猪囊尾蚴重组抗原和基因工程疫苗的研究进展冯金瑞;刘立军【摘要】猪囊尾蚴病（Cysticercosis）是由猪带绦虫的幼虫囊尾蚴寄生于人或猪等而引起的人畜共患寄生虫病,是公认的世界经济病之一。
严重威胁着人体健康,并给畜牧业造成重大经济损失,猪囊尾蚴病的免疫防治势在必行。
然而在猪囊尾蚴病疫苗研究中,疫苗抗原的选择和来源一直困扰着兽医工作者。
该文就近年来猪囊尾蚴病诊断重组抗原和基因工程疫苗的分子生物学研究进展进行了综述。
%Cysticercosis,which is known as a social-economic disease in the world,is an important zoonosis infecting human and pig caused by Taenia solium larval Cysticercus cellulosae.This disease must be prevented for its influence on international competition of the meat product and the great economic loss.However,the choice and source of vaccinal antigen always puzzles veterinarians.This paper reviewed recent research progress in molecular biology of vaccine for Recombinant antigen and genetic engineering vaccine of cysticercosis.【期刊名称】《畜牧兽医杂志》【年(卷),期】2012(031)002【总页数】4页(P35-38)【关键词】猪囊尾蚴病;重组抗原;基因工程疫苗【作者】冯金瑞;刘立军【作者单位】甘肃畜牧工程职业技术学院,甘肃武威733006;甘肃畜牧工程职业技术学院,甘肃武威733006【正文语种】中文【中图分类】S852.732囊尾蚴 (Cysticercus cellulosae)病是一种由猪带绦虫(Taenia solium)的幼虫引起严重的人畜共患寄生虫病。
囊尾蚴病的免疫预防研究开展较早，有全囊虫匀浆抗原、六钩蚴抗原、六钩蚴排泄一分泌抗原、囊尾蚴体外培养的分泌代谢抗原和组织培养的细胞抗原等用于免疫保护性试验，这些抗原作为疫苗均取得了良好的预防效果，可使免疫动物获得抗虫卵攻击感染的抵抗力，多数动物能得到完全保护。
但这些抗原都来自虫体本身，都不能通过体外繁殖而获得，而且抗原成分复杂。
粗制抗原包含了寄生虫的分泌、排泄、代谢产物以及宿主成分(主要是白蛋白和免疫球蛋白)的混合物，宿主成分的存在会造成诊断上的交叉反应及假阳性或假阴性的出现，虽然做酶联免疫吸附试验(enzymelinked immunosorbentassy，ELISA)的敏感性较高，但特异性较低。
单克隆抗体纯化的抗原用于免疫诊断能区分囊尾蚴病人和其它寄生虫病人，但由于其抗原决定簇较局限，试验中假阳性可能性大。
各种纯化方法所得抗原从分析结果看特性各不相同，但其诊断结果受纯化过程影响，缺乏统一的评价标准，且纯化过程繁琐，不能批量生产，限制了其进一步的推广应用。
而重组抗原稳定、价廉、结果重复性好，所以利用重组DNA技术制备出大量高纯度的诊断用抗原是解决人、猪囊尾蚴病免疫预防和诊断的关键和趋势所在。
