基因启动子分析基本流程

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在进行基因组分析之前，需要进行充分的准备。

江苏农业学报(ＪｉａｎｇｓｕＪ.ｏｆＡｇｒ.Ｓｃｉ.)ꎬ２０２３ꎬ３９(３):７５３￣７６１ｈｔｔｐ://ｊｓｎｙｘｂ.ｊａａｓ.ａｃ.ｃｎ张久盘ꎬ宋雅萍ꎬ姜㊀超ꎬ等.牛ＬＡＴＳ２基因启动子克隆及转录调控分析[Ｊ].江苏农业学报ꎬ２０２３ꎬ３９(３):７５３￣７６１.ｄｏｉ:１０.３９６９/ｊ.ｉｓｓｎ.１０００￣４４４０.２０２３.０３.０１６牛ＬＡＴＳ２基因启动子克隆及转录调控分析张久盘１ꎬ宋雅萍２ꎬ姜㊀超２ꎬ王㊀锦１ꎬ魏大为２(１.宁夏农林科学院动物科学研究所ꎬ宁夏银川７５０００２ꎻ２.宁夏大学农学院ꎬ宁夏银川７５００２１)收稿日期:２０２２￣０６￣１５基金项目:宁夏自然科学基金项目(２０２１ＡＡＣ０５００７)ꎻ宁夏重点研发计划项目(２０２０ＢＥＢ０４０１１)ꎻ宁夏青年科技人才托举工程项目(ＴＪＧＣ２０１９０７６)作者简介:张久盘(１９８５－)ꎬ女ꎬ河南商丘人ꎬ硕士ꎬ助理研究员ꎬ研究方向为动物遗传育种ꎮ(Ｅ￣ｍａｉｌ)ｚｈａｎｇｊｉｕｐａｎ＠１６３.ｃｏｍ通讯作者:魏大为ꎬ(Ｅ￣ｍａｉｌ)ｗｅｉｄａｗｅｉｗｄｗ＠１６３.ｃｏｍ㊀㊀摘要:㊀本研究旨在探究牛ＬＡＴＳ２基因组织表达规律ꎬ利用相对荧光素酶活性数值确定其启动子核心区域并初步鉴定其核心区域关键转录因子ꎬ以阐明牛ＬＡＴＳ２基因的转录调控机制ꎮ利用ＲＴ￣ｑＰＣＲ检测牛ＬＡＴＳ２基因在心㊁脾㊁肝㊁肾㊁肺㊁背最长肌㊁皮下脂肪㊁皱胃㊁大肠及睾丸等中的相对表达量ꎬ构建ＬＡＴＳ２蛋白进化树ꎮ克隆ＬＡＴＳ２基因５ᶄ端非翻译区上游１.７ｋｂ序列ꎬ利用逐段缺失引物ꎬ巢式扩增其７个启动子区不同截断体缺失片段(－１７９２~＋１７９㊁－１４７５~＋１７９㊁－１０９８~＋１７９㊁－７２７~＋１７９㊁－５１５~＋１７９㊁－２４８~＋１７９和－５６~＋１７９)ꎬ并将不同截断体构建至双荧光素酶报告载体ｐＧＬ３￣Ｂａｓｉｃ上ꎮ重组的ＬＡＴＳ２基因启动子双荧光素载体分别转染小鼠成肌细胞(Ｃ２Ｃ１２)和小鼠脂肪细胞(３Ｔ３￣Ｌ１)细胞系ꎬ鉴定其启动子核心区域ꎮ进一步借助在线软件ＪＡＳＰＡＲ(ｈｔｔｐ://ｊａｓｐａｒ.ｇｅｎｅｒｅｇ.ｎｅｔ/)和Ｇｅｎｏｍａｔｉｘ(ｈｔｔｐ://ｗｗｗ.ｇｅｎｏｍａｔｉｘ.ｄｅ/ｃｇｉ￣ｂｉｎ//ｍａｔ￣ｉｎｓｐｅｃｔｏｒ)分析启动子核心区域序列特征ꎬ并预测关键转录因子结合位点ꎮ结果显示ꎬＬＡＴＳ２基因在肝和背最长肌中表达量极显著高于脾(Ｐ<０ ０１)ꎻＬＡＴＳ２蛋白构建的进化树显示反刍动物单独聚为１支ꎬ表明ＬＡＴＳ２基因在反刍动物进化过程中保守性较高ꎻ蛋白质互作分析筛选出的与ＬＡＴＳ２蛋白互作紧密的前１０种蛋白质均为Ｈｉｐｐｏ信号通路中的关键蛋白质ꎮＬＡＴＳ２基因启动子核心区域位于－２４８~－５６ꎬ预测其启动子核心区域有与肌肉发育相关的转录因子ＴＥＡＤ１㊁ＭＥＦ２Ａ㊁ＦＯＳＬ１㊁ＭｙｏＧ和Ｍｙｏｄ１的结合位点ꎬ表明ＬＡＴＳ２基因在牛肌肉生长发育中扮演重要角色ꎮ以上结果为探究牛ＬＡＴＳ２基因在肌肉生长发育中转录调控机制奠定基础ꎮ关键词:㊀牛ꎻＬＡＴＳ２基因ꎻ组织表达ꎻ启动子ꎻ转录调控中图分类号:㊀Ｓ８２３.８＋１㊀㊀㊀文献标识码:㊀Ａ㊀㊀㊀文章编号:㊀１０００￣４４４０(２０２３)０３￣０７５３￣０９ＰｒｏｍｏｔｅｒｃｌｏｎｉｎｇａｎｄｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｂｏｖｉｎｅＬＡＴＳ２ｇｅｎｅＺＨＡＮＧＪｉｕ￣ｐａｎ１ꎬ㊀ＳＯＮＧＹａ￣ｐｉｎｇ２ꎬ㊀ＪＩＡＮＧＣｈａｏ２ꎬ㊀ＷＡＮＧＪｉｎ１ꎬ㊀ＷＥＩＤａ￣ｗｅｉ２(１.ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＡｎｉｍａｌＳｃｉｅｎｃｅꎬＮｉｎｇｘｉａＡｃａｄｅｍｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌａｎｄＦｏｒｅｓｔｒｙＳｃｉｅｎｃｅｓꎬＹｉｎｃｈｕａｎ７５０００２ꎬＣｈｉｎａꎻ２.ＳｃｈｏｏｌｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅꎬＮｉｎｇｘｉａＵｎｉ￣ｖｅｒｓｉｔｙꎬＹｉｎｃｈｕａｎ７５００２１ꎬＣｈｉｎａ)㊀㊀Ａｂｓｔｒａｃｔ:㊀ＴｈｅｐｕｒｐｏｓｅｏｆｔｈｉｓｓｔｕｄｙｗａｓｔｏｅｘｐｌｏｒｅｔｈｅｔｉｓｓｕｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｂｏｖｉｎｅＬＡＴＳ２ｇｅｎｅꎬａｎｄｉｄｅｎｔｉｆｙｉｔｓｃｏｒｅｐｒｏｍｏｔｅｒｒｅｇｉｏｎａｎｄｋｅｙｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｓꎬｓｏａｓｔｏｃｌａｒｉｆｙｔｈｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆｂｏｖｉｎｅＬＡＴＳ２ｇｅｎｅ.ＴｈｅｒｅｌａｔｉｖｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｓｏｆｂｏｖｉｎｅＬＡＴＳ２ｗｅｒｅｄｅｔｅｃｔｅｄｉｎｈｅａｒｔꎬｓｐｌｅｅｎꎬｌｉｖｅｒꎬｋｉｄｎｅｙꎬｌｕｎｇꎬｌｏｎｇｉｓｓｉｍｕｓｄｏｒｓｉｍｕｓｃｌｅꎬｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓｆａｔꎬａｂｏｍａｓｕｍꎬｌａｒｇｅｉｎｔｅｓｔｉｎｅａｎｄｔｅｓｔｉｓｂｙＲＴ￣ｑＰＣＲꎬａｎｄｔｈｅｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙｔｒｅｅｏｆＬＡＴＳ２ｐｒｏｔｅｉｎｗａｓｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ.Ｔｈｅ１.７ｋｂｓｅｑｕｅｎｃｅｕｐｓｔｒｅａｍｏｆｔｈｅ５ᶄ￣ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄｒｅｇｉｏｎｏｆＬＡＴＳ２ｇｅｎｅｗａｓｃｌｏｎｅｄꎬａｎｄｔｈｅｐｒｏｍｏｔｅｒｓｅｑｕｅｎｃｅｒｅｇｉｏｎｓｏｆｓｅｖｅｎｓｅｇｍｅｎｔｓｗｉｔｈ－１７９２－＋１７９ꎬ－１４７５－＋１７９ꎬ－１０９８－＋１７９ꎬ－７２７－＋１７９ꎬ－５１５－＋１７９ꎬ－２４８－＋１７９ａｎｄ－５６－＋１７９ｍｉｓｓｉｎｇｓｅｇｍｅｎｔｓｗｅｒｅａｍｐｌｉｆｉｅｄꎬａｎｄｔｈｅｄｕａｌ￣ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅｒｅｐｏｒｔｅｒｖｅｃｔｏｒｐＧＬ３￣Ｂａｓｉｃｗａｓｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ.ＴｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＬＡＴＳ２ｇｅｎｅｐｒｏｍｏｔｅｒｖｅｃｔｏｒｓｗｅｒｅｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄｉｎｔｏＣ２Ｃ１２ａｎｄ３Ｔ３￣Ｌ１ｃｅｌｌｌｉｎｅｓꎬｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙꎬａｎｄｔｈｅｃｏｒｅｐｒｏｍｏｔｅｒｒｅｇｉｏｎｓｗｅｒｅｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ.Ｗｉｔｈｔｈｅｈｅｌｐｏｆｏｎｌｉｎｅｓｏｆｔｗａｒｅ３５７ＧｅｎｏｍａｔｉｘａｎｄＪＡＳＰＡＲꎬｔｈｅｓｅｑｕｅｎｃｅｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｏｆｃｏｒｅｐｒｏｍｏｔｅｒｗｅｒｅａｎａｌｙｚｅｄｔｏｐｒｅｄｉｃｔｔｈｅｂｉｎｄｉｎｇｓｉｔｅｓｏｆｋｅｙｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｓ.ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｂｏｖｉｎｅＬＡＴＳ２ｇｅｎｅｉｎｌｉｖｅｒａｎｄｌｏｎｇｉｓｓｉｍｕｓｄｏｒｓｉｍｕｓｃｌｅｗａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｈｉｇｈｅｒｔｈａｎｔｈａｔｉｎｓｐｌｅｅｎ(Ｐ<０ ０１).Ｒｕｍｉｎａｎｔｓｗｅｒｅｃｌｕｓｔｅｒｅｄｉｎｔｏｏｎｅｂｒａｎｃｈｉｎｔｈｅｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙｔｒｅｅｃｏｎ￣ｓｔｒｕｃｔｅｄａｃｃｏｒｄｉｎｇｔｏＬＡＴＳ２ｐｒｏｔｅｉｎꎬｗｈｉｃｈｉｎｄｉｃａｔｅｄｔｈａｔＬＡＴＳ２ｇｅｎｅｗａｓｈｉｇｈｌｙｃｏｎｓｅｒｖｅｄｉｎｔｈｅｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙｐｒｏｃｅｓｓｏｆｒｕｍｉｎａｎｔｓ.ＴｈｅｔｏｐｔｅｎｐｒｏｔｅｉｎｓｃｌｏｓｅｌｙｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇｗｉｔｈＬＡＴＳ２ｐｒｏｔｅｉｎｓｃｒｅｅｎｅｄｂｙｐｒｏｔｅｉｎｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓｗｅｒｅｔｈｅｋｅｙｐｒｏｔｅｉｎｓｉｎＨｉｐｐｏｓｉｇｎａｌｉｎｇｐａｔｈｗａｙ.ＴｈｅｃｏｒｅｒｅｇｉｏｎｏｆｔｈｅＬＡＴＳ２ｇｅｎｅｐｒｏｍｏｔｅｒｗａｓｌｏｃａｔｅｄａｔ－２４８－－５６.Ｉｔｗａｓｐｒｅｄｉｃ￣ｔｅｄｔｈａｔｔｈｅｃｏｒｅｐｒｏｍｏｔｅｒｒｅｇｉｏｎｏｆｂｏｖｉｎｅＬＡＴＳ２ｇｅｎｅｈａｄｂｉｎｄｉｎｇｓｉｔｅｓｏｆｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｓＴＥＡＤ１ꎬＭＥＦ２ＡꎬＦＯＳＬ１ꎬＭｙｏＧａｎｄＭｙｏｄ１ｒｅｌａｔｅｄｔｏｍｕｓｃｌｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ.ＩｔｓｈｏｗｅｄｔｈａｔＬＡＴＳ２ｇｅｎｅｐｌａｙｅｄａｎｉｍｐｏｒｔａｎｔｒｏｌｅｉｎｔｈｅｇｒｏｗｔｈａｎｄｄｅ￣ｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆｂｏｖｉｎｅｍｕｓｃｌｅ.Ｔｈｅａｂｏｖｅｒｅｓｕｌｔｓｌａｙａｆｏｕｎｄａｔｉｏｎｆｏｒｅｘｐｌｏｒｉｎｇｔｈｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆｂｏ￣ｖｉｎｅＬＡＴＳ２ｇｅｎｅｉｎｍｕｓｃｌｅｇｒｏｗｔｈａｎｄｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ.Ｋｅｙｗｏｒｄｓ:㊀ｃａｔｔｌｅꎻＬＡＴＳ２ｇｅｎｅꎻｔｉｓｓｕｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎꎻｐｒｏｍｏｔｅｒꎻｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ㊀㊀骨骼肌是动物躯体最重要的组成部分ꎬ其生长发育直接影响甚至决定家畜的产肉量ꎬ骨骼肌的生物学特性是衡量家畜潜在经济性能的标准[１]ꎬ另外ꎬ骨骼肌是动物体动作和能量代谢的主要参与者ꎬ在机体的代谢平衡维持中起十分重要的作用[２]ꎮ骨骼肌发生发育过程极其复杂精细ꎬ从静息肌卫星细胞的激活㊁成肌细胞的增殖分化ꎬ到肌纤维形成的终末阶段[３￣４]ꎬ全过程除了受遗传㊁环境及营养水平调控外ꎬ更多取决于基因的控制[５]ꎬ且细胞信号分子㊁转录因子㊁非编码ＲＮＡ等诸多调节因子精准地参与其中复杂的网络调控[６￣１１]ꎮ目前ꎬ为促进骨骼肌的生长发育以改善肉质从而实现肉牛的遗传改良ꎬ基因的功能鉴定和筛选已成为一种热门且有效的手段ꎮ哺乳动物中调节细胞生长的Ｈｉｐｐｏ信号通路十分保守ꎬ通过关键因子Ｓａｌｖａｄｏｒ１(Ｓａｖ１)㊁ＭＳＴ１/ＭＳＴ２㊁Ｙｅｐ等相关基因及大肿瘤抑制基因１/２(ＬＡＴＳ１/ＬＡＴＳ２)调控细胞的增殖㊁分化㊁凋亡以及干细胞的自我更新ꎬ从而实现对器官体积大小的控制[１２￣１３]ꎮＬＡＴＳ２基因作为Ｈｉｐｐｏ信号通路的核心成员之一ꎬ与通路中的其他关键因子共同调控动物体器官的生长发育ꎬ主要表现在影响心脏肌肉的发育[１４￣１５]ꎮ目前ꎬ关于ＬＡＴＳ２基因功能研究主要集中在其参与肿瘤细胞发生及调控细胞增殖的机理方面[１６￣１８]ꎬ但ＬＡＴＳ２基因对动物体骨骼肌生长发育中的调控有重要作用且研究较少ꎮ王利宏等[１９]㊁鲍建军等[２０]发现ＬＡＴＳ２基因多态性与湖羊肌肉生长发育有显著关联ꎬ同时还发现ＹＡＰ１基因在正常表型羊和双肌臀羊中的表达存在差异ꎬ且ＬＡＴＳ１/ＬＡＴＳ２基因可与ＹＡＰ１基因互作抑制肌肉生长发育[２１]ꎮ此外ꎬ我们前期研究发现ＬＡＴＳ１基因在牛背最长肌等多个组织中高表达ꎬ且其核心启动区结合了肌肉生长发育相关的Ｍｙｏｄ１和ＭＥＦ２Ａ转录因子并调控其转录活性ꎬ初步阐明了ＬＡＴＳ１基因参与牛的肌肉生长发育转录调控机制[２２]ꎮＬＡＴＳ２基因与ＬＡＴＳ１基因同属ＬＡＴＳ基因家族ꎬ其分子序列及结构相似ꎬ因此我们推测ＬＡＴＳ２在牛肌肉生长发育中扮演重要角色ꎬ但其转录机制不清ꎮ鉴于此ꎬ本研究拟构建ＬＡＴＳ２基因在牛不同肌肉组织或器官中的表达谱ꎬ克隆并鉴定其启动子核心区域ꎬ预测ＬＡＴＳ２基因启动子核心区域的关键转录因子ꎬ以期为探究牛ＬＡＴＳ２基因在肌肉生长发育过程中的转录调控机制奠定基础ꎮ１㊀材料与方法１.１㊀试验样品采集３头２０月龄秦川牛公牛的肝(右叶)㊁背最长肌㊁睾丸㊁肺(中叶)㊁肾(皮质)㊁皮下脂肪㊁心(心房)㊁皱胃(胃壁)㊁大肠(盲肠段)㊁脾(实质)和颈部静脉血样ꎬ迅速置于液氮带回实验室备用ꎮ１.２㊀主要试剂ｐＭＤ￣１９Ｔ(Ｓｉｍｐｌｅ)载体㊁ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＧＸＬＰｒｅｍｉｘ㊁基因组ＤＮＡ提取试剂盒㊁ＤＨ５α感受态细胞㊁ＤＮＡ凝胶回收试剂盒㊁限制性内切酶ＫｐｎⅠ和ＸｈｏⅠ㊁Ｔ４ＤＮＡ连接酶㊁ＲＮＡ提取试剂盒㊁反转录及荧光定量试剂均购自宝生物工程(大连)有限公司ꎻ去内毒质粒提取试剂盒购自ＯｍｅｇａＢｉｏ￣Ｔｅｋ公司ꎻＤｕａｌ￣Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ双荧光素酶报告系统购自普洛麦格(北京)生物技术有限公司ꎻＤＭＥＭ培养基㊁磷酸缓冲盐溶液(ＰＢＳ)㊁ＯＰＴＩ￣ＭＥＭ㊁Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００Ｒｅ￣ａｇｅｎｔ脂质体转染试剂盒及胎牛血清(ＦＢＳ)购自赛默飞世尔科技公司ꎻ双荧光检测试剂盒购自普洛麦格(北京)生物技术有限公司ꎻｐＧＬ３￣Ｂａｓｉｃ及ｐＲＬ￣４５７江苏农业学报㊀２０２３年第３９卷第３期ＴＫ载体㊁小鼠成肌细胞(Ｃ２Ｃ１２)和小鼠脂肪细胞(３Ｔ３￣Ｌ１)为本实验室保存ꎮ１.３㊀ＲＴ￣ｑＰＣＲ检测首先提取不同组织或器官总ＲＮＡꎬ并按照反转录试剂盒说明书将各个ＲＮＡ进行反转录ꎬ检测ｃＤ￣ＮＡ质量ꎮ利用Ｐｒｉｍｅｒ５.０软件设计ＲＴ￣ｑＰＣＲ引物ꎬ以ＧＡＰＤＨ作为内参基因(引物见表１)ꎬ使用７５００ＦａｓｔＲｅａｌＴｉｍｅ仪器(美国应用生物系统公司产品)进行定量ＰＣＲꎮ反应总体系为２０ ０μｌꎬ其中上/下游引物各０ ８μｌ(引物浓度为１０μｍｏｌ/Ｌ)㊁ｃＤＮＡ模板２ ０μｌ(模板质量浓度为５０ｎｇ/μｌ)㊁ＰｒｉｍｉｘＥｘＴａｑⅡ１０ ０μｌ㊁ＲＯＸＲｅｆｅｒｅｎｃｅＤｙｅⅡ０ ４μｌꎬ剩余用ｄｄＨ２Ｏ补齐ꎮＲＴ￣ｑＰＣＲ反应程序为:９５ħ预变性３０ｓꎻ９５ħ变性５ｓꎬ６０ħ退火３４ｓꎬ循环４０次ꎬ生物学重复３次ꎬ采用２－әәＣｔ法处理分析相对表达量数据[２３]ꎬ数据采用ＳＰＳＳ２０.０软件进行单因素差异性分析ꎮ１.４㊀生物信息学分析结合ＮＣＢＩ数据库(ｈｔｔｐｓ://ｗｗｗ.ｎｃｂｉ.ｎｌｍ.ｎｉｈ.ｇｏｖ)及ＵＣＳＣ(ｈｔｔｐｓ://ｇｅｎｏｍｅ.ｕｃｓｃ.ｅｄｕ/)网站参考牛基因组信息ꎬ确定ＬＡＴＳ２基因启动子区域ꎮ利用Ｕｎｉｐｒｏｔ(ｈｔｔｐｓ://ｗｗｗ.ｕｎｉｐｒｏｔ.ｏｒｇ/)和ＭＥＧＡ５.０(ｈｔ￣ｔｐｓ://ｗｗｗ.ｍｅｇａｓｏｆｔｗａｒｅ.ｎｅｔ/ｉｎｄｅｘ.ｐｈｐ)构建出ＬＡＴＳ２蛋白进化树ꎬ使用ＥｘｃｅｒｔＳｙＰｒｏｔＰａｒｍ(ｈｔ￣ｔｐｓ://ｗｅｂ.ｅｘｐａｓｙ.ｏｒｇ/ｐｒｏｔｐａｒａｍ/)在线程序进行蛋白质序列分析ꎬ使用Ｓｔｒｉｎｇ(ｈｔｔｐ://ｓｔｒｉｎｇ￣ｄｂ.ｏｒｇ/)预测与ＬＡＴＳ２蛋白互作的蛋白质ꎮ１.５㊀启动子克隆及逐段缺失片段扩增根据牛ＬＡＴＳ２基因启动子序列信息ꎬ设计其启动子全长扩增引物ＬＡＴＳ２￣ＰＦ/ＰＲ(表１)ꎬ引物长度为１９７２ｂｐꎬ包括－１７９２~＋１７９序列ꎮ以基因组ＤＮＡ为模板ꎬ参考ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＧＸＬＰｒｅｍｉｘ操作手册进行ＰＣＲꎬ总体系２０ ０μｌꎬ其中ꎬ４ ０μｌｄＮＴＰＭｉｘｔｕｒｅꎬ１０ ０μｌ２ˑＰｒｉｍｅＳＴＡＲＧＸＬＢｕｆｆｅｒꎬ上/下游引物各０ ８μｌ(浓度为１０μｍｏｌ/Ｌ)ꎬ１ ０μｌＰｒｉｍｅ￣ＳＴＡＲＧＸＬＤＮＡ聚合酶ꎬ底物１ ０μｌ(质量浓度为５０ｎｇ/μｌ)ꎬ２ ４μｌｄｄＨ２ＯꎮＰＣＲ扩增程序使用３步法:９８ħ１０ｓꎬ６０ħ２０ｓꎬ６８ħ１５ｓꎬ循环３５次ꎮＰＣＲ扩增产物用１％琼脂糖凝胶电泳检测ꎬ预期片段纯化回收后与ｐＭＤ￣１９Ｔ(Ｓｉｍｐｌｅ)载体连接ꎬ转化后筛选阳性克隆进行测序鉴定ꎮ根据测序结果ꎬ设计５ᶄ端逐段缺失片段的上游引物(Ｆ１~Ｆ７)和１条固定的下游引物(Ｒ)ꎬ在引物５ᶄ端添加ＫｐｎⅠ和ＸｈｏⅠ双酶切位点(表１)ꎬ以ＬＡＴＳ２基因－１７９２~＋１７９序列为模板进行缺失片段的ＰＣＲ扩增反应(扩增体系㊁程序同上)ꎬ将扩增片段分别连接ｐＭＤ￣１９Ｔ(Ｓｉｍｐｌｅ)载体进行测序鉴定ꎮ得到的逐段缺失片段分别命名为:ＬＡＴＳ２￣Ｐ１㊁ＬＡＴＳ２￣Ｐ２㊁ＬＡＴＳ２￣Ｐ３㊁ＬＡＴＳ２￣Ｐ４㊁ＬＡＴＳ２￣Ｐ５㊁ＬＡＴＳ２￣Ｐ６和ＬＡＴＳ２￣Ｐ７ꎮ表１㊀引物信息Ｔａｂｌｅ１㊀Ｐｒｉｍｅｒｓｕｓｅｄｉｎｔｈｅｓｅｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ项目㊀引物名称㊀㊀㊀引物序列(５ᶄң３ᶄ)退火温度(ħ)扩增片段长度(ｂｐ)扩增区域收录号荧光定量ＰＣＲＧＡＰＤＨ￣ＦＧＡＰＤＨ￣ＲＣＣＡＡＣＧＴＧＴＣＴＧＴＴＧＴＧＧＡＴＣＴＧＣＴＴＣＡＣＣＡＣＣＴＴＣＴＴＧＡ６０.