医学科学院放射医学,研究所,北京,100850;军事医学科学院放射医学,研究所,北京,100850;军事医学科学院放射医学,研究所,北京,100850【正文语种】中文【中图分类】Q78;R735.7因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
人端粒酶催化亚单位启动子调控自杀基因HSV-TK靶向性表达治疗肺癌的体内外实验研究王艳萍;唐小军;周清华;车国卫;陈小禾;朱大兴【期刊名称】《四川大学学报：医学版》【年(卷),期】2008(39)5【摘要】目的研究人类单纯疱疹病毒的胸苷激酶(HSV-TK)/更昔洛韦(GCV)治疗系统在人端粒酶催化亚单位(hTERT)启动子的调控下对肺癌细胞A549的体外靶向性增殖抑制作用和对裸鼠体内A549移植瘤的治疗效果。
方法1用已构建的hTERT 启动子和SV40启动子调控的TK基因表达质粒pGL3-hTp-TK和pGL3-SV40-TK 转染端粒酶阳性的人肺腺癌细胞A549及端粒酶阴性的人胚肺细胞MRC-5,RT-PCR方法检测转染细胞中TK基因的表达情况;2MTT法检测GCV对上述转染细胞体外增殖的抑制作用;并应用流式细胞仪检测GCV对上述转染细胞凋亡的影响;3将A549细胞接种于裸鼠皮下,研究pGL3-hTp-TK/GCV和pGL3-SV40-TK/GCV对移植瘤的体内生长抑制作用。
结果1转染pGL3-SV40-TK的A549和MRC-5细胞均有TK mRNA表达,转染pGL3-hTp-TK的A549细胞也有TK mRNA表达,但MRC-5细胞无TK mRNA表达;2GCV对转染pGL3-SV40-TK的A549、MRC-5细胞和转染pGL3-hTp-TK的A549细胞的体外增殖均有明显抑制作用,对转染pGL3-hTp-TK的MRC-5细胞无明显抑制作用;转染pGL3-SV40-TK和pGL3-hTp-TK的A549细胞经GCV处理后细胞凋亡指数(分别为21.58%和23.19%)均显著高于转染pGL3-hTp的A549细胞及空白对照,转染pGL3-SV40-TK的MRC-5细胞凋亡指数(9.35%)显著高于对照组,而转染pGL3-hTp-TK的MRC-5细胞凋亡指数(0.88%)无明显升高;3pGL3-SV40-TK/GCV和pGL3-hTp-TK/GCV治疗系统对裸鼠A549移植瘤的生长具有明显抑制作用,抑瘤率分别为46.7%和40.5%,均显著高于各阴性对照组(分别为9.7%,14.3%,7.0%和8.0%)。
ｈＴＥＲＴ启动子介导自杀基因在肿瘤细胞中的靶向表达李军综述蔡绍皙杨应斌审校1端粒、端粒酶与肿瘤端粒是真核生物线性染色体末端一种特殊的异质化结构，其功能是稳定染色体、避免染色体重组和降解，并参与染色体在核内的定位和基因的表达调控。
端粒酶是一种专一的逆转录酶，能以自身RNA组分为模板，通过在染色体端粒末端加入六聚体的TTAGGG重复序列来维持端粒的长度。
端粒酶在肿瘤的发生、发展过程中起着非常重要的作用，已发现在85％以上的原发性肿瘤中有端粒酶的活化表达，端粒酶活化参与细胞的癌变过程已得到肯定，是迄今为止最为广谱的肿瘤分子标志物。
人端粒酶由RNA组分（hTR）、催化亚单位（hTERT）和相关蛋白1（TEP1）三个亚单位组成。
hTR是合成端粒DNA的模板，hTERT是一种RNA依赖的DNA 多聚酶，hTERT对端粒酶的活性起着最为重要的作用，且仅存在于端粒酶阳性表达的细胞中，它的表达是端粒酶活性激活的关键步骤。
在成熟分化的正常体细胞中hTERT基因的表达处于关闭状态，当细胞通过外源性强制表达hTERT基因而重获端粒酶活性时，这些细胞就能够延长存活周期。
2hTERT启动子及其调控hTERT基因启动子区域缺乏TATA盒及TA TA相似序列，其结构是富含GC(含量为71.3%)的CpG岛，转录起始元件(CCTCTCC)位于转录起始点上游第三位，转录起始点上游181 bp是核心启动子区,在该区发现有多个转录因子结合位点,如c-myc蛋白、Mad1、SP1、P53、WT1及E2F等。
CpG岛的形成增加了DNA甲基化的机会,从而对端粒酶的活性有所调节。
Dessain等[1]的研究发现,仅有一部分细胞在去甲基化处理后表现出端粒酶活性,认为甲基化并不是转录调控的主要机制。
也有研究表明：有一些端粒酶阴性的细胞，hTERT基因是非甲基化或者低甲基化的，提示有其他抑制hTERT表达的机制，而在一些端粒酶阳性的肿瘤和培养细胞中，hTERT的CpG岛甲基化程度与hTERT的表达之间并没有一定的关系。
