嗜麦芽假单胞菌的碱性蛋白酶基因在大肠杆菌中的克隆与表达

目的基因在大肠杆菌中的诱导表达一般程序如下：获得目的基因－准备表达载体－将目的基因插入表达载体中（测序验证）－转化表达宿主菌－诱导靶蛋白的表达－表达蛋白的分析－扩增、纯化、进一步检测。

[主要试剂]1、LB培养基。

2、100mM IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）： IPTG溶于100ml ddH2O中,μm 滤膜抽滤，-20℃保存。

[操作步骤]1、通过PCR方法获得目的基因：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物（在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点，本实验中为BamHⅠ和HiindⅢ），PCR循环获得所需基因片段。

PCR反应体系为：。

PCR反应条件为：94℃变性3min；94℃变性3min、52℃复性40sec、72℃延伸1min，30个循环；最后72℃延伸8min。

2、构建重组表达载体（1）载体酶切：将表达质粒pRSETA用限制性内切酶（同引物的酶切位点）进行双酶切，酶切产物行琼脂糖电泳后，用凝胶回收Kit或冻融法回收载体大片段。

（2）R基因PCR产物双酶切后回收，在T4 DNA连接酶作用下连接入载体。

连接反应体系为：#3、获得含重组表达质粒的表达菌种（1）将连接产物转化大肠杆菌DH5α，根据重组载体的标志（抗Amp）作筛选，挑取单斑，碱裂解法小量抽提质粒，双酶切初步鉴定。

（2）测序验证目的基因的插入方向及阅读框架均正确,进入下步操作。

否则应筛选更多克隆，重复亚克隆或亚克隆至不同酶切位点。

（3）以此重组质粒DNA转化表达宿主菌BL21（DE3）的感受态细胞。

4、诱导表达1、挑取含重组质粒的菌体单斑至2ml LB（含Amp50μg/ml）中37℃过夜培养。

2、按1∶100比例稀释过夜菌，一般将1ml菌加入到含100mlLB培养基的300ml 培养瓶中, 37℃震荡培养至OD600≌（最好，大约需3hr）。

3、取部分液体作为未诱导的对照组，余下的加入IPTG诱导剂至终浓度1mM 作为实验组，两组继续于37℃、200rpm震荡培养3hr。

芽孢杆菌β-淀粉酶基因在大肠杆菌中的克隆与表达
王为先;张沁;申同健
【期刊名称】《遗传学报：英文版》
【年(卷),期】1993(20)4
【摘要】本工作采用新设计的营养缺陷型淘汰筛选法,从本实验室筛选的芽孢杆菌Bacillus R2中分离到能够水解生淀粉的β-淀粉酶基因。

该基因所在的DNA片段
为5.25kb,在大肠杆菌(E.coli)中的表达产物具有与供体菌相同的淀粉酶特性,实验
室条件下酶产量为500IU/ml以上,RDA值为57%,并且可以全部分泌到培养基中。

【总页数】7页(P374-380)
【关键词】β-淀粉酶;基因克隆;芽孢杆菌
【作者】王为先;张沁;申同健
【作者单位】中国科学院化工冶金研究所生化工程室;中国科学院生物物理研究所【正文语种】中文
【中图分类】Q939.110.3
【相关文献】
1.地衣芽孢杆菌α-耐高温淀粉酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达 [J], 潘风光;宋德群;任洪林;艾永兴;柳增善
2.地衣芽孢杆菌耐高温α-淀粉酶基因在大肠杆菌中的克隆、表达及其产物的分泌[J], 李金霞;蔡恒;路福平;杜连祥
3.地衣芽孢杆菌耐高温α-淀粉酶基因在大肠杆菌中的克隆及表达 [J], 蔡恒;陈忠军;
路福平;杜连祥
4.产β-淀粉酶菌株的筛选及β-淀粉酶基因在大肠杆菌中的克隆与表达 [J], 李猛;陈利飞;杨建楼;马春玲
5.嗜热脂肪芽孢杆菌耐热α-淀粉酶基因在大肠杆菌中的克隆和表达 [J],
N.Tsukagoshi;李尔炀
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嗜麦芽假单胞菌酪氨酸酶基因在大肠杆菌中的克隆与表达王戈林;沈萍;杨澜;彭珍荣【期刊名称】《遗传学报：英文版》【年(卷),期】1999(26)3【摘要】酪氨酸酶基因（mel）编码的酪氨酸酶是合成黑色素的关键酶。

用鸟枪法分离嗜麦芽假单胞菌（PseudomonasmaltophiliaAT18）的mel基因：以pUC18为载体，E．coliHB101为受体菌，在加有一定量的Amp和L－tyr的酪素平板上筛选到分泌可溶性黑色素的转化子，所含重组质粒pWSY约700bp的外源DNA片段上携有mel基因，该片段无BamHI、HindIII、EcoRI、BclI等酶的识别位点。

Southern杂交证实此片段确实来源于P．maltophilia。

克隆片段的核酸序列分析鉴定ORF504为酪氨酸酶编码序列，SDS－PAGE电泳也显示工程菌HB101／pWSY额外表达一分子量约为18kD的蛋白，因此证明了这一蛋白是重组子表达的酪氨酸酶。

【总页数】6页(P274-279)【关键词】mel基因;克隆;表达;酪氨酸酶基因【作者】王戈林;沈萍;杨澜;彭珍荣【作者单位】武汉大学生命科学学院【正文语种】中文【中图分类】Q78;Q933【相关文献】1.嗜麦芽假单胞菌的碱性蛋白酶基因在大肠杆菌中的克隆与表达 [J], 江盛梅;沈萍2.嗜麦芽假单胞菌酪氨酸酶基因在类产碱假单胞菌中的转移与表达 [J], 蔡信之;谢志雄;沈萍3.嗜麦芽窄食单胞菌角蛋白酶基因(KerF)的克隆及其在大肠杆菌中的表达 [J], 邹晓凤;岳寿松;宋爱荣;尤升波;游银伟;黄亦钧;朱友峰4.嗜麦芽假单胞菌热休克基因dnaK启动子的亚克隆及其在大肠杆菌中功能的研究[J], 王雅琴5.嗜糖假单胞菌麦芽四糖酶基因在地衣芽孢杆菌中的异源表达 [J], 楼志华;刘翔;张劲楠因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

嗜碱细菌NTT36嗜碱基因的亚克隆及其在大肠杆菌和农杆菌中的表达刘同明;曹军卫;王玲燕;刘阳;俞雁寻【期刊名称】《氨基酸和生物资源》【年(卷),期】1999(21)2【摘要】将大肠杆菌ＨＢ１０１嗜碱转化子中质粒ｐＧＣＡ所携带的嗜碱基因亚克隆至双元载体ｐＢＩ１２１质粒中，构建了植物表达载体ｐＬＧＣ重组质粒。

用其转化大肠杆菌ＨＢ１０１获得了能在碱性和卡那霉素抗性平板上生长的转化子，再通过三亲交配法将亚克隆质粒ｐＬＧＣ转化进农杆菌ＬＢＡ４４０４，又获得能在碱性平板和卡那霉素及利福平双抗平板上生长的转化子，Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交结果表明ＨＢ１０１转化子亚克隆质粒ｐＬＧＣ是由来自于嗜碱芽孢杆菌ＮＴＴ３６染色体ＤＮＡ和双元载体ｐＢＩ１２１组成，且农杆菌ＬＢＡ４４０４转化子含有来自大肠杆菌亚克隆转化子的ｐＬＧＣ质粒。

【总页数】4页(P37-40)【关键词】嗜碱芽孢杆菌;农杆菌;亚克隆;植物表达载体【作者】刘同明;曹军卫;王玲燕;刘阳;俞雁寻【作者单位】武汉大学生命科学学院【正文语种】中文【中图分类】Q939.124;Q943【相关文献】1.嗜碱耐盐芽孢杆菌乙醛脱氢酶基因aldC的克隆及组氨酸融合酶蛋白的表达 [J], 郑雪妮;高秀峰;李永生2.嗜碱芽孢杆菌 cotA 基因克隆表达及部分性质研究 [J], 刘友勋;闫明阳;耿园园;黄娟3.中度嗜盐细菌Halomonas sp.BYS-1甜菜碱醛脱氢酶基因的克隆和表达 [J], 洪青;何健;刘智;李顺鹏4.嗜热脂肪芽孢杆菌耐热α-淀粉酶基因在大肠杆菌中的克隆和表达 [J],N.Tsukagoshi;李尔炀5.嗜盐嗜碱芽孢杆菌NTT76启动子和信号肽序列的克隆及表达 [J], 陈建军;曹军卫;苏莉因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

嗜碱芽孢杆菌 cotA 基因克隆表达及部分性质研究刘友勋;闫明阳;耿园园;黄娟【期刊名称】《生物技术通报》【年(卷),期】2016(032)008【摘要】In order to obtain a multi-copper oxidase with unusual features,a cotA gene from alkalophilic Bacillus clausii KSM-K16 was cloned and expressed in Escherichia coli. According to the CotA sequence from B. clausii KSM-K16 and the codon preference in E. coli, the gene of full-length sequence was designed,synthesized,and cloned into the expression vector of pET28a. Then the pET28a-cotA was transformed to E. coli BL21(DE3)that was induced to express recombinant protein,which was subsequently purified and biochemically characterized. The purified recombinant CotA was about 62 kD,showed the blue green and had the characteristic absorption peak of Cu2+ at 609 nm. Also the recombinant CotA oxidized the substrates such as ABTS,SGZ and bilirubin. When SGZ as substrate,the optimal temperature and pH was 90℃ and 7.5,respectively. CotA maintained more than 70% of its original activity after incubating at 80℃ for 2 h. Furthermore,it was quite stable over pH ranging 4.0-11.0,more than 90% of its original activity after incubating at 37℃ for 1 h still remained. The results showed that the CotA from alkalophilic B. clausii was a typical multi-copper oxidase with the activities of laccase and bilirubin oxidase,and presented strong acidic-,alkali-,and thermo-stability.%为了获得具有高性能的多铜离子氧化酶，从极端微生物嗜碱芽孢杆菌（Bacillus clausii KSM-K16）中克隆表达了其芽孢外衣蛋白 CotA。

KGF-2基因克隆及在大肠杆菌中的表达1引言角质形成细胞生长因子-2 ( Keratinocyte Growth Factor-2，KGF-2)，又称为成纤维细胞生长因子-10 (Fibroblast Growth Factor-10，FGF-10)，是FGFs超家族中角质细胞生长因子家族的一员。

1.1 KGF-2的来源和基因结构KGF-2主要是由成纤维细胞及其他间充质来源的细胞分泌，如成纤维细胞、损伤修复中的肉芽组织以及上皮组织周围的γδT细胞均可分泌KGF-2。

此外，上皮组织的损伤还可上调KGF-2的表达。

人kgf-2基因位于染色体的5p12-p13区域，其基因为单拷贝，由3个外显子和2个内含子组成。

1997年，Emoto等[1]克隆了人的kgf-2的cDNA，其编码的蛋白质由208个氨基酸组成，N端有39个氨基酸组成的疏水信号肽，成熟蛋白含169个氨基酸，其中4个半胱氨酸形成2对二硫键，另一个折叠在肽中。