０８０３２０~５２１ＮＭ＿００１０３４０３４.２ＬＡＴＳ２￣ＦＬＡＴＳ２￣ＲＡＧＧＡＣＧＧＣＡＧＴＧＡＧＧＡＣＡＧＣＧＣＡＴＣＧＧＡＡＣＧＧＧＴＧＡＣＣＡＴＴＧ６０.０１３１３２１３~３３４４ＸＭ＿０２５００００９２.１启动子区域克隆ＬＡＴＳ２￣ＰＦＬＡＴＳ２￣ＰＲＡＧＡＣＣＣＡＧＡＧＣＡＡＣＣＡＡＴＡＡＴＧＣＡＣＡＧＡＡＡＴＣＣＣＡＡＣＴＡＡＣＴ６５.５１９７２－１７９２~＋１７９ＮＣ＿０３７３３６.１ＬＡＴＳ２￣Ｆ１ＧＧＧＧＴＡＣＣＣＧＡＣＴＧＡＧＣＧＡＣＴＧＡＡＣＴＧＡＡＧ６１.０１９７２－１７９２~＋１７９ＮＣ＿０３７３３６.１ＬＡＴＳ２￣Ｆ２ＧＧＧＧＴＡＣＣＴＡＡＧＴＧＧＡＴＣＧＣＣＡＧＴＧＴＴＧＣ６０.５１６５５－１４７５~＋１７９ＮＣ＿０３７３３６.１ＬＡＴＳ２￣Ｆ３ＧＧＧＧＴＡＣＣＣＴＴＣＣＣＣＴＡＡＧＡＡＣＧＡＡＣＡＣＣＣ６１.５１２７８－１０９８~＋１７９ＮＣ＿０３７３３６.１ＬＡＴＳ２￣Ｆ４ＧＧＧＧＴＡＣＣＡＧＧＡＣＡＧＡＡＴＧＴＣＡＡＴＣＴＴＧＧＡＴ６４.０９０７－７２７~＋１７９ＮＣ＿０３７３３６.１ＬＡＴＳ２￣Ｆ５ＧＧＧＧＴＡＣＣＧＧＧＡＧＴＧＣＴＴＧＡＴＡＣＴＧＡＧＡＡ６２.５６９５－５１５~＋１７９ＮＣ＿０３７３３６.１ＬＡＴＳ２￣Ｆ６ＧＧＧＧＴＡＣＣＴＣＡＣＴＡＣＴＣＣＣＣＡＣＡＧＡＧＡＡＣ６０.０４２８－２４８~＋１７９ＮＣ＿０３７３３６.１ＬＡＴＳ２￣Ｆ７ＧＧＧＧＴＡＣＣＡＣＡＴＴＧＣＡＣＡＧＣＧＧＣＣＴＣＧＧ５９.５２３６－５６~＋１７９ＮＣ＿０３７３３６.１ＬＡＴＳ２￣ＲＣＣＧＣＴＣＧＡＧＧＣＡＣＡＧＡＡＡＴＣＣＣＡＡＣＴＡＡＣＴＮＣ＿０３７３３６.１Ｆ为上游引物ꎬＲ为下游引物ꎬ斜体碱基表示ＫｐｎⅠ(ＧＧＧＧＴＡＣＣ)和ＸｈｏⅠ(ＣＣＧＣＴＣＧＡＧ)酶切位点ꎮ５５７张久盘等:牛ＬＡＴＳ２基因启动子克隆及转录调控分析１.６㊀双荧光素报告载体构建使用内切酶ＫｐｎⅠ和ＸｈｏⅠ将ＬＡＴＳ２￣Ｐ１~ＬＡＴＳ２￣Ｐ７片段和ｐＧＬ３￣Ｂａｓｉｃ载体在３７ħ条件下酶切１ｈꎬ酶切完成后进行目的片段纯化回收ꎮ进一步将ＬＡＴＳ２￣Ｐ１~ＬＡＴＳ２￣Ｐ７片段分别和ｐＧＬ３￣Ｂａｓｉｃ载体用Ｔ４ＤＮＡ连接酶(１６ħ条件下)连接１ｈꎮ将产物转化至ＤＨ５α感受态细胞培养后筛选阳性克隆并鉴定ꎬ进一步使用去内毒质粒提取试剂盒提取质粒ꎬ备用ꎮ１.７㊀细胞培养、转染及测定酶活性复苏Ｃ２Ｃ１２和３Ｔ３￣Ｌ１ꎬ培养基为１０％胎牛血清(ＦＢＳ)＋９０％ＤＭＥＭ培养基ꎬ待其生长状态良好且密度达到７０％~８０％后进行传代培养ꎮ传代生长后选择形态良好的细胞进行２４孔板铺板ꎬ按照Ｌｉｐｏ￣ｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００Ｒｅａｇｅｎｔ脂质体转染试剂盒说明书ꎬ分别将构建好的双荧光素报告载体ＬＡＴＳ２￣ｐＧＬ３￣Ｐ１~ＬＡＴＳ２￣ｐＧＬ３￣Ｐ７８００ｎｇ重组质粒和２０ｎｇ内参质粒ｐＲＬ￣ＴＫ共转染至Ｃ２Ｃ１２和３Ｔ３￣Ｌ１ꎬ进行３次重复ꎬ阴性对照为ｐＧＬ３￣Ｂａｓｉｃ质粒ꎮ在转染４８ｈ后进行细胞收集ꎬ利用双荧光检测试剂盒进行荧光素酶和海肾荧光素酶活性测定ꎬ计算二者的比值ꎬ确定ＬＡＴＳ２基因的启动子核心区域ꎮ１.８㊀关键转录因子预测通过ＪＡＳＰＡＲ(ｈｔｔｐ://ｊａｓｐａｒ.ｇｅｎｅｒｅｇ.ｎｅｔ/)和Ｇｅｎｏｍａｔｉｘ(ｈｔｔｐ://ｗｗｗ.ｇｅｎｏｍａｔｉｘ.ｄｅ/ｃｇｉ￣ｂｉｎ//ｍａｔ￣ｉｎｓｐｅｃｔｏｒ)在线软件分析启动子核心区域序列ꎬ预测阈值设置为９０％以上ꎬ选取２个网站预测结果的共同部分ꎬ筛选ＬＡＴＳ２基因的启动子核心区域关键的转录因子结合位点ꎮ１.９㊀数据分析数据结果以平均值ʃ标准差表示ꎬ数据显著性检验使用ＳＰＳＳ１８.０软件进行单因素方差分析(Ｐ<０ ０１为差异极显著ꎻＰ<０ ０５为差异显著)ꎮ２㊀结果与分析２.１㊀ＬＡＴＳ２基因组织表达规律㊀㊀ＲＴ￣ｑＰＣＲ结果(图１)显示ꎬＬＡＴＳ２基因在肝㊁背最长肌㊁睾丸㊁肺㊁肾㊁皮下脂肪㊁心㊁皱胃㊁大肠和脾中均检测出表达信号ꎬ以脾中的表达量作为对照ꎬ该基因在肝和背最长肌中的表达极显著地高于脾(Ｐ<０ ０１)ꎬ其次在睾丸中高表达(Ｐ<０ ０５)ꎬ在肺㊁肾㊁皮下脂肪㊁心㊁皱胃㊁大肠和脾中表达量较低ꎮ∗表示差异显著(Ｐ<０ ０５)ꎻ∗∗表示差异极显著(Ｐ<０ ０１)ꎮ图１㊀ＬＡＴＳ２基因在牛不同组织或器官中的ｍＲＮＡ相对表达量Ｆｉｇ.１㊀ＴｈｅｒｅｌａｔｉｖｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＬＡＴＳ２ｇｅｎｅｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｔｉｓｓｕｅｓｏｒｏｒｇａｎｓｏｆｃａｔｔｌｅ２.２㊀牛ＬＡＴＳ２基因的结构特征及进化树构建ＬＡＴＳ２基因位于第１２号染色体ꎬ全长５１０９６ｂｐꎬ包括９个外显子和８个内含子ꎬ共转录３０４８ｂｐ的ｍＲＮＡ序列ꎬ可编码１０１５个氨基酸(图２)ꎬＬＡＴＳ２蛋白分子式为Ｃ４８８２Ｈ７６２８Ｎ１４１８Ｏ１４２５Ｓ３５ꎬ其相对分子质量为１１０１１０ꎬ等电点(ｐＩ)为８ ８４ꎮ㊀㊀以ＬＡＴＳ２蛋白序列为对象ꎬ利用ＭＥＧＡ５.０软件构建牛㊁绵羊㊁山羊㊁马㊁猪㊁小鼠等物种的系统进化树(图３)ꎮ构建出的系统进化树表明ＬＡＴＳ２蛋白在牛㊁绵羊㊁山羊㊁马㊁猪㊁小鼠等物种中进化较为保守ꎬ反刍动物在进化过程中单独聚为１支ꎬ上述结果表明ＬＡＴＳ２具有重要功能且在反刍动物进化过程中极度保守ꎮ２.３㊀牛ＬＡＴＳ２蛋白互作分析使用Ｓｔｒｉｎｇ(ｈｔｔｐ://ｓｔｒｉｎｇ￣ｄｂ.ｏｒｇ/)预测与ＬＡＴＳ２蛋白互作的蛋白质ꎬ得到图４所示的蛋白质互作网络ꎮ网络中与ＬＡＴＳ２蛋白互作紧密的前１０种蛋白质分别为ＹＡＰ１㊁ＭＯＢ１Ａ㊁ＭＯＢ１Ｂ㊁ＳＡＶ１㊁ＡＭＯＴＬ２㊁ＷＷＣ１㊁ＷＷＴＲ１㊁ＡＭＯＴ㊁ＡＭＯＴＬ１㊁ＮＦ２ꎬ分析其信息ꎬ与ＫＥＧＧ收录的Ｈｉｐｐｏ信号通路成员及Ｂｉｏｇｒｉｄ收录的与ＹＡＰ１互作的蛋白质进行比对后ꎬ发现筛选出的上述蛋白质均为Ｈｉｐｐｏ信号通路中的关键蛋白质ꎮ２.４㊀ＬＡＴＳ２基因启动子核心区域鉴定通过ＰＣＲ扩增到牛ＬＡＴＳ２基因启动子１.７ｋｂ序列ꎬ根据逐段缺失引物进行ＰＣＲ扩增ꎬ获得７个逐段缺失的ＬＡＴＳ２基因启动子片段(逐段缺失片段扩增电泳见图５)ꎮ进一步连接ｐＧＬ３￣Ｂａｓｉｃ载体ꎬ构建得到了逐段缺失重组质粒ꎬ将其命名为:ｐＬＡＴＳ２－１７９２~＋１７９㊁ｐＬＡＴＳ２－１４７５~＋１７９㊁ｐＬＡＴＳ２－１０９８~＋１７９㊁ｐＬＡＴＳ２６５７江苏农业学报㊀２０２３年第３９卷第３期图２㊀牛ＬＡＴＳ２基因结构示意图Ｆｉｇ.２㊀ＴｈｅｓｃｈｅｍａｔｉｃｄｉａｇｒａｍｏｆｂｏｖｉｎｅＬＡＴＳ２ｇｅｎｅｓｔｒｕｃｔｕｒｅ图３㊀基于牛ＬＡＴＳ２蛋白序列构建进化树Ｆｉｇ.３㊀ＥｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙｔｒｅｅｂａｓｅｄｏｎｂｏｖｉｎｅＬＡＴＳ２ｐｒｏｔｅｉｎｓｅｑｕｅｎｃｅ图４㊀牛ＬＡＴＳ２蛋白相互作用预测Ｆｉｇ.４㊀ＰｒｅｄｉｃｔｉｏｎｏｆｐｒｏｔｅｉｎｓｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇｗｉｔｈＬＡＴＳ２ｉｎｃａｔｔｌｅ－７２７~＋１７９㊁ｐＬＡＴＳ２－５１５~＋１７９㊁ｐＬＡＴＳ２－２４８~＋１７９和ｐＬＡＴＳ２－５６~＋１７９ꎮ测序鉴定后ꎬ使用Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００Ｒｅａｇｅｎｔ脂质体分别将ｐＧＬ３￣Ｂａｓｉｃ质粒和７个重Ｍ:ＤＬ４５００ＤＮＡｍａｒｋｅｒꎻ泳道１~７分别为ＬＡＴＳ２－１７９２~＋１７９㊁ＬＡＴＳ２－１４７５~＋１７９㊁ＬＡＴＳ２－１０９８~＋１７９㊁ＬＡＴＳ２－７２７~＋１７９㊁ＬＡＴＳ２－５１５~＋１７９㊁ＬＡＴＳ２－２４８~＋１７９㊁ＬＡＴＳ２－５６~＋１７９扩增片段电泳图ꎬ片段长度分别为１９７２ｂｐ㊁１６５５ｂｐ㊁１２７８ｂｐ㊁９０７ｂｐ㊁６９５ｂｐ㊁４２８ｂｐ㊁２３６ｂｐꎮ图５㊀牛ＬＡＴＳ２基因启动子逐段缺失片段扩增电泳图Ｆｉｇ.