腺病毒介导的HSV-tk基因治疗人膀胱癌的动物实验研究郑志涛;温端改;侯建全【期刊名称】《苏州大学学报（医学版）》【年(卷),期】2003(023)003【摘要】目的探讨带有HSV-tk基因的重组腺病毒(Ad-tk)结合GCV对人膀胱癌的治疗作用.方法建立人膀胱癌裸鼠移植瘤模型21只,采用肿瘤原位注射Ad-tk结合GCV治疗.结果5×108 PFU的Ad-tk肿瘤原位注射结合GCV治疗,能明显抑制肿瘤生长,肿瘤平均重量为0.21 g,病理检查表明肿瘤组织坏死、出血伴纤维组织增生;而3个对照组Ad-tk/PBS组、PBS/GCV组、PBS组肿瘤平均重量分别为1.60、1.52、1.71 g.与对照组比较,肿瘤生长抑制率分别为86.9%、86.2%、87.7%,有显著性差异(均P＜0.01).结论 Ad-tk/GCV系统对人膀胱癌的敏感性较高,疗效显著.【总页数】2页(P282-283)【作者】郑志涛;温端改;侯建全【作者单位】苏州大学附属第一医院,泌尿外科,苏州,215006;苏州大学附属第一医院,泌尿外科,苏州,215006;苏州大学附属第一医院,泌尿外科,苏州,215006【正文语种】中文【中图分类】R737.1405【相关文献】1.hTERT启动子调控腺病毒介导的HSV-TK/GCV基因系统治疗肾癌的动物实验研究 [J], 田大伟;陈业刚;张勇;王亚轩;黎玮2.人端粒酶逆转录酶启动子调控腺病毒介导胸苷激酶基因治疗人膀胱癌的动物实验研究 [J], 连文峰;林向阳;张素英;王春仙;杨永安;于洋;宫香宇;陈艳军;张敏3.腺病毒介导的HSV-TK基因系统联合羟基喜树碱对人膀胱癌细胞的体外杀伤作用[J], 黄河;谭万龙;朱文辉;梁仲琨4.腺病毒介导的HSV-tk/GCV系统在hTERT启动子调控下治疗人膀胱癌的实验研究 [J], 王亚轩;蔡文清;黎玮;杨书文;李景东;齐进春5.腺病毒介导的HSV-TK/GCV自杀基因治疗前列腺癌的体外实验 [J], 吴建辉;张勇;黎玮;马洪顺因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
hTERT核心启动子调控的hNIS重组腺病毒的构建与鉴定张俊;王爱东;申咏梅;石怡珍;崔学军;刘增礼;欧阳松应【期刊名称】《中国免疫学杂志》【年(卷),期】2008(024)006【摘要】目的:构建含人端粒酶逆转录酶(hTERT)核心启动子调控的人钠碘转运体(hNIS)基因重组腺病毒,并初步鉴定.方法:将hTERT核心启动子从hTERT/pcDNA3.1(+)质粒中切出,亚克隆至含全长hNIS cDNA序列的质粒载体FL*-hNIS/pcDNA3,应用限制性内切酶将hTERT-hNIS片段切出后连入穿梭质粒载体pAdTrack,应用AdEasy系统构建出重组腺病毒Ad-hTERT-hNIS.同时,构建CMV启动子调控的hNIS重组腺病毒Ad-CMV-hNIS作为阳性对照.应用RT-PCR 方法验证hTERT在转染肿瘤细胞中的转录活性.结果:成功构建重组腺病毒Ad-hTERT-hNIS、Ad-CMV-hNIS并经PCR验证正确.RT-PCR证实hNIScDNA能从Ad-hTERT-hNIS转染的细胞中扩增出来.结论:成功构建重组腺病毒Ad-hTERT-KNIS;hTERT核心启动子在转染的肺癌A549细胞中具有转录活性.为下一步的碘治疗实验提供了实验依据.【总页数】5页(P549-553)【作者】张俊;王爱东;申咏梅;石怡珍;崔学军;刘增礼;欧阳松应【作者单位】江苏省泰州市人民医院核医学科;苏州大学附属第二医院核医学科,苏州,215004;苏州大学附属第二医院核医学科,苏州,215004;苏州大学附属第二医院核医学科,苏州,215004;苏州大学附属第二医院核医学科,苏州,215004;苏州大学附属第二医院核医学科,苏州,215004;中国科学院生物物理研究所,北京,100101【正文语种】中文【中图分类】R392.11【相关文献】1.hTERT启动子调控的PUMA重组腺病毒的构建与鉴定 [J], 王冬;周琦;李雨聪2.hTERT启动子调控的SEA-CD80基因共表达重组腺病毒载体的构建及在不同肿瘤细胞中的表达鉴定 [J], 司少艳;刘俊丽;王晓菲;谭小青;宋淑军3.hTERT核心启动子驱动的条件复制型腺病毒载体的构建及鉴定 [J], 倪芳;鲁茁壮;瞿成奎;胡泽斌;王立生;汪思应4.hTERT启动子引导hNIS基因重组腺病毒介导放射性核素的裸鼠显像 [J], 赵兴业;李玮;谭建;王澎;李宁5.修饰hTERT核心启动子靶向转录FCY1的重组腺病毒的构建及鉴定 [J], 滑玮;辛晓燕;苏明权;李立文因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