理论相对分子质量为19.3KD，对肝素具有较强的亲和作用。

Kgf-2的立体结构与其它FGF家族成员相似，为β三叶草型。

1.2 KGF-2的功能KGF-2通过与上皮细胞细胞膜上受体作用特异性促进上皮细胞的增殖、分化和迁移，是胚胎器官发育中重要的多功能信号分子。

KGF-2能够通过刺激表皮细胞的增殖、迁移和分化直接促进伤口的愈合，在组织的重塑过程中起趋化作用[2]。

KGF-2通过与损伤位点黏膜的表皮细胞上的受体结合，引起细胞向受伤处迁移，保护角质细胞免受ROS诱导的细胞凋亡，由此来加快伤口的愈合。

此外，KGF-2同时也能通过刺激其它在组织修复和再生过程中有着非常重要作用的细胞因子(如血小板衍生生长因子，转化生长因子和成纤维细胞生长因子)的表达来间接作用于组织的重塑[3]。

KGF-2有两种细胞膜表面受体：FGFR1Ⅲb和FGFR2Ⅲb。

KGF-2与FGFR2Ⅲb的亲和力高，是其特异性配体。

KGF-2与受体结合后，促使受体处于细胞内的Ｃ端酪氨酸残基磷酸化，磷酸化的受体具有酪氨酸蛋白激酶活性，并与一系列靶蛋白发生作用，引发信号级联反应，发挥生物学功能[4,5]。