５㊀ＧｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓｏｆｂｏｖｉｎｅＬＡＴＳ２ｇｅｎｅｐｒｏｍｏｔｅｒ组质粒转染至３Ｔ３￣Ｌ１和Ｃ２Ｃ１２细胞系ꎬ检测启动子的活性ꎮ相对荧光素酶活性数值(图６)显示ꎬＬＡＴＳ２基因７５７张久盘等:牛ＬＡＴＳ２基因启动子克隆及转录调控分析启动子区域的１ ７ｋｂ序列在Ｃ２Ｃ１２和３Ｔ３￣Ｌ１细胞系中均有较高的转录活性ꎮ当缺失－１０９８~－７２７片段后ꎬｐＬＡＴＳ２－７２７~＋１７９较ｐＬＡＴＳ２－１０９８~＋１７９酶活性在Ｃ２Ｃ１２细胞系中显著下降(Ｐ<０ ０５)ꎻ进一步缺失启动子片段－２４８~－５６ꎬ发现ｐＬＡＴＳ２－５６~＋１７９较ｐＬＡＴＳ２－２４８~＋１７９酶活性在Ｃ２Ｃ１２和３Ｔ３￣Ｌ１细胞系中均极显著下降(Ｐ<０ ０１)ꎬ分别下降了７９ ４％和７５ ６％ꎮ上述研究结果表明ꎬＬＡＴＳ２基因启动子区域的１ ７ｋｂ序列活性较高ꎬ具备调控基因转录活性的功能ꎻ－２４８~－５６为ＬＡＴＳ２基因启动子核心区域ꎻＬＡＴＳ２基因在Ｃ２Ｃ１２细胞系的转录活性高于３Ｔ３￣Ｌ１ꎮ２.５㊀启动子核心区域的关键转录因子鉴定利用Ｇｅｎｏｍａｔｉｘ和ＪＡＳＰＡＲ软件对ＬＡＴＳ２基因启动子区和核心区域(－２４８~－５６)进行分析并对潜在的关键转录因子进行预测ꎬ结果(图７)显示ꎬＬＡＴＳ２基因启动子核心区域包含转录增强因子ＴＥＦ１(ＴＥＡＤ１)㊁肌肉细胞特异性增强因子２Ａ(ＭＥＦ２Ａ)㊁ＦＯＳ样抗原１(ＦＯＳＬ１)㊁肌细胞生成素(Ｍｙｏｇ)和生肌决定因子(Ｍｙｏｄ１)ꎬ初步推测转录因子ＴＥＡＤ１㊁ＭＥＦ２Ａ㊁ＦＯＳＬ１㊁Ｍｙｏｇ和Ｍｙｏｄ１可能对ＬＡＴＳ２基因的转录活性有重要的调控作用ꎮ左边为ＬＡＴＳ２基因启动子双荧光素逐段缺失片段示意图ꎬ右边为酶活性检测数值ꎮＬｕｃ表示双荧光素酶报告载体ꎮＣ２Ｃ１２表示小鼠成肌细胞ꎻ３Ｔ３￣Ｌ１表示小鼠脂肪细胞ꎮ∗表示差异显著(Ｐ<０ ０５)ꎻ∗∗表示差异极显著(Ｐ<０ ０１)ꎮ图６㊀ＬＡＴＳ２基因启动子核心区域缺失片段报告载体相对荧光素酶活性Ｆｉｇ.６㊀ＲｅｌａｔｉｖｅｌｕｃｉｆｅｒａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙｏｆＬＡＴＳ２ｇｅｎｅｃｏｒｅｐｒｏｍｏｔｅｒｄｅｌｅｔｉｏｎｆｒａｇｍｅｎｔｒｅｐｏｒｔｅｒｖｅｃｔｏｒ３㊀讨论骨骼肌是动物躯体最重要的组成部分ꎬ占胴体质量的４０％左右ꎬ其发育程度直接影响甚至决定家畜的产肉量ꎬＬＡＴＳ２基因对细胞的增殖㊁凋亡以及骨骼肌的形成有重要的调控作用ꎬ而调控机制并不清楚ꎮ已有文献报道ꎬＬＡＴＳ１基因[２１]㊁ＬＡＴＳ２基因[１９]与湖羊肌肉生长发育显著相关ꎮ因此ꎬ本试验开展了牛ＬＡＴＳ２基因有关研究ꎬ成功克隆了牛ＬＡＴＳ２基因启动子ꎬ检测了启动子活性并鉴定到启动子核心区域ꎬ预测到该基因启动子核心区域中的重要转录因子ꎬ为探究牛ＬＡＴＳ２基因在肌肉生长发育中的转录调控机制奠定基础ꎮ本研究中ꎬ牛ＬＡＴＳ２基因在肝㊁背最长肌㊁睾丸㊁肺㊁肾㊁皮下脂肪㊁心㊁皱胃㊁大肠和脾等不同组织或器官中均有表达ꎬ在肝中的表达量最高ꎬ背最长肌其次ꎬ在心㊁肺㊁皮下脂肪㊁肾㊁皱胃㊁大肠和脾等组织或器官中相对表达量较低ꎮ上述研究结果表明ＬＡＴＳ２基因在牛不同组织或器官中的相对表达量有差异ꎬ该基因的高表达可能影响肝以及肌肉组织的８５７江苏农业学报㊀２０２３年第３９卷第３期下划线为引物序列ꎬ方框表示相对应的转录因子结合位点ꎬ箭头指示转录起始位点ꎮＦＥＡＤ１:转录增强因子ＴＥＦ１ꎻＭＥＦ２Ａ:肌肉细胞特异性增强因子２ＡꎻＦＯＳＬ１:ＦＯＳ样抗原１ꎻＭｙｏｇ:肌细胞生成素ꎻＭｙｏｄ１:生肌决定因子ꎮ图７㊀牛ＬＡＴＳ２基因启动子核心区域的转录因子预测Ｆｉｇ.７㊀ＰｒｅｄｉｃｔｉｏｎｏｆｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｓｉｎｔｈｅｃｏｒｅｒｅｇｉｏｎｏｆｂｏｖｉｎｅＬＡＴＳ２ｇｅｎｅｐｒｏｍｏｔｅｒ正常发育ꎬ这同ＬＡＴＳ２基因表达量与湖羊肌肉生长发育显著相关[１９]的结果一致ꎮ系统进化树结果显示ꎬＬＡＴＳ２基因在反刍动物进化过程中保守性较高ꎻ预测出的前１０种互作蛋白质均为Ｈｉｐｐｏ信号通路中重要的转录调控因子ꎮＨｉｐｐｏ通路的核心是一个激酶级联反应ꎬ其中ꎬＳＡＶ１和ＭＯＢ１形成一种复合体并在细胞质中被磷酸化来调控ＬＡＴＳ１/２表达ꎬ待ＬＡＴＳ１/２被激活后ꎬ其激酶反过来去磷酸化并抑制转录共激活因子ＹＡＰ和ＴＡＺꎮ去磷酸化的ＹＡＰ/ＴＡＺ进入细胞核后与ＴＥＡＤ１￣４等多种转录因子发生互作ꎬ从而抑制凋亡的基因表达并诱导细胞增殖[２４￣２５]ꎮ研究发现ＬＡＴＳ１/２和Ｍｓｔ１/２可通过ＫＩＢＲＡ㊁ＮＦ２㊁ＲＡＳＳＦ等多种上游信号分子调控Ｈｉｐ￣ｐｏ信号通路的活性ꎬ如ＡＭＯＴ等因子通过结合ＬＡＴＳ１/２将ＹＡＰ/ＴＡＺ等因子紧密连接在细胞质中ꎬＹＡＰ/ＴＡＺ的磷酸化可进行细胞信号调控ꎮＹＡＰ/ＴＡＺ和ＬＡＴＳ１/２的稳定性可通过蛋白质泛素化进行调控[２６]ꎮ综上ꎬＬＡＴＳ２基因在细胞信号转导及细胞增殖分化中起重要作用ꎮ通过启动子逐段缺失载体活性检测ꎬ发现牛ＬＡＴＳ２基因启动子核心区域位于－２４８~－５６ꎬ进一步预测牛ＬＡＴＳ２基因启动子核心区域有ＴＥＡＤ１㊁ＭＥＦ２Ａ㊁ＦＯＳＬ１㊁Ｍｙｏｇ和Ｍｙｏｄ１等转录因子结合位点ꎮ研究结果表明ꎬＴＥＡＤ１可调控肌肉特异性基因ＴＮＮＴ２㊁Ｍｈｃ㊁α￣ａｃｔｉｎ[２７]和ＣＯＬ１Ａ１[２８]的表达ꎬ在心肌㊁骨骼肌㊁平滑肌的发育方面有至关重要的调控作用[２７￣２９]ꎮＴＥＡＤ１蛋白还可以与Ｈｉｐｐｏ信号通路中ＹＡＰ蛋白形成蛋白质复合物ꎬ从而抑制细胞增殖㊁促进细胞凋亡[３０]ꎮＭＥＦ２Ａ作为肌肉发生的重要核心因子ꎬ对骨骼肌和心肌细胞的增殖和分化有重要调控作用[３１]ꎬ同时能够促进生长因子㊁肌球蛋白重链及胶原对损伤骨骼肌的修复[３２]ꎻ该因子能够特异性识别并结合大多数肌肉基因启动子中的Ａ/Ｔ序列ꎬ从而增强相关基因的表达[３３]ꎮＦＯＳＬ１是转录因子ＡＰ￣１复合体的组分之一ꎬ参与细胞的增殖和分化ꎬ抑制细胞凋亡ꎬ可介导Ｋｒａｓ通路调控细胞周期蛋白质ꎬ诱导骨骼的发育[３４]ꎮＭｙｏｇ和Ｍｙｏｄ１作为调控肌肉细胞增殖㊁分化及肌纤维形成的关键基因[３５]ꎬ突变会显著影响肌肉纤维和肉质特性[３６]ꎮ其中ꎬＭｙｏｄ１对发育初级阶段肌肉的可塑性和再生起关键作用[３５]ꎬ当Ｍｙｏｄ１与ＰＡＸ７共表达时ꎬ可激活基底膜静息的肌肉卫星细胞使其增殖[３７]ꎻＭｙｏｇ通过调节肌肉肌酸激酶影响骨骼肌的发生发育[３８]ꎬ研究结果表明ꎬ敲除小鼠Ｍｙｏｇ基因后骨骼肌发育受损ꎬ出生后肌肉会出现萎缩现象[３９]ꎮ以上研究结果表明ꎬＴＥＡＤ１㊁ＭＥＦ２Ａ㊁ＦＯＳＬ１㊁Ｍｙｏｇ和Ｍｙｏｄ１转录因子在个体生长发育以及肌肉形成过程中起重要作用ꎬ结合本研究关于转录因子结合位点的预测ꎬ我们可以推断出上述５种转录因子对ＬＡＴＳ２基因的转录可能起重要调控作用ꎮ但对于这一推断将来还需要结合定点突变㊁凝胶迁移(ＥＭＳＡ)㊁染色质免疫共沉淀(ＣｈＩＰ)等技术手段进行深入研究ꎮ４㊀结论牛ＬＡＴＳ２基因启动子核心区域位于－２４８~－５６ꎬ启动子核心区域预测到ＴＥＡＤ１㊁ＭＥＦ２Ａ㊁９５７张久盘等:牛ＬＡＴＳ２基因启动子克隆及转录调控分析ＦＯＳＬ１㊁Ｍｙｏｇ和Ｍｙｏｄ１转录因子结合位点ꎮＬＡＴＳ２基因的组织表达规律㊁启动子核心区域的转录因子结合位点预测及ＬＡＴＳ２蛋白互作分析结果均表明ＬＡＴＳ２基因在牛肌肉生长发育中扮演重要角色ꎮ以上结果为探究牛ＬＡＴＳ２基因在肌肉生长发育中的转录调控机制奠定基础ꎮ参考文献:[１]㊀ＢＥＲＲＹＤＰꎬＷＡＬＬＥꎬＰＲＹＣＥＪＥ.Ｇｅｎｅｔｉｃｓａｎｄｇｅｎｏｍｉｃｓｏｆｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅｉｎｄａｉｒｙａｎｄｂｅｅｆｃａｔｔｌｅ[Ｊ].Ａｎｉｍａｌ:ＡｎＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＪｏｕｒｎａｌｏｆＡｎｉｍａｌＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅꎬ２０１４ꎬ８(１):１０５￣１２１. [２]㊀ＨＪＯＲＴＨＭꎬＰＯＵＲＴＥＹＭＯＵＲＳꎬＧÖＲＧＥＮＳＳＷꎬｅｔａｌ.Ｍｙｏ￣ｓｔａｔｉｎｉｎｒｅｌａｔｉｏｎｔｏｐｈｙｓｉｃａｌａｃｔｉｖｉｔｙａｎｄｄｙｓｇｌｙｃａｅｍｉａａｎｄｉｔｓｅｆｆｅｃｔｏｎｅｎｅｒｇｙｍｅｔａｂｏｌｉｓｍｉｎｈｕｍａｎｓｋｅｌｅｔａｌｍｕｓｃｌｅｃｅｌｌ[Ｊ].ＡｃｔａＰｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａꎬ２０１６ꎬ２１７(１):４５￣６０.[３]㊀ＦＲＯＮＴＥＲＡＷＲꎬＯＣＨＡＬＡＪ.Ｓｋｅｌｅｔａｌｍｕｓｃｌｅ:ａｂｒｉｅｆｒｅｖｉｅｗｏｆｓｔｒｕｃｔｕｒｅａｎｄｆｕｎｃｔｉｏｎ[Ｊ].ＣａｌｃｉｆｉｅｄＴｉｓｓｕｅＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌꎬ２０１５ꎬ９６(３):１８３￣１９５.[４]㊀ＴＡＪＢＡＫＨＳＨＳ.