hTERT启动子调控p53基因表达逆转录病毒的抗肿瘤作用黄明文;余新;洪葵;刘天德;邵江华【期刊名称】《中国临床医学》【年(卷),期】2008(015)003【摘要】目的:观察人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因启动子驱动野生型p53的新型逆转录病毒对肿瘤的杀伤作用.方法:先将前期构建的逆转录病毒穿梭质粒pLHCX-hTERT-EGFP和pLHCX-hTERT-wtp53进行包装,通过浓缩获得高滴度病毒液.然后将逆转录病毒pLHCX-hTERT-wtp53感染包含突变型p53的大肠癌细胞系SW620,通过RT-PCR和Western blot证实p53mRNA和p53蛋白的表达.最后将逆转录病毒pLHCX-hTERT-wtp53和pLHCX-hTERT-EGFP感染hTERT阳性的人大肠癌细胞株SW620,人肺癌细胞株A549和hTERT阴性的正常人胚肺成纤维细胞MRC-5,观察其特异性杀伤作用;另外通过裸鼠皮下注射肿瘤细胞SW620和A549,建立肿瘤模型,应用逆转录病毒pLHCX-hTERT-wtp53治疗后测量肿瘤体积计算肿瘤生长抑制率.结果:获得病毒液的滴度分别为2.3×107CFU·mL-1和3.5×107CFU·mL-1.逆转录病毒pLHCX-hTERT-wtp53经RT-PCR证实p53mRNA的表达,经Western blot检测到p53蛋白表达.重组逆转录病毒导入外源的野生型p53基因后,通过流式细胞检测到hTERT阳性人大肠癌细胞株SW620,人肺癌细胞株A549凋亡率远高于hTERT阴性的正常人胚肺成纤维细胞MRC-5(P<0.05).体内实验证实各组通过逆转录病毒pLHCX-hTERT-wtp53治疗后的肿瘤体积明显小于对照组(P<0.05).结论:获得的新型逆转录病毒对肿瘤有特异性的杀伤作用.【总页数】4页(P429-432)【作者】黄明文;余新;洪葵;刘天德;邵江华【作者单位】南昌大学第二附属医院普外科,分子医学实验室,江西南昌,330006;南昌大学第二附属医院普外科,分子医学实验室,江西南昌,330006;南昌大学第二附属医院普外科,分子医学实验室,江西南昌,330006;南昌大学第二附属医院普外科,分子医学实验室,江西南昌,330006;南昌大学第二附属医院普外科,分子医学实验室,江西南昌,330006【正文语种】中文【中图分类】R730.5【相关文献】1.hTERT启动子调控的CXCR4-shRNA逆转录病毒抑制膀胱癌细胞侵袭、增殖的体外研究 [J], 杜岳峰;龙清志;樊桂玲;梁亮2.hTERT基因启动子调控表达绿色荧光蛋白基因的逆转录病毒载体的构建及在人宫颈癌Hela细胞中的表达 [J], 邓俊晖;余新;邵江华3.hTERT启动子调控的野生型p53基因对膀胱癌细胞的靶向性抑制作用 [J], 柳青;史立新;符伟军;王晓雄;洪宝发;高江平;张磊;蔡伟;杨勇;宋涛4.hTERT启动子调控的p53基因膀胱癌细胞靶向性表达载体构建及意义 [J], 符伟军;史立新;洪宝发;王晓雄;朱晓应;潘进勇;高江平5.hTERT启动子调控的HSV-tk基因逆转录病毒载体的构建及SKOV3转染细胞的生物学特性观察 [J], 郭玉忠;姜国忠;李克虹;史惠蓉;王建民;薛乐勋因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
hTERT基因启动子调控HSV作者：卞卡，张惠中，任继鸿，赵辉，成诗银【关键词】端粒,末端转移酶；启动区（遗传学）；宫颈肿瘤；tk基因【Abstract】 AIM: To observe the killing effect of HSVtk/GCV system on cervical carcinoma cells under the control of hTERT(human telomerase reverse transcriptase) core promoter. METHODS: An eukaryotic expression vector containing HSVtk gene under the control of hTERT core promoter was constructed and was