50㊀2021Vol.47No.1(Total 421)DOI:10.13995/ki.11-1802/ts.025483引用格式:楼志华,刘翔,张劲楠.嗜糖假单胞菌麦芽四糖酶基因在地衣芽孢杆菌中的异源表达[J].食品与发酵工业,2021,47(1):50-54.LOU Zhihua,LIU Xiang,ZHANG Jingnan.Heterologous expression of maltotetraose-forming amylase from Pseud-omonas saccharophila in Bacillus licheniformis [J].Food and Fermentation Industries,2021,47(1):50-54.嗜糖假单胞菌麦芽四糖酶基因在地衣芽孢杆菌中的异源表达楼志华1,2∗,刘翔1,张劲楠11(江苏省奥谷生物科技有限公司,江苏常州,213300)2(溧阳维信生物科技有限公司,江苏常州,213300)摘㊀要㊀为了考察重组地衣芽孢杆菌的异源表达特性,进一步提高麦芽四糖酶的发酵水平,以适用于工业化生产,研究构建了木糖诱导型的重组地衣芽孢表达系统,表达了来源于嗜糖假单胞菌的麦芽四糖酶基因,并进行了初步发酵优化㊂结果显示,构建的表达系统经过核酸电泳以及十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰氨凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis ,SDS-PAGE )鉴定均正确,该系统在发酵过程中经过木糖诱导,重组酶能够成功地分泌至发酵液中,然后通过对诱导剂添加时间㊁诱导温度和发酵时间优化后,摇瓶水平的最大酶活力可达(168.2ʃ9.41)U /mL ㊂最佳的发酵条件为,在24h 添加诱导剂,诱导温度30ħ,发酵至稳定期结束停止发酵㊂该研究为重组地衣芽孢杆菌的异源表达研究以及麦芽四糖酶的工业化应用提供了参考㊂关键词㊀麦芽四糖酶;地衣芽孢杆菌;嗜糖假单胞菌;发酵优化;异源表达;木糖诱导第一作者:硕士,工程师(通讯作者,E-mail:muxinhua23@)收稿日期:2020-08-26,改回日期:2020-09-21㊀㊀麦芽四糖酶(glucan 1,4-α-maltotetraohydro-lase),又名麦芽四糖淀粉水解酶,可以连续地催化淀粉状多糖中非还原型末端麦芽四糖残基的水解,主要产物为麦芽四糖[1]㊂而麦芽四糖因其独特的理化特性,一度被誉为最有希望的麦芽低聚糖[2],在食品加工行业有着广泛㊁重要的应用㊂麦芽四糖酶基因主要来源于斯氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri )和嗜糖假单胞菌(Pseudomonas saccharophila ),二者来源的麦芽四糖酶均为α构型㊂相比而言,嗜糖假单胞菌来源的麦芽四糖酶的热稳定性和pH 稳定性均较好,在40ħ以下和pH 5.5~11均能长时间保持稳定;在最适温度(55ħ)㊁最适pH(6.7)以及在其他宿主内表达后酶活力也均较高[3]㊂这些因素表明嗜糖假单胞菌来源的麦芽四糖酶更适合于工业化应用,也因而备受学者的关注㊂国内,ZHOU㊁赵云等[4-5]在大肠杆菌中克隆表达了嗜糖假单胞菌来源的麦芽四糖酶,但获得的重组酶大部分是包涵体,重组酶活力并不高㊂2019年,张梓芊㊁杨亚楠等[6-7]在Bacillus subtilis 中构建了表达系统胞外表达了嗜糖假单胞菌来源的麦芽四糖酶,发现其比活力为980.49U /mg,通过发酵优化后,在摇瓶水平重组酶活力可高达147U /mL㊂这些报道中,重组酶酶学性质基本一致,在芽孢杆菌中表达可获得更高的活力㊂国外,美国杰能科公司上市的麦芽四糖酶SAS3则以地衣芽孢杆菌为宿主进行重组表达[8],并且在地衣芽孢杆菌发酵产相关淀粉酶方面形成了技术封锁,因此导致国内纯化的麦芽四糖价格极高㊂地衣芽孢杆菌是优良的食品安全级表达宿主,被美国FDA 认定为食品安全级菌株(Generally Recognized As Safe,GRAS)已有近40年的历史,而且该菌产酶能力高,胞外蛋白分泌能力大约是枯草芽孢杆菌的2倍[9]㊂然而,国内目前还未发现有关重组地衣芽孢杆菌表达麦芽四糖酶的研究㊂本研究拟构建地衣芽孢杆菌表达系统,对来源于嗜糖假单胞菌的麦芽四糖酶基因进行木糖诱导表达,通过果聚糖合酶信号肽使麦芽四糖酶分泌至胞外,并对构建的重组菌进行初步发酵条件优化,以期为地衣芽孢杆菌的异源表达以及麦芽四糖酶的工业化应用提供参考㊂1㊀材料与方法1.1㊀菌株和质粒本研究所用敲除了α-淀粉酶基因amyL 和碱性蛋白酶基因aprE 的地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis CICIM B1391(BLΔAE)㊁E.coli JM109以及大肠杆菌-芽孢杆菌穿梭质粒pHY300-PLK,均购于江南大学,由江苏省奥谷生物科技有限公司保藏㊂重组质粒pBL-SY2由江南大学石贵阳教授惠赠,该重组质粒携带了来源于B.licheniformis CICIM B1391自身的木糖异构酶启动子及其调控蛋白基因㊁枯草芽孢杆菌果聚糖合酶信号肽基因sacBss㊁B.licheniformis ATCC14580的麦芽糖淀粉酶基因以及木糖异构酶基因的终止子ter㊂嗜糖假单胞菌麦芽四糖酶基因序列由NCBI数据库查寻获得,序列号为:X16732.1,将该序列和终止子ter一并委托上海生物工程有限公司合成,合成后的片段插入至质粒pET28a中,即pET28a-G4-ter㊂重组质粒pBLxys㊁pBLG4,重组地衣芽孢杆菌BLG4由本研究构建㊂1.2㊀工具酶、引物和试剂含DNA聚合酶的Taq和Pfu预混液㊁T4DNA连接酶,Thermo Fisher公司;各种限制性内切酶㊁PCR产物纯化试剂盒㊁质粒提取试剂盒,TAKARA有限公司;引物由上海生物工程有限公司合成,引物序列见表1;酵母粉和蛋白胨,安琪酵母有限公司;其他试剂为国产分析纯或生化试剂㊂表1㊀本研究所使用的引物Table1㊀Primers used in this study引物名称引物序列(5 -3 )a酶切位点PxylF CC AAGCTTTTAAAATCTCTCATTCATAAACCGTTCC HindⅢPxylsR GG GGTACCATGATGATGATGATGATGCG KpnⅠPxylsF GG GGTACCATGAGCCACATCCTGC KpnⅠPterR GCTCTAGAGGGTAAAAAACCATTCACTC XbaⅠ㊀㊀注:a下划线序列为酶切位点1.3㊀DNA操作技术质粒提取㊁DNA片段纯化㊁回收等均参照TAKARA 试剂盒说明书㊂PCR扩增反应㊁DNA琼脂糖凝胶电泳㊁酶切㊁连接以及转化子筛选等均参照分子克隆实验指南[10]㊂1.4㊀木糖诱导分泌表达载体的构建首先以重组质粒pBLSY2为模板,以PxylF㊁Pxy-lsR为引物,扩增含木糖异构酶启动子及其调控蛋白基因和信号肽的基因片段Blxyl-sacBss,反应条件:95ħ10min,95ħ30s,54ħ30s,72ħ2min,30个循环,72ħ10min㊂然后分别同pHY300-PLK经Hind Ⅲ和KpnⅠ酶切后通过胶回收克隆至pHY300-PLK,获得木糖诱导分泌表达的重组质粒pBLxys后转化至E.coli JM109,即E.coli JM109/pBLxys㊂再以pET28a-G4-ter为模板,以引物PxylsF㊁PterR扩增麦芽四糖酶结构基因,反应条件与上述一致,再分别同pHY300-PLK 经KpnⅠ和XbaⅠ酶切后通过胶回收克隆至pBLxys,即为木糖诱导分泌表达麦芽四糖酶的重组质粒pBLG4,经过转化子筛选后,送去测序,测序正确后即获得携带pBLG4重组质粒的E.coli JM109/pBLG4㊂1.5㊀重组地衣芽孢杆菌的构建培养E.coli JM109/pBLxys㊁E.coli JM109/pBLG4,提取重组质粒pBLxys㊁pBLG4后,按文献[13]所述电转方法分别将其转入BLΔAE,从而获得重组地衣芽孢杆菌BLXYLS和BLG4㊂1.6㊀麦芽四糖酶酶活定义及测定麦芽四糖酶酶活力单位(U)定义为:在pH7.0和50ħ的反应条件下,每分钟分解可溶性淀粉生成相当于1μmoL葡萄糖所需的酶量㊂麦芽四糖酶酶活测定方法参照文献[5]㊂1.7㊀发酵优化实验LBG培养基(g/L):葡萄糖10.0,蛋白胨FP321 