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简单染色法革兰氏染色法抗酸染色法死菌鉴别染色法芽孢染色法姬姆萨染色法细菌染色法活菌：美蓝或氧化三苯基四氮唑（TTC）染料：染料是一类苯环上带有发色基团和助色基团的有机化合物。
前者赋予染料颜色特征，后者使染料能形成盐。
染料通过离子键、共价键或疏水作用实现染色常用的微生物细胞染料都是盐，分酸性染料和碱性染料两大类：美蓝（即亚甲蓝）、结晶紫、碱性复红、番红（即沙黄）、孔雀绿等都属于碱性染料；酸性复红、伊红及刚果红属于酸性染料。
碱性染料带正电荷酸性染料带负电荷。
微生物染色原理：在中性、碱性或弱酸性溶液中，细菌细胞通常带负电荷；碱性染料在电离时，其分子的染色部分带正电荷，易与细胞结合使其着色。
细胞处于酸性条件下（如细菌分解糖类产酸），所带正电荷增加，可采用酸性染料染色。
染色种类:简单染色：利用单一染料对菌体进行染色。
常用碱性染料进行简单染色，这是因为：细菌的等电点较低，pH值大约在2—5之间，故在中性、碱性或弱酸性溶液中，菌体蛋白质电离后带阴电荷；而碱性染料电离时染料离子带阳电。
因此，带阴电的细菌常和带阳电的碱性染料进行结合。
所以，在细菌学上常用碱性染料进行染色。
常用作简单染色的染料有：美蓝、结晶紫、碱性复红等。
操作步骤1．涂片：用灼烧灭菌冷却后的接种环挑取少量菌体与水滴充分混匀，涂成极薄的菌膜。
2．干燥：可自然晾干，或将涂片置于火焰高处微热烘干，但不能直接在火焰上烘烤。
3．固定：手执玻片一端，有菌膜的一面朝上，通过迅速通过火焰2-3次（用手指触涂片反面，以不烫手为宜）。
4．染色：加适量(以盖满菌膜为度)结晶紫染色液(或石炭酸复红液)，染l～2min。
5．水洗：用自来冲洗至流下的水中无染色液的颜色时为止。
6．干燥7．镜检鉴别染色：使用两种以上的染料进行染色，以区分不同类群的细菌，如革兰氏染色。
革兰氏染色:原理：G-菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经番红复染后就成红色。
微生物的染色实验报告微生物的染色实验报告一、引言微生物是一类极小的生物体，包括细菌、真菌和病毒等。
它们在自然界中广泛存在，对人类的生活和健康具有重要影响。
为了更好地研究微生物的形态和结构，染色实验成为一种常用的方法。
本实验旨在通过染色技术观察微生物的形态和结构。
二、实验材料和方法1. 实验材料：（1）细菌标本：如大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等；（2）染色试剂：如甲基蓝、碘液等；（3）显微镜和玻片。
2. 实验方法：（1）制备细菌涂片：取一滴细菌液滴在玻片上，用另一块玻片将其均匀涂开。
（2）甲基蓝染色：将制备好的细菌涂片放入甲基蓝溶液中浸泡片刻，然后用水冲洗净。
（3）碘液染色：将经过甲基蓝染色的细菌涂片放入碘液中浸泡片刻，然后用水冲洗净。
（4）观察：将染好色的细菌涂片放在显微镜下观察，并记录所见。
三、实验结果经过甲基蓝染色和碘液染色后，观察到细菌在显微镜下呈现出不同的形态和结构。
1. 大肠杆菌大肠杆菌是一种革兰氏阴性细菌，呈杆状。
在染色后，我们观察到大肠杆菌呈现出深蓝色，细胞形态清晰可见。
通过放大镜，我们可以看到大肠杆菌的细胞体长约为2-3微米，直径约为0.5微米。
细菌细胞内部还可观察到细胞核和胞质等结构。
2. 金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌是一种革兰氏阳性细菌，呈球状。
在染色后，我们观察到金黄色葡萄球菌呈现出浅蓝色，细胞形态圆润。
放大镜下，我们可以看到葡萄球菌的细胞直径约为1微米左右，呈团状生长。
细菌细胞内部可见到细胞壁和胞质等结构。
四、实验讨论通过本实验，我们成功地使用染色技术观察了大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的形态和结构。