transfected into cervical carcinoma cells(HeLa) and vessel endothelial cells(ECV304) by liposome method. Transfected cells were then selected with G418 and RTPCR was used to detect the tk gene expression in HeLa cells and ECV304 cells. After GCV was added, flow cytometry method were applied to investigate its cell killing effect. RESULTS: pCIneo/hTERTtk/GCV system under the control of hTERT induced the apoptosis in more than % of cervical carcinoma cells, but not in normal vessel endothelial cells. CONCLUSION: hTERT gene core promoter is tumorspecific and may be useful in tk gene therapy of cervical carcinoma and in reducing the side effects of the therapy.【Keywords】 telomerase; promoter regions (genetics); cervix neoplasms; tk gene【摘要】目的：研究人端粒酶逆转录酶（hTERT）基因核心启动子调控的人单纯疱疹病毒胸苷激酶基因/更昔洛韦（HSVtk/GCV）系统对宫颈癌细胞的体外杀伤作用.方法：构建hTERT基因启动子调控的tk基因真核表达载体pCIneo/hTERTtk，分别用脂质体法转染宫颈癌细胞(HeLa)和正常血管内皮细胞（ECV304），新霉素（G418）筛选阳性克隆扩增. 用RTPCR法比较两种细胞tk基因的表达情况；给予前药更昔洛韦（GCV），用流式细胞术检测hTERT调控的HSVtk/GCV系统对两种细胞的杀伤作用. 结果： hTERT启动子调控下的HSVtk/GCV系统对宫颈癌HeLa细胞有明显的杀伤作用，使%的细胞凋亡；而对正常细胞ECV304作用则不明显. 结论： hTERT启动子调控的tk基因治疗是一种具有肿瘤特异性的治疗方法，有望解决肿瘤基因治疗中的特异性杀伤及降低毒副作用等问题.【关键词】端粒，末端转移酶；启动区（遗传学）；宫颈肿瘤；tk基因0引言宫颈癌是死亡率较高的恶性肿瘤,传统治疗方法以手术、化疗、放疗为主,但晚期不宜手术者及对放化疗不敏感者5 a生存率仍不理想. 随着分子生物学及相关技术的迅速发展,自杀基因疗法在肿瘤治疗中取得了一定疗效，其利用人单纯疱疹病毒胸苷激酶基因/更昔洛韦（human simplex virusthymidine kinase/ganciclovir, HSVtk/GCV）将更昔洛韦（ganciclovir, GCV）等前药磷酸化为细胞毒产物,从而阻止细胞DNA合成, 杀伤肿瘤细胞［1-2］. 有研究发现，由于缺乏特异性，tk基因修饰的正常组织细胞经前药治疗后会与肿瘤细胞一起被杀死，造成对正常组织的杀伤. hTERT基因在90%的人类肿瘤组织中呈过表达［3］，具有明显的肿瘤特异性.我们采用克隆hTERT基因启动子，利用其在肿瘤细胞中特有的启动活性来控制HSVtk的肿瘤特异性表达的方法，旨在实现其在肿瘤细胞中的特异性杀伤作用.1材料和方法材料Taq DNA 聚合酶、限制性内切酶以及电泳中所用marker DL20XX 和DGL20XX均购自TaKaRa公司；T4 DNA连接酶购自日本Promega公司；质粒提取、纯化试剂盒购自北京天为时代公司；转染试剂盒LipofectamineTM20XX购自美国Introvigen公司；含人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因与tk基因的pGL3 Basic质粒由第四军医大学唐都医院耳鼻喉科韩明鲲馈赠；pCIneo质粒由第四军医大学唐都医院肾内科杨洁馈赠；GCV购自广东丽珠集团；大肠杆菌菌株JM109，宫颈癌细胞HeLa和脐静脉内皮细胞ECV304均由第四军医大学唐都医院临床实验科提供；流式细胞仪美国Coulter公司.