Ｓｋｅｌｅｔａｌｍｕｓｃｌｅｓｔｅｍｃｅｌｌｓｉｎｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌｖｅｒ￣ｓｕｓｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅｍｙｏｇｅｎｅｓｉｓ[Ｊ].ＪｏｕｒｎａｌｏｆＩｎｔｅｒｎａｌＭｅｄｉｃｉｎｅꎬ２００９ꎬ２６６(４):３７２￣３８９.[５]㊀ＢＯＵＫＨＡＡꎬＢＯＮＦＡＴＴＩＶꎬＣＥＣＣＨＩＮＡＴＯＡꎬｅｔａｌ.Ｇｅｎｅｔｉｃｐａ￣ｒａｍｅｔｅｒｓｏｆｃａｒｃａｓｓａｎｄｍｅａｔｑｕａｌｉｔｙｔｒａｉｔｓｏｆｄｏｕｂｌｅｍｕｓｃｌｅｄＰｉ￣ｅｍｏｎｔｅｓｅｃａｔｔｌｅ[Ｊ].ＭｅａｔＳｃｉｅｎｃｅꎬ２０１１ꎬ８９(１):８４￣９０. [６]㊀ＷＥＩＤＷꎬＦＥＮＧＬＳꎬＺＨＡＮＧＷＺꎬｅｔａｌ.ＣｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｐｒｏｍｏｔｅｒｒｅｇｉｏｎｏｆｂｏｖｉｎｅＳＩＸ４:ｒｏｌｅｓｏｆＥ￣ｂｏｘａｎｄＭｙｏＤｉｎｔｈｅｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｂａｓａｌｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ[Ｊ].ＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌａｎｄＢｉｏｐｈｙｓｉ￣ｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈＣｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓꎬ２０１８ꎬ４９６(１):４４￣５０. [７]㊀ＷＥＩＤＷꎬＭＡＸＹꎬＺＨＡＮＧＳꎬｅｔａｌ.ＣｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｐｒｏｍｏｔｅｒｒｅｇｉｏｎｏｆｔｈｅｂｏｖｉｎｅＳＩＸ１ｇｅｎｅ:ｒｏｌｅｓｏｆＭｙｏＤꎬＰＡＸ７ꎬＣＲＥＢａｎｄＭｙｏＧ[Ｊ].ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＲｅｐｏｒｔｓꎬ２０１７ꎬ７(１).ＤＯＩ:１０.１０３８/Ｓ４１５９８￣０１７￣１２７８７￣５.[８]㊀ＷＥＩＤＷꎬＧＵＩＬＳꎬＲＡＺＡＳＨＡꎬｅｔａｌ.ＮＲＦ１ａｎｄＺＳＣＡＮ１０ｂｉｎｄｔｏｔｈｅｐｒｏｍｏｔｅｒｒｅｇｉｏｎｏｆｔｈｅＳＩＸ１ｇｅｎｅａｎｄｔｈｅｉｒｅｆｆｅｃｔｓｂｏｄｙｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓｉｎＱｉｎｃｈｕａｎｃａｔｔｌｅ[Ｊ].ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＲｅｐｏｒｔｓꎬ２０１７ꎬ７(１).ＤＯＩ:１０.１０３８/Ｓ４１５９８￣０１７￣０８３８４￣１.[９]㊀ＲＡＺＡＳＨＡꎬＫＡＳＴＥＲＮꎬＫＨＡＮＲꎬｅｔａｌ.ＴｈｅｒｏｌｅｏｆｍｉｃｒｏＲ￣ＮＡｓｉｎｍｕｓｃｌｅｔｉｓｓｕｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｉｎｂｅｅｆｃａｔｔｌｅ[Ｊ].Ｇｅｎｅｓꎬ２０２０ꎬ１１(３).ＤＯＩ:１０.３３９０/ｇｅｎｅｓ１１０３０２９５.[１０]ＹＵＥＢＬꎬＬＩＨꎬＬＩＵＭꎬｅｔａｌ.ＣｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｌｎｃＲＮＡ￣ｍｉＲ￣ＮＡ￣ｍＲＮＡｎｅｔｗｏｒｋｔｏｒｅｖｅａｌｐｏｔｅｎｔｉａｌｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｃｅＲＮＡｓｉｎｂｏｖｉｎｅｓｋｅｌｅｔａｌｍｕｓｃｌｅ[Ｊ].ＦｒｏｎｔｉｅｒｓｉｎＧｅｎｅｔｉｃｓꎬ２０１９ꎬ１０.ＤＯＩ:１０.３３８９/ｆｇｅｎｅ.２０１９.０００９１.[１１]ＦＵＹＹꎬＬＩＳꎬＴＯＮＧＨＬꎬｅｔａｌ.ＷＤＲ１３ｐｒｏｍｏｔｅｓｔｈｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉ￣ａｔｉｏｎｏｆｂｏｖｉｎｅｓｋｅｌｅｔａｌｍｕｓｃｌｅ￣ｄｅｒｉｖｅｄｓａｔｅｌｌｉｔｅｃｅｌｌｓｂｙａｆｆｅｃｔｉｎｇＰＩ３Ｋ/ＡＫＴｓｉｇｎａｌｉｎｇ[Ｊ].ＣｅｌｌＢｉｏｌｏｇｙＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌꎬ２０１９ꎬ４３(７):７９９￣８０８.[１２]ＬＩＡＮＬꎬＫＩＭＪꎬＯＫＡＺＡＷＡＨꎬｅｔａｌ.ＴｈｅｒｏｌｅｏｆＹＡＰｔｒａｎｓｃｒｉｐ￣ｔｉｏｎｃｏａｃｔｉｖａｔｏｒｉｎｒｅｇｕｌａｔｉｎｇｓｔｅｍｃｅｌｌｓｅｌｆ￣ｒｅｎｅｗａｌａｎｄｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａ￣ｔｉｏｎ[Ｊ].Ｇｅｎｅｓ＆Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔꎬ２０１０ꎬ２４(１１):１１０６￣１１１８. [１３]ＺＨＡＮＧＬꎬＹＵＥＴꎬＪＩＡＮＧＪ.Ｈｉｐｐｏｓｉｇｎａｌｉｎｇｐａｔｈｗａｙａｎｄｏｒｇａｎｓｉｚｅｃｏｎｔｒｏｌ[Ｊ].Ｆｌｙ(Ａｕｓｔｉｎ)ꎬ２００９ꎬ３(１):６８￣７３.[１４]ＹＩＪꎬＬＵＬꎬＹＡＮＧＥＲＫꎬｅｔａｌ.Ｌａｒｇｅｔｕｍｏｒｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒｈｏｍｏｌｏｇｓ１ａｎｄ２ｒｅｇｕｌａｔｅｍｏｕｓｅｌｉｖｅｒｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｃｅｌｌｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎａｎｄｍａｔｕ￣ｒａｔｉｏｎｔｈｒｏｕｇｈａｎｔａｇｏｎｉｓｍｏｆｔｈｅｃｏａｃｔｉｖａｔｏｒｓＹＡＰａｎｄＴＡＺ[Ｊ].Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙꎬ２０１６ꎬ６４(５):１７５７￣１７７２.[１５]ＦＵＲＴＨＮꎬＡＹＬＯＮＹ.ＴｈｅＬＡＴＳ１ａｎｄＬＡＴＳ２ｔｕｍｏｒｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒｓ:ｂｅｙｏｎｄｔｈｅＨｉｐｐｏｐａｔｈｗａｙ[Ｊ].ＣｅｌｌＤｅａｔｈ＆Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎꎬ２０１７ꎬ２４(９):１４８８￣１５０１.[１６]姚春和ꎬ张荣.ｍｉＲ￣３７２靶向ＬＡＴＳ２对结肠癌ＳＷ６２０细胞增殖㊁迁移侵袭的影响[Ｊ].广西医科大学学报ꎬ２０２１ꎬ３８(１０):１９０６￣１９１１.[１７]ＭＣＮＥＩＬＬＨꎬＲＥＧＩＮＥＮＳＩＡ.Ｌａｔｓ１/２ｒｅｇｕｌａｔｅＹａｐ/Ｔａｚｔｏｃｏｎｔｒｏｌｎｅｐｈｒｏｎｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｉｚａｔｉｏｎａｎｄｉｎｈｉｂｉｔｍｙｏｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｆｏｒ￣ｍａｔｉｏｎ[Ｊ].ＪｏｕｒｎａｌｏｆｔｈｅＡｍｅｒｉｃａｎＳｏｃｉｅｔｙｏｆＮｅｐｈｒｏｌｏｇｙꎬ２０１７ꎬ２８(３):８５２￣８６１.[１８]冯瑞军ꎬ郑远航ꎬ盛智梅.外泌体ｍｉＲ￣５７４￣５Ｐ通过下调大肿瘤抑制基因２促进胶质瘤增殖㊁侵袭和迁移[Ｊ].中国生物化学与分子生物学报ꎬ２０２１ꎬ３８(１１):１５２０￣１５２７.[１９]王利宏ꎬ王庆增ꎬ鲍建军ꎬ等.Ｈｉｐｐｏ信号通道中Ｌａｔｓ２基因表达与湖羊肌肉生长发育的关系[Ｊ].南京农业大学学报ꎬ２０１８ꎬ４１(３):５１９￣５２５.[２０]鲍建军ꎬ苏㊀锐ꎬ王庆增ꎬ等.Ｓｍａｄｓ与Ｈｉｐｐｏ通道中ＹＡＰ１基因在湖羊肌肉组织中时空表达研究及关联分析[Ｊ].中国农业科学ꎬ２０１６ꎬ４９(１１):２２０３￣２２１３.[２１]张玉龙.Ｈｉｐｐｏ信号通道中Ｌａｔｓ１基因对湖羊肌肉生长性状遗传调控的初步研究[Ｄ].扬州:扬州大学ꎬ２０１３.[２２]ＷＥＩＤꎬＲＡＺＡＳＨＡꎬＷＡＮＧＸꎬｅｔａｌ.Ｔｉｓｓｕｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎａｌｙ￣ｓｉｓꎬｃｌｏｎｉｎｇꎬａｎｄｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｔｈｅ５ᶄ￣ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙｒｅｇｉｏｎｏｆｔｈｅｂｏｖｉｎｅＬＡＴＳ１ｇｅｎｅ[Ｊ].ＦｒｏｎｔｉｅｒｓｉｎＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＳｃｉｅｎｃｅꎬ２０２２ꎬ９.