10.0,酵母粉FM4085.0,NaCl10.0㊂发酵培养基(g/L):麦芽糊精90,蛋白胨FP321 20,酵母粉FM40810,玉米浆干粉5,(NH4)2HPO4 10,K2HPO4㊃3H2O9.12,KH2PO41.36,CaCl20.50, MgSO4㊃7H2O0.50㊂在进行发酵优化实验时,均使用挡板摇瓶进行发酵,发酵前均加入终质量浓度为20mg/L的四环素㊂每组实验做3个平行㊂2㊀结果与分析2.1㊀重组表达载体的构建根据NCBI显示,嗜糖假单胞菌麦芽四糖酶基因序列(G4-ter)总长约1.7kbp,编码551个氨基酸,理论上蛋白大小为59.9kDa,而终止子序列总长为0.1 kbp,因此KpnⅠ和XbaⅠ酶切后应获得约1.8kbp 和6.3kbp大小的2条核酸条带㊂Blxyl-sacBss基因片段长度约为1.4kbp,经HindⅢ和KpnⅠ酶切后应获得约6.7kbp和1.4kbp大小的2条核酸条带㊂对获得的克隆宿主E.coli JM109/pBLG4提取重组质粒pBLG4,质粒大小约8.1kbp,构建重组表达载体图见图1㊂然后分别用HindⅢ㊁HindⅢ和KpnⅠ㊁KpnⅠ和XbaⅠ酶切,电泳鉴定结果如图2,结合测序结果,可以充分说明重组表达载体构建正确㊂2.2㊀重组麦芽四糖酶的表达将对照菌BLXYLS和重组菌BLG4分别进行摇瓶发酵,接种后8h均加入10g/L木糖进行诱导,然后继续培养30h,离心后收集发酵液上清,分别检测二者胞外麦芽四糖酶活力㊂结果显示,只有重组菌BLG4检测到活力,而对照菌BLXYLS未检测到活力㊂将二者发酵液上清进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰氨凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)分析,结果见图3㊂可以2021年第47卷第1期(总第421期)51㊀52㊀2021Vol.47No.1(Total 421)Blxyl -木糖异构酶启动子及其调控蛋白基因;sacBss -枯草芽孢杆菌果聚糖合酶信号肽基因;G4-嗜糖假单胞菌麦芽四糖酶基因;ter -木糖异构酶基因的终止子图1㊀重组表达载体pBLG4Fig.1㊀Diagram of recombinant expression vector pBLG4M-Maker;1-pBLG4/Hind Ⅲ;2-pBLG4/Hind Ⅲ+Kpn Ⅰ;3-pBLG4/Kpn Ⅰ+Xba Ⅰ图2㊀重组表达载体pBLG4验证电泳图Fig.2㊀Electropherogram of recombinant expression vector pBLG4发现在约60kDa处出现一明显的表达条带,这与理论推测的蛋白大小基本一致,表明重组菌成功地将麦芽四糖酶分泌到了发酵液中㊂M-Maker;1-BLXYLS;2-BLG4图3㊀发酵液上清液SDS-PAGE 电泳图Fig.3㊀SDS-PAGE electropherogram of fermentationbroth supernatant2.3㊀发酵条件优化2.3.1㊀诱导剂添加时间对发酵的影响重组菌接种后,在37ħ㊁250r /min 下进行培养,分别在接种后的8㊁12㊁16㊁20㊁24㊁28㊁32h 取样检测OD 600,并添加10g /L 木糖进行诱导,发酵至24h 时补加30g /L 麦芽糊精,发酵至48h 时添加10g /L 的木糖,然后继续发酵至72h 结束㊂发酵结束后,取样检测OD 600和发酵液中的麦芽四糖酶活力,结果如表2㊁图4所示㊂结果显示,诱导剂添加时间对重组菌生长影响较小,但对发酵结束时胞外麦芽四糖酶酶活有显著影响㊂随着诱导剂添加时间的延迟(8~24h),发酵结束时检测到的胞外酶活呈递增趋势,当发酵24h 添加诱导剂时,发酵结束时胞外酶活力高达(138.2ʃ11.2)U /mL;而当28㊁32h 添加诱导剂时,发酵结束时酶活有所降低㊂事实上,这与木糖操纵子在地衣芽孢杆菌中的转录特性有关,据文献[12-13]报道,在对数生长期到稳定期的转换期间木糖操纵子转录活性显著增加,并且这种较高的转录活性会维持近12h㊂根据检测到的菌体量来看,发酵至24h 后,重组菌的生长速率明显降低,该时间点对应文献中对数生长期到稳定期的转换期间,因此,在发酵24h 时诱导能够检测到较高的麦芽四糖酶酶活㊂2.3.2㊀诱导温度对发酵的影响重组菌接种后,在37ħ㊁250r /min 下进行培养,当培养至24h 时,添加10g /L 木糖进行诱导,并添加30g /L 麦芽糊精,分别转移至25㊁30㊁37㊁42ħ,发酵至48h 时添加10g /L 的木糖和30g /L,然后继续发酵至72h 结束㊂发酵结束后,取样检测OD 600和发酵液中的麦芽四糖酶活力,结果如图5所示㊂可以发现,诱导温度对重组菌生长和产酶均有显著的影响㊂在25~37ħ,随着温度升高,发酵结束后的菌体量也越来越高,而42ħ时,菌体量又有所降低,这说明重组菌最适生长温度为37ħ㊂当诱导温度为30ħ时,胞外酶活力最高可达(161.4ʃ10.4)U /mL,37ħ次之,42ħ时胞外酶活力最低㊂重组菌在温度胁迫下的产酶特性是可以预见的㊂温度低时,菌体整体代谢速率较慢,酶的合成速率也会降低[14]㊂而温度较高时,尽管菌体代谢速率增加,但地衣芽孢杆菌分泌的其他蛋白酶也会增加[15],对重组酶的水解速率也会增加,另外重组酶自身的稳定性也可能有所下降㊂所以,诱导温度变化对重组菌生长和重组酶酶活力均有较大的影响㊂2021年第47卷第1期(总第421期)53㊀表2㊀不同时间添加诱导剂发酵结束时的菌体量Table 2㊀Biomass at the end of fermentation under different induction time诱导剂添加时间/h 8121620242832发酵结束时OD 600值50.2ʃ2.0849.6ʃ3.7050.6ʃ3.2150.8ʃ2.8851.8ʃ3.0453.3ʃ3.6352.1ʃ3.41图4㊀诱导剂不同添加时间对重组菌表达麦芽四糖酶的影响Fig.4㊀Effect of different adding time of inducer on the expression of maltotetraose in recombinant bacteria图5㊀诱导温度对重组菌表达麦芽四糖酶的影响Fig.5㊀Effect of induction temperature on the expression ofmaltotetraose in recombinant bacteria2.3.3㊀发酵时间对发酵的影响根据2.3.1和2.3.2的结果,在37ħ㊁250r /min下对重组菌进行培养,当培养至24h 时,添加2%木糖进行诱导,并转移至30ħ继续发酵㊂诱导后每隔12h 检测菌体量OD 600和麦芽四糖酶酶活㊂结果如图6所示㊂可以看到,发酵至84h 时,胞外检测到的最大酶活力为(168.2ʃ9.41)U /mL,之后酶活力明显开始下降㊂显然,重组地衣芽孢杆菌胞外酶活力开始下降的时间要略晚于稳定期,这与2.3.1小节所记录的特性相符,表明木糖诱导型重组地衣芽孢杆菌发酵至稳定期结束时停止发酵最为合适㊂在后续应用过程中,对重组酶的酶学性质进行了简单研究㊂以淀粉液为化液底物反应时,其最适pH 为7.0,最适反应温度为50ħ,并且在反应48h 后,相对酶活力仍能达50%以上,结合异淀粉酶进行转化,麦芽四糖转化率可达72.4%,其特性与文献报道[5-7]基本一致,表明重组酶的酶学性质未发生明显图6㊀重组地衣芽孢杆菌发酵过程曲线Fig.6㊀Growth and maltotetraose production curves ofrecombinant Bacillus licheniformis改变,有良好的应用前景㊂目前,国内对麦芽四糖酶的发酵还处于基础研究阶段,多见于在大肠杆菌㊁枯草芽孢杆菌中的表达,在地衣芽孢杆菌中的表达未见报道㊂杨亚楠等[7]在以枯草芽孢杆菌表达来源于嗜糖假单胞麦芽四糖酶的表达时,摇瓶水平酶活力可力达147U /mL,本研究摇瓶水平酶活力可达(168.2ʃ9.41)U /mL,较之有所提高,但提高有限㊂多项研究显示,地衣芽孢杆菌胞外蛋白分泌量可达枯草芽孢杆菌的2倍[9],这表明地衣芽孢的表达性能仍未被完全开发,其优势尚未完全发挥,可提升的空间仍然很大㊂据报道[1],美国杰能科公司也是通过重组地衣芽孢杆菌分批补料发酵,表达嗜糖假单胞菌的麦芽四糖酶,根据该酶的比酶活[7]及地衣芽孢杆菌的产酶特性,保守估计其发酵水平应在10000U /mL 左右㊂就本研究结果来看,尽管继续通过发酵优化能够继续提升发酵水平,但提升效果可能有限,还需要充分挖掘地衣芽孢杆菌的表达潜力,提升其表达能力,诸如在密码子偏好性[16],酶蛋白修饰[17],蛋白酶基因继续敲除[18],高效启动子开发[19-20]等方面均可继续进行深入研究㊂3㊀结论本研究利用地衣芽孢杆菌木糖诱导分泌表达载体,对来源于嗜糖假单胞菌麦芽四糖基因进行了表达,重组酶成功地分泌至胞外,能够在发酵液上清液中检测到酶活力,而且目标蛋白大小符合理论大小㊂对重组菌进行了发酵条件优化:在24h 添加诱导剂,诱导温度30ħ,发酵至稳定期结束停止发酵,摇瓶水54㊀2021Vol.47No.1(Total 421)平可高达(168.2ʃ9.41)U /mL㊂参考文献[1]㊀ZANGY,ANDERSEN J H,DINOVI M,et al.Maltotetraohydrolase from Pseudomonas stutzeri expressed in Bacillus licheniformis [M ].71th.Geneva:World Health Organization,2016.