方法基因启动子引物的设计和合成设计hTERT基因启动子引物的酶切位点为BglⅡ和HindⅢ,由上海基康生物工程公司合成. 上游引物：5′ggg aga tct agt gga ttc gcg ggc aga ga 3′；下游引物：5′ggg aag ctt agg gct tcc cac gtg cgc ag3′.以含有hTERT启动子的质粒为模板进行PCR扩增，循环参数为：94℃ 2 min; 94℃ 30 s, 67℃ 30 s, 72℃ 40 s, 30个循环；72℃ 1 min. PCR 产物用15 g/L琼脂糖凝胶电泳，胶回收试剂盒回收得到hTERT启动子片断.质粒的构建将获得的hTERT片断以BglⅡ和HindⅢ双酶切，得到两端为BglⅡ和HindⅢ位点的hTERT启动子片断，将其连接入pGL3tk质粒相应的酶切位点之间，得到含有hTERTtk基因的质粒pGL3. 将以上质粒用BglⅡ和XbaⅠ双酶切，得到hTERTtk基因片断，将其连入pCIneo质粒相应的酶切位点之间，得到hTERT启动子调控的tk基因真核表达载体pCIneo/hTERTtk，并以酶切方法进行鉴定.质粒的转染复苏HeLa细胞与ECV304细胞，培养在含100 mL/L新生牛血清的达尔伯克氏必需基本培养基（DMEM）中. 转染前1 d，胰酶消化细胞并计数，细胞铺板在2 mL含血清，不含抗生素的正常生长的培养液中(每孔3×105细胞)，使其在转染日能达到80%的覆盖率. 每种细胞接种2个孔，分别转染pCIneo/hTERTtk和pCIneo两种质粒,分别命名为HeLa/hTERTtk， HeLa/0，ECV304/hTERTtk以及ECV304/0. 对于每孔细胞，每10 uL脂质体中加入4 μg DNA，以无血清DMEM培养液混匀，37℃，50 mL/L CO2中孵育5 h，更换含血清培养液继续孵育24 h，改用含G418的培养基培养，G418浓度为500 μg/mL，持续筛选12 d后挑出单克隆，扩大培养. 期间每3 d换液1次，得到稳定转染了两种质粒的细胞.分别提取转染的HeLa和ECV304细胞基因组总RNA，常规方法反转录cDNA，并以此为模板进行tk基因核心序列的PCR扩增. 上游引物：5′gca tggctt cgt acc cct gcc atc3′；下游引物：5′gcg tta gcc tcc ccc atc tcc cgg3′.循环参数为：94℃ 3 min；94℃ 40 s, 60℃ 40 s, 72℃ 70 s,30个循环；72℃8 min. PCR产物用15 g/L琼脂糖凝胶电泳 h，紫外灯下摄片.流式细胞仪检测不同载体转染的不同细胞命名为： HeLa/hTERTtk,HeLa/0, ECV304/hTERTtk和ECV304/0，分别按2×105的数量接种于25 cm2培养瓶中，37℃, 50 mL/L CO2孵箱孵育24 h后换GCV(1 mg/mL)培养液，继续孵育72 h后收集1×106个细胞，先用PBS洗涤2次，再用无水乙醇固定，送流式细胞仪进行分析，每种细胞送5份. 检测前离心去乙醇,碘化丙皖染色15 min.汞激光激发波长为488 nm, 结果用软件Elite 和DNA Multictycle分析.统计学处理：数据以x±s表示，用软件进行统计分析，多个样本均数比较用方差分析；两两均数之间比较用SNKq检验. P,表1).表1四种细胞凋亡率及细胞周期的比较3讨论近年来研究表明，人端粒酶由三部分组成： RNA亚单位（humantelomerase RNA, hTR）,蛋白质亚单位（human telomerase associated protein［4］和hTERT. 其中hTERT被认为是决定端粒酶活性的重要部分［5-6］. 1, hTEP 1）在以上三个亚单位中，hTR和hTEP 1在肿瘤和正常组织中均广泛表达，而hTERT的表达却大多分布在恶性肿瘤组织中，在正常组织中少见. Koga等［7］和Gu等［8］构建了由hTERT 启动子调控的、携带有胱天蛋白酶和Bax等凋亡诱导基因的靶向基因治疗载体, 可诱导端粒酶表达阳性的肿瘤细胞发生凋亡［9］, 凋亡率可达到40%～84%; 而对正常人体细胞几乎没有影响；Liu等［10］也发现利用hTERT启动子诱导CD基因可特异性杀伤大肠癌细胞，并增强其前体药物5Fu 对大肠癌细胞的敏感性. 因此，利用端粒酶逆转录酶启动子构建癌细胞特异性表达载体用于基因治疗是一种较理想的选择.