ＤＯＩ:１０.３３８９/ｆｖｅｔｓ.２０２２.８５３８１９.[２３]ＬＩＶＡＫＫＪꎬＳＣＨＭＩＴＴＧＥＮＴＤ.Ａｎａｌｙｓｉｓｏｆｒｅｌａｔｉｖｅｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓ￣ｓｉｏｎｄａｔａｕｓｉｎｇｒｅａｌ￣ｔｉｍｅｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅＰＣＲａｎｄｔｈｅ２－әәＣｔｍｅｔｈｏｄ[Ｊ].Ｍｅｔｈｏｄｓꎬ２００１ꎬ２５(４):４０２￣４０８.[２４]ＢＡＤＯＵＥＬＣꎬＭＣＮＥＩＬＬＨ.ＳｎａｐＳｈｏｔ:ｔｈｅｈｉｐｐｏｓｉｇｎａｌｉｎｇｐａｔｈ￣ｗａｙ[Ｊ].Ｃｅｌｌꎬ２０１１ꎬ１４５(３).ＤＯＩ:１０.１０１６/ｊ.ｃｅｌｌ.２０１１.０４.００９. [２５]ＺＨＡＯＢꎬＴＵＭＡＮＥＮＧＫꎬＧＵＡＮＫＬ.Ｔｈｅｈｉｐｐｏｐａｔｈｗａｙｉｎｏｒ￣ｇａｎｓｉｚｅｃｏｎｔｒｏｌꎬｔｉｓｓｕｅｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎａｎｄｓｔｅｍｃｅｌｌｓｅｌｆ￣ｒｅｎｅｗａｌ[Ｊ].ＮａｔｕｒｅＣｅｌｌＢｉｏｌｏｇｙꎬ２０１１ꎬ１３(８):８７７￣８８３.[２６]ＯᶄＨＡＹＲＥＭꎬＤＥＧＥＳＥＭＳꎬＧＵＴＫＩＮＤＪＳ.ＮｏｖｅｌｉｎｓｉｇｈｔｓｉｎｔｏＧｐｒｏｔｅｉｎａｎｄＧｐｒｏｔｅｉｎ￣ｃｏｕｐｌｅｄｒｅｃｅｐｔｏｒｓｉｇｎａｌｉｎｇｉｎｃａｎｃｅｒ[Ｊ].ＣｕｒｒｅｎｔＯｐｉｎｉｏｎｉｎＣｅｌｌＢｉｏｌｏｇｙꎬ２０１４ꎬ２７:１２６￣１３５.[２７]ＬＩＵＦꎬＷＡＮＧＸꎬＨＵＧꎬｅｔａｌ.ＴｈｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒＴＥＡＤ１ｒｅｐｒｅｓｓｅｓｓｍｏｏｔｈｍｕｓｃｌｅ￣ｓｐｅｃｉｆｉｃｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｂｙａｂｏｌｉｓｈｉｎｇｍｙｏｃａｒｄｉｎｆｕｎｃｔｉｏｎ[Ｊ].ＴｈｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙꎬ２０１４ꎬ２８９(６):３３０８￣３３１６.[２８]ＡＭＢＲＯＳＩＮＯＣꎬＩＷＡＴＡＴꎬＳＣＡＦＯＧＬＩＯＣꎬｅｔａｌ.ＴＥＦ￣１ａｎｄＣ/ＥＢＰβａｒｅｍａｊｏｒｐ３８αＭＡＰＫ￣ｒｅｇｕｌａｔｅｄｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｓｉｎ０６７江苏农业学报㊀２０２３年第３９卷第３期ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ[Ｊ].ＴｈｅＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＪｏｕｒｎａｌꎬ２００６ꎬ３９６(１):１６３￣１７２.[２９]ＷＥＮＴꎬＬＩＵＪＨꎬＨＥＸＱꎬｅｔａｌ.ＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒＴＥＡＤ１ｉｓｅｓｓｅｎｔｉａｌｆｏｒｖａｓｃｕｌａｒｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｂｙｐｒｏｍｏｔｉｎｇｖａｓｃｕｌａｒｓｍｏｏｔｈｍｕｓｃｌｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ[Ｊ].ＣｅｌｌＤｅａｔｈ＆Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎꎬ２０１９ꎬ２６(１２):２７９０￣２８０６.[３０]ＨＵＲＡＳＫＩＮＤꎬＥＩＢＥＲＮꎬＲＥＩＣＨＥＬＭꎬｅｔａｌ.Ｗｎｔ/β￣ｃａｔｅｎｉｎｓｉｇｎａｌｉｎｇｖｉａＡｘｉｎ２ｉｓｒｅｑｕｉｒｅｄｆｏｒｍｙｏｇｅｎｅｓｉｓａｎｄꎬｔｏｇｅｔｈｅｒｗｉｔｈＹＡＰ/ＴａｚａｎｄＴｅａｄ１ꎬａｃｔｉｖｅｉｎＩＩａ/ＩＩｘｍｕｓｃｌｅｆｉｂｅｒｓ[Ｊ].Ｄｅｖｅｌｏｐ￣ｍｅｎｔꎬ２０１６ꎬ１４３(１７):３１２８￣３１４２.[３１]ＮＩＮＧＬꎬＮＥＬＳＯＮＢＲꎬＢＥＺＰＲＯＺＶＡＮＮＡＹＡＳꎬｅｔａｌ.Ｒｅｑｕｉｒｅ￣ｍｅｎｔｏｆＭＥＦ２ＡꎬＣꎬａｎｄＤｆｏｒｓｋｅｌｅｔａｌｍｕｓｃｌｅｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ[Ｊ].ＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓｏｆｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓｏｆｔｈｅＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓｏｆＡｍｅｒｉｃａꎬ２０１４ꎬ１１１(１１):４１０９￣４１１４.[３２]ＳＣＨＩＡＦＦＩＮＯＳꎬＤＹＡＲＫＡꎬＣＡＬＡＢＲＩＡＥ.ＳｋｅｌｅｔａｌｍｕｓｃｌｅｍａｓｓｉｓｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄｂｙｔｈｅＭＲＦ４￣ＭＥＦ２ａｘｉｓ[Ｊ].ＣｕｒｒｅｎｔＯｐｉｎｉｏｎｉｎＣｌｉｎｉｃａｌＮｕｔｒｉｔｉｏｎａｎｄＭｅｔａｂｏｌｉｃＣａｒｅꎬ２０１８ꎬ２１(３):１６４￣１６７. [３３]ＴＡＹＬＯＲＭＶꎬＨＵＧＨＥＳＳＭ.Ｍｅｆ２ａｎｄｔｈｅｓｋｅｌｅｔａｌｍｕｓｃｌｅｄｉｆ￣ｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｐｒｏｇｒａｍ[Ｊ].ＳｅｍｉｎａｒｓｉｎＣｅｌｌ＆ＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌＢｉｏｌｏ￣ｇｙꎬ２０１７ꎬ７２:３３￣４４.[３４]ＶＡＬＬＥＪＯＡꎬＰＥＲＵＲＥＮＡＮꎬＧＵＲＵＣＥＡＧＡＥꎬｅｔａｌ.Ａｎｉｎｔｅ￣ｇｒａｔｉｖｅａｐｐｒｏａｃｈｕｎｖｅｉｌｓＦＯＳＬ１ａｓａｎｏｎｃｏｇｅｎｅｖｕｌｎｅｒａｂｉｌｉｔｙｉｎＫＲＡＳ￣ｄｒｉｖｅｎｌｕｎｇａｎｄｐａｎｃｒｅａｔｉｃｃａｎｃｅｒ[Ｊ].ＮａｔｕｒｅＣｏｍｍｕｎｉｃａ￣ｔｉｏｎｓꎬ２０１７ꎬ８.ＤＯＩ:１０.１０３８/ｎｃｏｍｍｓ１４２９４.[３５]ＺＡＭＭＩＴＰＳ.ＦｕｎｃｔｉｏｎｏｆｔｈｅｍｙｏｇｅｎｉｃｒｅｇｕｌａｔｏｒｙｆａｃｔｏｒｓＭｙｆ５ꎬＭｙｏＤꎬＭｙｏｇｅｎｉｎａｎｄＭＲＦ４ｉｎｓｋｅｌｅｔａｌｍｕｓｃｌｅꎬｓａｔｅｌｌｉｔｅｃｅｌｌｓａｎｄｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅｍｙｏｇｅｎｅｓｉｓ[Ｊ].ＳｅｍｉｎａｒｓｉｎＣｅｌｌ＆ＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌＢｉｏｌｏｇｙꎬ２０１７ꎬ７２:１９￣３２.[３６]ＣＯＬＥＳＣＡꎬＷＡＤＥＳＯＮＪꎬＬＥＹＴＯＮＣＰꎬｅｔａｌ.Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｒａｔｅｓｏｆｂｏｖｉｎｅｐｒｉｍａｒｙｍｕｓｃｌｅｃｅｌｌｓｒｅｌａｔｅｔｏｌｉｖｅｗｅｉｇｈｔａｎｄｃａｒｃａｓｅｗｅｉｇｈｔｉｎｃａｔｔｌｅ[Ｊ].ＰＬｏＳＯｎｅꎬ２０１５ꎬ１０(４).ＤＯＩ:１０.１３７１/ｊｏｕｒ￣ｎａｌ.ｐｏｎｅ.０１２４４６８.[３７]ＢＵＣＫＩＮＧＨＡＭＭꎬＲＩＧＢＹＰＷ.Ｇｅｎｅｒｅｇｕｌａｔｏｒｙｎｅｔｗｏｒｋｓａｎｄｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｍｅｃｈａｎｉｓｍｓｔｈａｔｃｏｎｔｒｏｌｍｙｏｇｅｎｅｓｉｓ[Ｊ].Ｄｅｖｅｌｏｐ￣ｍｅｎｔａｌＣｅｌｌꎬ２０１４ꎬ２８(３):２２５￣２３８.[３８]ＸＵＤＱꎬＷＡＮＧＬꎬＪＩＡＮＧＺＺꎬｅｔａｌ.ＡｎｅｗｈｙｐｏｇｌｙｃｅｍｉｃｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆｃａｔａｌｐｏｌｒｅｖｅａｌｅｄｂｙｅｎｈａｎｃｉｎｇＭｙｏＤ/ＭｙｏＧ￣ｍｅｄｉａ￣ｔｅｄｍｙｏｇｅｎｅｓｉｓ[Ｊ].ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓꎬ２０１８ꎬ２０９:３１３￣３２３. [３９]ＢＯＤＩＮＥＳＣꎬＬＡＴＲＥＳＥꎬＢＡＵＭＨＵＥＴＥＲＳꎬｅｔａｌ.Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａ￣ｔｉｏｎｏｆｕｂｉｑｕｉｔｉｎｌｉｇａｓｅｓｒｅｑｕｉｒｅｄｆｏｒｓｋｅｌｅｔａｌｍｕｓｃｌｅａｔｒｏｐｈｙ[Ｊ].Ｓｃｉｅｎｃｅꎬ２００１ꎬ２９４(５５４７):１７０４￣１７０８.(责任编辑:陈海霞)１６７张久盘等:牛ＬＡＴＳ２基因启动子克隆及转录调控分析。