[2]㊀唐玉,孙俊良,梁新红,等.麦芽四糖研究新进展[J].河南科技学院学报(自然科学版),2013,41(4):14-16.TANG Y,SUN J L,LIANG H X,et al.New advances in maltote-traose[J ].Journal of Henan Institute of Science and Technology (Natural Sciences Edition),2013,41(4):14-16.[3]㊀赵云.麦芽四糖淀粉酶基因克隆㊁表达及活性研究[D].上海:华东师范大学,2013.ZHAO Y.Cloning,expression and activity study of a α-4-amylase enzyme [D].Shanghai:East China Normal University,2013.[4]㊀ZHOU J H,BABA T,TAKANO T,et al.Properties of the enzyme ex-pressed by the Pseudomonas saccharophila maltotetraohydrolase gene (mta )in Escherichia coli [J].Carbohydrate Research,1992,223:255-261.[5]㊀赵云,朱蓓霖,汪正华,等.麦芽四糖淀粉酶基因优化表达及酶学性质分析[J].中国生物工程杂志,2013,33(5):100-106.ZHAO Y,ZHU B L,WANG Z H,et al.Optimization of expression and the characterization of a α-4-amylase enzyme [J].China Bio-technology,2013,33(5):100-106.[6]㊀张梓芊.来源于Pseudomonas saccharophila 的麦芽四糖生成酶的分泌表达及其结构与性质研究[D].无锡:江南大学,2019.ZHANG Z Q.Secretion expression of maltotetraose-forming amylase from Pseudomonas saccharophila and analysis of its structure and en-zymatic properties[D].Wuxi:Jiangnan University,2019.[7]㊀杨亚楠.Pseudomonas saccharophila 麦芽四糖淀粉酶的重组表达㊁发酵优化及其应用研究[D].无锡:江南大学,2019.YANG Y N.Recombinant expression,fermentation optimization and application of maltotetraose amylase from Pseudomonas saccharophila [D].Wuxi:Jiangnan University,2019.[8]㊀BERG C T,DERKX P M F,FIORESI C,et al.Modified amylase from Pseudomonas saccharophila :Denmark,DK1907538[P].2008-04-09.[9]㊀PHENGNUAM T,SUNTORNSUK W.Detoxification and anti-nutrientsreduction of Jatropha curcas seed cake by Bacillus fermentation [J].Journal of Bioscience and Bioengineering,2013,115(2):168-172.[10]㊀SAMBROOKJ,RUSSELL D W.分子克隆实验指南[M].北京:科学出版社,2008.SAMBROOK J,RUSSELL D W.Molecular Cloning:A LaboratoryManual[M].Beijing:Science Press,2008.[11]㊀LI Y 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licheniformis [J].Applied Microbiology and Biotechnology,2020,104(12):1-17.Heterologous expression of maltotetraose-forming amylase from Pseudomonassaccharophila in Bacillus licheniformisLOU Zhihua 1,2∗,LIU Xiang 1,ZHANG Jingnan 11(Jiangsu OGO Biotechnology Co.,Ltd.,Changzhou 213300,China)2(Liyang VisionBio Technology Co.,Ltd.,Changzhou 213300,China)ABSTRACT ㊀To investigate the heterologous expression in Bacillus licheniformis and improve the fermentation level of maltotetraose-forming amylase,a xylose-inducible expression system was constructed in B.licheniformis CICIM B1391to express the maltotetraose-form-ing amylase from Pseudomonas saccharophila ,and a preliminary fermentation optimization was conducted.It was observed that maltote-traose-forming amylase was successfully secreted into the fermentation broth induced by xylose.After optimized induction time,temperature and fermentation time,the maximum enzyme activity reached to (168.2ʃ9.41)U /mL in shake flask fermentation.The optimal fermenta-tion conditions were adding the inducer at 24h,the induction temperature of 30ħ,and ending fermentation at the end of stable period.Key words ㊀maltotetraose-forming amylase;Pseudomonas saccharophila ;recombinant expression;fermentation optimization。

枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶基因的克隆和表达刘新育;张品品;李林珂;赵玉萍;马向东【期刊名称】《生物技术》【年(卷),期】2007(17)2【摘要】目的:获得碱性蛋白酶基因。

方法:用PCR的方法从枯草芽孢杆菌A-109中扩增碱性蛋白酶基因(apr),并进行测序分析,构建表达载体,最后转化大肠杆菌BL21,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测该基因的表达情况。

结果:apr基因片段含1092个碱基对。

该基因片段核苷酸序列与Bacillus amyloliquefaciens subtilisin DFE precursor有99%的同源性,对应的氨基酸序列与Bacillussp.DJ-4有99%的同源性。

apr基因在大肠杆菌BL21中获得表达,并表现出蛋白酶活性。

结论:获得了具有活性的新的碱性蛋白酶基因。

【总页数】4页(P13-16)【关键词】枯草芽孢杆菌;碱性蛋白酶;克隆;表达【作者】刘新育;张品品;李林珂;赵玉萍;马向东【作者单位】河南农业大学生命科学学院【正文语种】中文【中图分类】Q781;Q786【相关文献】1.侧孢短芽孢杆菌碱性蛋白酶基因BLG4在枯草芽孢杆菌WB600中的高效表达[J], 郭菁;田宝玉;蔡婉玲;黄薇;江贤章;黄建忠2.短小芽孢杆菌碱性蛋白酶基因在枯草芽孢杆菌WB600中的表达 [J], 何召明;张义正;王海燕3.地衣芽孢杆菌C1213碱性蛋白酶基因在枯草芽孢杆菌中的克隆及表达 [J], 吴宝东;杨秀琴;吴经才4.工业枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶基因克隆及分析 [J], 王琳5.地衣芽孢杆菌C_(1213)碱性蛋白酶基因在枯草芽孢杆菌中的克隆及表达 [J], 吴宝东;杨秀琴;吴经才因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