在实验中我们观察到，宫颈癌细胞中tk基因的表达可以将前药GCV转换为细胞毒性产物而对细胞产生杀伤效应. 细胞周期分析表明，经GCV处理后的宫颈癌细胞，细胞碎片比例明显增加，S期细胞所占比例明显减少，而S期为细胞的DNA合成期，期间主要为细胞DNA的合成与复制. 由此我们推断，hTERT启动子调控的HSVtk/GCV系统可能是通过抑止癌细胞DNA的合成和复制导致细胞凋亡.我们还发现，RTPCR与细胞周期分析结果都显示，只有在端粒酶表达阳性的肿瘤细胞中，hTERT启动子才能发挥作用使tk基因得到表达；同样只有在肿瘤细胞中，得到表达的tk基因产生的tk酶才可将GCV转化为细胞毒性物质，抑止DNA的合成导致细胞凋亡. 而在正常细胞中，无论是转染前还是转染后，均无法引起明显的细胞的凋亡. 这表明hTERT启动子调控的HSVtk/GCV系统仅特异作用于肿瘤细胞，成功的实现了肿瘤基因治疗的特异性.【参考文献】［1］ Yazawa K, Fisher WE, Brunicardi FC. Current progress in suicide gene therapy for cancer ［J］. World J Surg, 20XX,26(7):783-789.［2］ Fillat C, Carrio M, Cascante A, et al. Suicide gene therapy mediated by the HerpesSimplex virus thymidine kinase gene/Ganciclovir system: Fifteen years of application ［J］. Curr Gene Ther,20XX,3(1):13-26.［3］ Shay JW, Bacchetti S. A survey of telomerase activity in human cancer ［J］. Eur J Cancer, 1997,33(5):787-791.［4］ Harrington L, McPhail T, Mar V, et al. A mammalian telomeraseassociated protein ［J］. Science, 1997,275(5302):973-977.［5］ Nakamura TM, Morin GB, Chapman KB, et al. Telomerase catalytic subunit homologs from fission yeast and human ［J］. Science, 1997,277(5328):955-959.［6］梁光萍,罗向东,陈渝，等. hTERT基因荧光真核表达载体的构建及表达［J］. 第四军医大学学报，20XX,24（13）:1221-1223.［7］ Koga S, Hirohata S, Kondo Y, et al. A novel telomerasespecific gene therapy: Gene transfer of caspase8 utilizing the human telomerase catalytic subunit gene promoter ［J］. Hum Gene Ther, 20XX,11(10):17-1406.［8］ Gu J, Kagawa S, Takakura M, et al. Tumorspecific transgene expression from the human telomerase reverse transcriptase promoter enables targeting of the therapeutic effects of the Bax gene to cancers ［J］. Cancer Res, 20XX,60(19):5359-5364.［9］ Keith WN, Bilsland A, Evans TR, et al. Telomerasedirected molecular therapeutics ［J］. Expert Rev Mol Med, 20XX,20XX:1-25.［10］ Liu J , Zou WG, Lang MF. Cancerspecific killing by the CD suicide gene using the human telomerase reverse t ranscriptase promoter ［J］. Int J Oncol, 20XX,21(3):661-666。