1 猪囊尾蚴病重组抗原澳大利亚学者Johnson等用基因工程方法克隆并表达了羊带绦虫六钩蚴抗原，用其制成的疫苗对羊的保护率达94%，这一突破性研究的成功标志着用基因工程方法研制猪囊虫疫苗是切实可行的。
科研人员从羊带绦虫中鉴定3种宿主保护性六钩蚴抗原(16 k、18 k和45 W)，这些抗原的同源分子对牛感染牛带绦虫虫卵也有很好的保护作用。
从猪带绦虫六钩蚴抗原中也鉴定并克隆出与羊带绦虫(To18和To45w)和牛带绦虫(TSA18和 TSA9)同源的TSOL18和TSOL45-1A，并在体外进行表达纯化出特异性抗原，为猪囊尾蚴病的免疫预防和诊断奠定基础。
王敏等应用已从猪囊尾蚴cDNA文库中筛选出的28 ku、18 ku、14 ku和34 KU抗原诱导表达出四种囊尾蚴重组融合蛋白抗原，经Western-blot法检测不同类型及不同病程患者，显示多克隆 FPSWB可提高检出率且识别抗体更敏感。
苏彩霞等将猪囊尾蚴磷蛋白P12基因克隆到毕赤酵母菌表达系统分泌性表达载体，经过培养条件的初步优化获得稳定表达目的蛋白的重组蛋白菌株，表达产物SDS-PAGE检测结果表明:表达量占33%，分子量为12.6 ku，Western-blot分析结果表明，重组磷蛋白能被囊尾蚴病人阳性血清抗体识别。
Yasuhito Sako等克隆并表达了猪囊尾蚴低分子量蛋白AglV1/Ag2的嵌合分子，用ELISA法诊断脑囊尾蚴病，结果获得了89.7%的阳性率。
Fleury用合成的抗原表位诊断脑囊尾蚴病，结果显示多肽HP6-2和Ts45W-1分别获得93%和85%的敏感性和特异性，结合应用可使敏感性达到100%。
通过偶连剂将小分子物质连接到载体分子上可刺激机体产生良好的抗体反应。
张少华等应用异型双功能连接剂MBS(间一马来酰亚胺苯甲酸一N一羟基琥珀酰亚胺酯)将猪带绦虫六钩蚴18KU重组蛋白(TSOL18)和载体蛋白—牛血清白蛋白(BSA)进行连接，制备连接蛋白 BSA-TSOL18，用以增强TSOL18的免疫原性.连接蛋白利用快速脱盐柱分离技术进行纯化。
结果表明:TSOL18与 BSA偶连摩尔比为1∶3时连接有效，BSA-TSOL18连接物用ELISA方法进行活性鉴定4份免疫兔血清，结果表明BSA-TSOL18连接物的P/N值＞3，连接物均具有与TS0L18的抗原活性。
Manoutcharian等克隆5种猪囊尾蚴和巨颈绦虫囊尾蚴共同表达的抗原，其中的KETc7抗原被认为是猪囊尾蚴保护性抗原。
其后Toledo等重组了猪囊尾蚴和巨颈绦虫囊尾蚴共有的抗原表位KETcl、KETcl2，发现它们对猪囊尾蚴感染具有高度的保护性，可以作为猪囊尾蚴病的候选疫苗。
Vazquez·Talavera等重组了猪囊尾蚴的副肌球蛋白(Tpmy)，即抗原B，以巨颈绦虫为动物模型研究其对猪囊尾蚴病的免疫保护作用，发现其减虫率约52%，具有较好的免疫保护作用。
杨湘越等在巴斯德毕赤酵母中表达42kua猪囊尾蚴抗原cC1，在表达条带处出现了能被抗cC1猪血清多抗所识别的蛋白，表明该表达产物具有天然cC1的免疫原性。
Hancock等成功地克隆并表达了GP50基因，该基因为扁豆状血凝素纯化糖蛋白(LLGP)抗原的成分之一，实验证明该重组抗原GP50在Western blot实验中与猪囊尾蚴病人血清反应的特异性达到100%，且该重组抗原与经LLGP确定为阳性血清反应的敏感性为90%，这就进一步证实重组抗原具有很高的免疫学活性和更高的特异性。