E.coli DH10B碱性磷酸酶基因的克隆、表达及活性研究李军;黄霞;姚雪梅;陈雪芬;齐兴柱【摘要】Objective: To clone and express alkaline phosphatase mature peptide gene of E.coli DH10B for the foundation of directed structural transformation and application of AKP. Methods: phoAm gene was amplified from E.coli DH10B genome by PCR; phoAm gene was cloned into pET28a and transformed into E.coli BL21 (DE3); rAKP was detected by im-muno-gold chromatography and SDS-PAGE; the activity of rAKP was determined by pNPP method. Results: Molecular weight of rAKP monomer was about 47 K, and activity of rAKP increased 21.5 times compared with the control. Conclusion: AKP matural peptide gene and rAKP with higher activity is acquired.%目的:克隆并表达E.coli DH10B碱性磷酸酶(AKP)成熟肽基因(phoAm),为AKP的定向改构及应用奠定基础.方法:采用PCR法从E.coli DH10B基因组扩增phoAm;将phoAm克隆入表达载体pET28a,再转入E.coli BL21(DE3)进行表达;用免疫金层析法和SDS-PAGE法检测表达的重组rAKP;采用对硝基酚磷酸(pNPP)法测定rAKP的活性.结果:rAKP单体分子量约47 K,活性分析比对照菌提高21.5倍.结论:获得AKP成熟肽基因并得了到具有较高活性的重组rAKP.【期刊名称】《中国医药导报》【年(卷),期】2012(009)001【总页数】3页(P28-29,66)【关键词】碱性磷酸酶;大肠杆菌DH10B;表达纯化;活性分析【作者】李军;黄霞;姚雪梅;陈雪芬;齐兴柱【作者单位】热带生物资源教育部重点实验室,海南海口,570228;海南大学海洋学院,海南海口,570228;海南大学海洋学院,海南海口,570228;海南大学海洋学院,海南海口,570228;海南大学海洋学院,海南海口,570228;海南大学海洋学院,海南海口,570228【正文语种】中文【中图分类】Q78碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，AKP）是一类非特异性磷酸单酯酶，可催化磷酸单酯的水解[1]。

耐热碱性磷酸酯酶的基因克隆及在大肠杆菌中的表达袁有忠;盛小禹;吕鸿雁;佟石;毛裕民【期刊名称】《遗传学报：英文版》【年(卷),期】1998(25)4【摘要】以pUC118质粒为载体,以E.coil TGl为受体,构建了产耐热碱性磷酸酯酶(FD-TAP)的菌株Thermus sp.FD3041的染色体基因文库。

在包含1.2万个转化子的文库中,90％的转化子插入有3～10kb的外源DNA片段。

用菌落原位碱性磷酸酯酶显色法从文库中筛选到5个阳性克隆。

对其中的1个克隆(pTAP362)所产的TAP进行了研究,发现克隆的TAP与出发菌株所产的TAP的热稳定性、最适反应温度和最适pH等性质都相同。

通过做物理图谱和测定部分缺失的质粒的TAP 活性,将TAP基因定位于2kb的BamHⅠ-HindⅢ DNA片段上。

模拟PCR实验表明该酶可用于PCR扩增产物的检出。

【总页数】6页(P375-380)【关键词】基因克隆;表达;大肠杆菌;FD-TAP【作者】袁有忠;盛小禹;吕鸿雁;佟石;毛裕民【作者单位】复旦大学遗传学研究所遗传工程国家重点实验室【正文语种】中文【中图分类】Q78【相关文献】1.信号肽去除的耐热碱性磷酸酯酶FD-TAP在大肠杆菌中的亚克隆和高表达 [J], 季朝能;白晓阳;盛小禹;张冰;毛裕民2.耐热DNA聚合酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达 [J], 金城;刘宏迪3.耐热型α-葡萄糖苷酶基因在大肠杆菌中的克隆及表达 [J], 周勤华;牟航;周盛梅4.编码耐热邻苯二酚2,3-双加氧酶的pheB基因在大肠杆菌中的亚克隆与高表达[J], 蔡在龙;季朝能;王学敏;张洁;董海;沈仁权;毛裕民因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

来源于Bacillus subtilis的中性植酸酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达姚斌;袁铁铮;王元火;操时树;王亚茹;史秀云;范云六【期刊名称】《生物工程学报》【年(卷),期】2001(17)1【摘要】通过PCR的方法从BaciLLussubtilis基因组中克隆了中性植酸酶基因nphy,DNA全序列分析表明其结构基因全长1152个核苷酸(编码383个氨基酸),5′端有一编码26个氨基酸的信号肽序列.去除信号肽编码序列的nphy克隆到大肠杆菌IPTG诱导表达载体pTYB40上,在大肠杆菌中得到了高效表达,表达量达到大肠杆菌可溶性蛋白的40%以上,表达产物具有生物学活性,证实了克隆到的中性植酸酶的编码基因有正常的生物学功能.【总页数】5页(P11-15)【作者】姚斌;袁铁铮;王元火;操时树;王亚茹;史秀云;范云六【作者单位】中国农业科学院饲料研究所,;中国农业科学院饲料研究所,;中国农业科学院饲料研究所,;中国农业科学院饲料研究所,;中国农业科学院饲料研究所,;中国农业科学院饲料研究所,;中国农业科学院生物技术中心,【正文语种】中文【中图分类】Q78【相关文献】1.Bacillus subtilis碱性果胶酶基因在大肠杆菌中的克隆和表达 [J], 肖静;路福平;杨晓杰;张东向2.来源于Penicillium sp.C1的水产用中性植酸酶基因在毕赤酵母中的表达及性质研究 [J], 李雅楠; 余利红; 陈新美; 杨浩萌; 黄火清3.Bacillus siamensis和Bacillus subtilis中2个β-D-葡萄糖苷酶编码基因克隆、表达及酶学研究 [J], 陈永敢; 谷风林; 蔡莹莹; 徐飞; 朱科学4.WprA基因在Bacillus subtilis WB800中的克隆表达 [J], 柴海云;崔堂兵5.Bacillus subtilis WHNB02植酸酶phyC基因的克隆及序列分析 [J], 吴琦;王红宁;胡勇;邹立扣因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。