基因检测分析流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。

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干货7个步骤教你找到启动子
作者：解螺旋·子非鱼
如需转载请注明来源：解螺旋·医生科研助手
导语
看到一大串密码一样的序列，要怎么找出启动子呢？其实很简单，也就7步，跟着小鱼做就行。

师弟对着电脑上的一大串序列发呆，小鱼问道，“师弟，你这是在格物致知吗？”
“没有啦，我在想怎么把这个基因启动子找出来。

”
“试试用Map viewer吧！”
下面小鱼就以人的K-RAS基因为例讲述一下找基因启动子序列的具体操作步骤:
1.打开NCBI的Map viewer页面，
/mapview/index.html
2.点击“GO”出现如下页面：
3.出现下图，RAS参考序列给出了两个，序列有微小的差异，但总体来说基本相同。

现在普遍采用的是“reference”那个序列。

4.点击上述两条序列第一条序列（即12 reference）对应的“Genes seq”，出现新的页面，点击下图出现的“Download/ViewSequence/Evidence ”，即可下载查看序列等功能。

5.出现的页面提示K-ras基因在染色体上的位置：
6.因为启动子一般在-2000~+200区域，把页面中的参数修改一下：
7.那么就得到K-ras的启动子区域，如下图：。

ＰＩ１３跹豢藏第毛…如ｗｗｗ．ｐｉｂｂ．ａｃ．ｃｎＲｅＳｅａｒＣｈＰａｐｅｒＳ研究快报人￡ＣＲＧｊ基因启动子的鉴定与初步分析木谢海龙，）”陈主初２）李金花・’（１）南华大学肿瘤研究所，衡阳４２１００ｌ：２）中南大学肿瘤研究所，长沙４１００７８）摘要却ｇｅａｌｃａｒｃｉｎｏ眦ｒｅｌａｔｅｄｇｅｎｅ１（Ｌｃ尺ＧＪ）是一个喉癌候选抑瘤基因，为进一步深入研究其转录调控机制，应用５’ＲＡｃＥ技术确定了该基凼的转录起始位点，然后在对人￡ｃＲＧＪ基因进行生物信息学分析的基础上，通过ＰｃＲ定向克隆和酶切业克隆策略，构建了１１种含不同长度ＬｃＲＧＪ启动子荧光素酶报告基凶重组体．启动子活性分析表明，一１６９～＋１２７区域的启动子活性最高．研究提示，ＬｃＲＧＪ基因转录所必需的基因启动子序列在一１６９～＋１２７范围内．关键词￡ｃ尺ＧＪ，喉癌，启动子，转录调控学科分类号Ｑ７４喉癌是严重危害人类健康的恶性肿瘤，是由遗传和环境等诸多因素相互作用所致，涉及到大量相关基因结构和表达调控的改变，尤其是瘤基因的活化和抑瘤基因的失活起到关键性作用，但喉癌发病的分子机制至今仍不清楚【Ｉ，２Ｊ．因而分离和鉴定与喉癌发病相关的基因将是阐明其癌变机制与易感性的关键，对其临床诊断和治疗也有较重要的意义．我们在２０００年采用ｍＲＮＡ差异显示和ｃＤＮＡ文库筛选技术，克隆了在喉癌组织中表达下调新基因￡ＣＲＧＪｆ（ＧｅｌｌＢａｌｌｋ登录号为Ａｆ２６８３８７）【３卅．将￡ｃＲＧＪ基因转染到喉癌细胞Ｈｅｐ．２中，发现￡Ｃ兄ＧＪ能显著抑制移植瘤的生长同．研究发现，Ｌ积ＧＪ表达水平的改变是喉癌发病的重要因素，而￡ＣＲＧＪ『转录调控的机制目前尚不清楚．因此，本研究利用５，ＲＡＣＥ确定￡衄Ｇ，转录起始位点，克隆人己ｃ尺ＧＪ『基因５７调控区并对其功能进行了初步分析．１材料与方法１．１材料ＣＯＳ７细胞株购自美国ＡＴＣＣ公司；人肝癌细胞７７２ｌ为本实验室保存；ＤＭＥＭ、胎牛血清购自Ｈｙｃｌｏｎｅ公司；Ｔａ勋ＲａＬＡＴａｑ。