郭爱疆，岳城等利用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)，从猪囊尾蚴虫体中扩增出小热休克蛋白(small Heashock protein，sHSP)基因，克隆至原核表达栽体pGEX—4T-1，在大肠杆菌BL2中以GST融合蛋白的形式表达。
表达产物为64 Ku的融合蛋白。
免疫学分析(Western blot，ELISA)结果表明，sHSP能与猪囊尾蚴血清反应。
将表达产物免疫小鼠，进行Western blot和ELISA检测，其抗血清能与猪囊虫粗抗原及纯化的sHSP重组融合蛋白产物发生免疫学反应。
说明从猪囊尾蚴虫体中扩增出小热休克蛋白(small Heashock protein，sHSP)基因的表达蛋白能够作为囊虫病疫苗的免疫原进行大量研究。
该研究为丰富新的诊断试剂和免疫用重组抗原具有重要意义。
2 猪囊尾蚴病基因工程疫苗基因工程疫苗是使用DNA重组生物技术，把天然的或人工合成的遗传物质定向插入细菌、酵母菌或哺乳动物细胞中，使之充分表达，经纯化后而制得的疫苗。
应用基因工程技术能制出不含感染性物质的亚单位疫苗、稳定的减毒疫苗及能预防多种疾病的多价疫苗。
随着对猪囊尾蚴病研究的不断深入，研究者们通过对囊尾蚴的相关基因进行大量研究，寄希望找出免疫原性和反应原性较好的基因。
随着分子生物学的发展，人们开始通过基因工程技术大量制备特异的ES抗原。
因此，利用基因重组技术在体外表达排泄分泌抗原将会在囊虫病的免疫诊断和免疫预防中发挥重要的作用和保护效应。
在猪带绦虫六钩蚴抗原方面，唐雨德等从猪带绦虫六钩蚴cDNA文库中筛选目的基因并进行克隆表达，重组抗原用血清学方法和猪体免疫试验进行鉴定，筛选保护性抗原基因。
将该基因表达纯化纯化，并与免疫刺激复合物佐剂结合，制成猪囊虫病基因工程疫苗。
应用昆明小鼠建立了猪囊虫病的实验动物模型，进行上述疫苗的免疫预防试验，免疫1次和2次的免疫保护率分别为96.9%和98.4%。
动物的免疫预防试验显示，疫苗安全性好，且免疫组发现的囊虫多数已死亡。
在流行区进行的现场试验和区域试验表明，免疫猪无不良反应，囊虫感染率由20%降为1.1%，取得了满意的效果。
丁军涛将改造好的Tsol18基因片段插入Asd+的组成型表达载体pYA3341，构建重组表达载体pYA3341-Tsol18，将重组载体电转化入缺失腺苷酸环化酶(△asd)的减毒鼠伤寒沙门氏菌X4550，构建活载体疫苗株X4550(pYA3341-Tsol18)表达Tsol18重组蛋白的抗原性，结果显示重组疫苗X4550(pYA3341-Tsol18)在没有选择压力的情况下连续培养100代后，随机挑选的重组疫苗菌株全部都能生长和表达Tsol18重组蛋白，经BALB/c小鼠口服重组疫苗2.0×1012cfu 30d后，存活率100%，证明重组疫苗口服安全可靠，小鼠口服免疫后第21 d在脾脏仍能检测到大量的重组疫苗株，表明重组疫苗在体内能够长期存活，有利于刺激机体产生持久的免疫应答。
3 展望各种抗原和疫苗种类繁多，对囊尾蚴病诊断和免疫预防都有很好的效果，但兽医工作者更希望找出相比有高效、持久、广谱、简便、廉价、无致病性等优点的疫苗。
有学者把核酸疫苗誉为“疫苗的第三次革命”。
在寄生虫病疫苗方面，核酸疫苗也迅速得以研究应用，也得到许多学者的关注。
人们将病原的保护性抗原编码的基因片段克隆入真核表达质粒载体，直接用来免疫动物，通过转染动物细胞而在动物体内目的基因直接表达，使动物获得免疫。
或者将病原的毒力相关基因删除掉，使成为不带毒力相关基因的基因缺失苗免疫动物，取得了一定的进展。