基因启动子分析范文基因启动子的分析方法主要有两种：实验方法和计算方法。

实验方法包括DNA酶切、染色质免疫沉淀、荧光素酶报告等技术，可以直接测定基因启动子的功能。

计算方法则通过对DNA序列进行计算和预测，识别潜在的启动子序列。

在这两种方法中，计算方法在大规模基因组分析中更具优势，能够有效筛选出候选的启动子序列。

基因启动子分析的重要性在于深入研究基因调控机制。

通过对启动子序列的研究，可以预测转录因子结合位点，即调控基因表达的关键位点。

这些转录因子位点在启动子中起着核心的调控作用，可以确定基因的表达模式和组织特异性。

此外，基因启动子分析也可以预测启动子的甲基化程度，甲基化是一种常见的基因调控机制，通过甲基化可以调控基因的表达水平。

因此，基因启动子分析对于了解基因调控机制具有重要意义。

基因启动子分析还可以用于预测转录启动位点。

转录启动位点是指RNA聚合酶在启动子上结合并开始转录的位置，它和基因的结构以及转录机制密切相关。

通过基因启动子分析，可以预测转录启动位点，并进一步研究基因的表达调控。

此外，基因启动子分析还可以揭示启动子序列的保守性，即在不同物种中启动子序列的相似性。

这种保守性通常表示该启动子在不同物种中具有重要的功能，在进化过程中得到保留。

基因启动子分析的应用广泛。

在医学研究中，基因启动子分析可以用于疾病基因的筛选和诊断。

通过比较病患与正常人的基因启动子序列差异，可以发现可能与疾病相关的启动子突变或甲基化位点。

在生物工程领域，基因启动子分析可以用于合成生物学研究中的基因调控。

通过预测和设计基因启动子序列，可以实现对目标基因的精确调控，从而提高产物的产量和纯度。

总之，基因启动子分析是基因调控研究的重要手段之一、通过对基因启动子序列和功能的深入分析，可以准确了解基因调控机制、预测转录启动位点和转录因子结合位点，并应用于医学和生物工程等领域。

基因启动子分析的进一步发展和应用将对疾病诊断和基因调控技术的发展提供重要的支持。

基因启动子分析范文基因启动子分析首先从序列层面入手。

在整个基因组中，基因启动子通常具有一些保守的序列特征，例如TATA盒、CAAT盒、GC盒等。

通过比对相关基因启动子序列，可以寻找到这些共同的特征，从而预测潜在的启动子区域。

人们发现，很多启动子区域在不同组织和生理条件下具有不同的转录活性。

因此，基因启动子分析的一个重要方向是研究不同条件下启动子区域的转录活性调控机制。

此时，可以通过二代测序技术获取大规模的转录组数据，从而了解哪些启动子在不同条件下被激活或抑制。

进一步通过结合转录因子结合位点预测、甲基化分析等方法，可以找到特定转录因子在启动子区域上的作用，以及DNA甲基化在启动子活性调控中的作用。

另一个重要的基因启动子分析方向是研究启动子的功能。

人们通过构建启动子-报告基因体系，将候选启动子序列与报告基因（如荧光蛋白）结合，然后转染到细胞中，观察启动子区域的转录活性。

这种方法可以用来鉴定启动子区域的功能元件，例如增强子、沉默子等。

此外，对于疾病相关基因的启动子分析也非常重要。

已有研究表明，一些疾病的发生与基因启动子区域的异常调控有关。

通过比较疾病样本和正常样本的基因启动子区域，可以发现潜在的启动子突变、甲基化变化等异常。

这些异常可能导致转录水平异常，从而进一步引发疾病的发生。

因此，基因启动子分析可以为疾病的早期预警和诊断提供重要的线索。

最后，基因启动子分析也可以帮助我们预测新的基因启动子，并发掘潜在的功能基因。

通过机器学习、深度学习等方法，可以挖掘基因启动子在序列上的特征，从而预测新的启动子区域。

这些预测结果可以进一步验证其转录活性，并研究其在不同条件下的调控机制和功能。

综上所述，基因启动子分析是一个重要的研究方向，可以帮助我们深入了解基因的调控机制、功能以及相关疾病的发生机制。

通过对基因启动子序列和转录组数据的分析，可以揭示启动子的转录调控机制，预测新的启动子区域，并发现与疾病相关的异常。

基因启动子分析的研究成果将对疾病的预防、诊断和治疗提供重要的理论指导和实践应用。

基因工程操作步骤1.提取目标基因2.质粒构建质粒是一种小型的DNA分子，可以被细菌细胞容纳和复制。

在基因工程中，质粒通常用作目标基因的携带体。

构建质粒的第一步是选择合适的质粒载体（如pUC19或pBR322），然后将目标基因序列与其连接。

连接的方法通常是通过PCR扩增目标基因，然后使用酶切和DNA连接酶将其插入到质粒中。

3.变性、酶切和连接在将目标基因插入到质粒中之前，通常需要对质粒和目标基因进行变性。

变性是指将核酸分子的双链断裂为单链，通常通过加热和短暂降温的方式实现。

然后，使用酶切酶对质粒和目标基因进行酶切。

酶切酶可以识别特定的DNA序列，并在其周围剪切。

通过选择合适的酶切酶，可以在目标基因和质粒中生成互补的黏性末端。

接下来，使用DNA连接酶将目标基因和质粒连接在一起。

4.转化、筛选和鉴定接下来的步骤是将构建好的质粒导入宿主细胞。

质粒可以通过热冲击、电穿孔或化学方法等引导宿主细胞进行转化。

转化成功后，利用培养基中添加特定抗生素或选择性培养基来筛选出携带目标基因的细胞。

通过筛选，可以获得大量携带目标基因的细胞。

然后，通过PCR、酶切和DNA测序等方法对携带目标基因的细胞进行鉴定，确保其目标基因的正确性和完整性。

5.表达和纯化一旦确定细胞中携带目标基因的准确性和完整性，可以开始目标基因的表达和纯化。

这通常包括选择合适的表达宿主，如E. coli、酵母或哺乳动物细胞，以及合适的表达载体。

在表达载体中，目标基因和其相应的启动子、终止子和调控元件被组装在一起，使得基因可以在宿主细胞中被转录和翻译。

然后，通过离心、柱层析、电泳等方法对表达产物进行纯化和分离。

6.功能分析和应用完成基因表达和纯化后，可以对目标基因进行功能分析和应用研究。

功能分析包括使用各种技术方法来研究目标基因的功能和调控机制，如转录、翻译、蛋白质互作和代谢途径等。

应用研究包括将目标基因进行遗传改良、农业改良、生物药物生产、疾病治疗等方面的应用。

启动⼦启动⼦（promoter）是基因的⼀个组成部分，在遗传学中是指⼀段能使基因进⾏转录的脱氧核糖核酸（DNA）序列。

启动⼦可以被RNA 聚合酶辨认，并开始转录。

在核糖核酸（RNA）合成中，启动⼦可以和决定转录的开始的转录因⼦产成相互作⽤，控制基因表达（转录）的起始时间和表达的程度，包含核⼼启动⼦区域和调控区域,就像“开关”，决定基因的活动，继⽽控制细胞开始⽣产哪⼀种蛋⽩质。

完全的启动⼦称为规范序列。

启动⼦区是RNA聚合酶的结合区，其结构直接关系到转录的效率。

关于其结构特点，Pribnow设计了⼀个实验，他把RNA聚合酶全酶与模板DNA结合后，⽤DNase l⽔解DNA，然后⽤酚抽提，沉淀纯化DNA后得到⼀个被RNA聚合酶保护的DNA⽚段，约有41～44个核苷酸对。

他先后分离了fd噬菌体、T7噬菌体的A2及A3启动⼦、h 噬σ菌体的PR启动⼦及⼤肠杆菌乳糖操纵⼦的UV5启动⼦等5段被酶保护的区域，并进⾏了序列分析，以后⼜有⼈做了50多个启动⼦的序列分析后发现，在被保护区内有⼀个由5个核苷酸组成的共同序列，是RNA聚合酶的紧密结合点，现在称为Pribnow区（Pribnow box），这个区的中央⼤约位于起点上游10bp处，所以⼜称为-10区。

许多原核⽣物都含有这两个重要的启动⼦区：RNA聚合酶同启动⼦结合的区域称为启动⼦区。

将各种原核基因同RNA聚合酶全酶结合后，⽤DNase I⽔解DNA，最后得到与RNA聚合酶结合⽽未被⽔解的DNA⽚段，这些⽚段有⼀个由5个核苷酸（TATAA）组成的共同序列，以其发现者的名字命名为Pribnow框(Pribnowbox），这个框的中央位于起点上游10bp处，所以⼜称-10序列（-10 sequence），后来在-35 bp处⼜找到另⼀个共同序列（TTGACA）。

Hogness等在真核基因中⼜发现了类似Pribnow框的共同序列，即位于-25～-30 bp处的TATAAAAG，也称TATA框（TATAbox）。

基因分析流程基因分析是一项重要的生物学研究工作，通过对基因组中的基因进行分析，可以揭示生物体内部复杂的遗传信息，为疾病诊断、药物研发、品种改良等领域提供重要的信息支持。

下面将介绍基因分析的一般流程。

首先，基因分析的第一步是样本采集。

样本可以是血液、组织、唾液等，采集的样本应具有代表性和充分的数量，以确保后续分析的准确性和可靠性。

接着，样本的DNA提取是基因分析的关键步骤。

DNA提取的质量和纯度直接影响后续分析的结果，常用的DNA提取方法有化学法、机械法和磁珠法等，选择合适的方法可以提高DNA提取的效率和纯度。

第三步是DNA测序。

DNA测序是基因分析的核心技术，通过对DNA序列的测定，可以揭示基因组的结构和功能，目前常用的DNA测序技术包括Sanger测序、高通量测序和第三代测序等，不同的测序技术有着各自的优缺点，可以根据具体的分析需求选择合适的技术。

接下来是数据分析和解读。

DNA测序产生的海量数据需要经过严格的分析和解读，包括序列比对、变异检测、功能注释等步骤，数据分析的结果将为基因的功能和表达模式提供重要线索，为后续的研究工作奠定基础。

最后，基因分析的结果需要进行验证和应用。

通过PCR扩增、基因编辑等技术对分析结果进行验证，验证结果的准确性将直接影响后续研究的可靠性和有效性，同时，基因分析的结果还可以应用于疾病诊断、药物靶点筛选、遗传育种等领域，为生命科学研究和应用提供重要的支持。

综上所述，基因分析是一个复杂而又精密的工作，涉及样本采集、DNA提取、测序分析、数据解读和结果验证等多个环节，每个环节的质量和准确性都将直接影响最终的分析结果。

随着基因分析技术的不断发展和完善，相信基因分析在生物学研究和临床应用中将发挥越来越重要的作用。

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1. 设计启动子引物。

根据目标启动子序列设计引物。