染色技术能够使细菌在显微镜下更加清晰可见，有助于研究微生物的特征和生理功能。
细菌的染色实验是一种常用的方法，不仅可以观察细菌的形态和结构，还可以帮助鉴定不同种类的细菌。
在实际应用中，染色技术在医学、食品安全和环境监测等领域具有重要作用。
例如，医生可以通过染色技术快速鉴定细菌感染的类型，从而指导治疗方案的选择。
微生物制片显微观察及检测技术微生物是一类不能看见的生物体，它们很小、很微弱。
为了观察和检测微生物，科学家们开发出了多种显微观察和检测技术。
本文将介绍一些常用的微生物制片技术及显微观察和检测技术。
微生物制片技术主要是将微生物样本制备成薄片以便进行显微观察。
常用的制片技术包括固定、包埋和切片。
固定是将微生物样本中的细胞或细菌固定在载玻片上，常用的方法有热固定、酒精固定和甲醛固定等。
包埋是将固定的微生物样本包裹在固体介质中，通常用于切片前的处理，常用的方法有冰冻包埋和石蜡包埋。
切片是将包埋的微生物样本切成薄片，常用的方法有冷冻切片和石蜡切片。
显微观察技术是利用显微镜观察微生物样本的细节和特征。
常用的显微观察技术包括光学显微镜和电子显微镜。
光学显微镜是利用光线通过样本并经过透镜放大观察，主要适用于观察细菌、真菌、原生动物等较大的微生物。
电子显微镜是利用电子束通过样本并经过电磁透镜放大观察，主要适用于观察细菌、病毒等较小的微生物。
电子显微镜分为扫描电子显微镜和透射电子显微镜两种，扫描电子显微镜适用于表面观察，透射电子显微镜适用于内部观察。
检测技术是用于检测微生物样本中的特定组分或特定物质。
常用的检测技术有免疫荧光检测法、酶联免疫吸附检测法和聚合酶链反应检测法等。
免疫荧光检测法是利用荧光染料标记的抗体与特定抗原结合形成复合物，通过显微镜观察荧光信号来检测微生物样本。
酶联免疫吸附检测法是利用酶标记的抗体与特定抗原结合形成复合物，通过显色反应来检测微生物样本。
聚合酶链反应检测法是利用特定的引物和酶来扩增微生物样本中的特定基因片段，通过电泳分析来检测扩增产物。
除了上述的微生物制片技术、显微观察和检测技术，还有一些其他的辅助技术可以提高微生物观察和检测的效果。
例如，染色技术可以通过染色一些特定物质来突出显示微生物样本中的细节和结构。
常用的染色技术有普鲁士蓝染色、格拉姆染色和伊汀染色等。
荧光标记技术可以通过标记荧光染料来突出显示微生物样本中的特定组分。
微生物的制片染色技术微生物的细胞含水量大（一般可达80～90％或更高），菌体薄而透明，折光性强，因此，除观察活细胞外，绝大多数情况下，都必须经过染色才能在显微镜下观察。
至于细菌的特殊结构——鞭毛、芽孢、荚膜，以及真菌的有性或无性孢子等，均需经特殊方法染色后，才能进行观察。
细菌的制片染色细菌涂片的制作与简单染色涂片制作：在干净载片上加清水1滴，用接种环（或牙签）取纯培养菌种（或牙垢等含菌标本）少许，与水混匀，涂布成薄层，在酒精灯火焰上方微热烘干，杀死菌体并使其固定在载片上。
注意：载片一定要清洁无油，即水滴可均匀散开，不收缩；取样要适当，不可过多；涂片要薄而均匀，干后呈淡乳白色、半透明状；烘干过程载片背面保持温热。
简单染色：在涂片上滴1滴复红或其他染色液，染色1分钟，倾去染料，用水沿玻片一侧轻轻冲去多余染料，擦干载片背面及周围水渍，风干，镜检。
此方法用于观察细菌外形及大小。
革兰氏染色细菌学中广泛使用的一种染色方法。
用于鉴别细菌，可将细菌分为革兰氏染色阳性及革兰氏染色阴性两大类。
染色步骤：用上述方法制备细菌涂片，干燥后，加结晶紫1滴，初染1分钟，用水冲去多余的染料；稍干后，加媒染剂卢戈氏碘液2～3滴，固定1～2分钟，用水冲去碘液；稍干后，加95％酒精1～2滴，脱色20～30秒，迅速用水冲洗（此时革兰氏阳性菌紫色，阴性菌无色）；滴加0.5％番红1滴复染1分钟，使被脱色的阴性菌着色。
镜检时，阳性菌紫色，阴性菌红色。
革兰氏染色的关键为酒精脱色，脱色过轻，阴性菌脱不掉紫色；若脱色过重，阳性菌的紫色也会脱掉。
因此，染色时首先应制好薄而均匀的涂片，并掌握好脱色时间。
此外还应注意菌龄，某些革兰氏染色阳性菌，其老龄菌常呈阴性反应，因此，染色用菌种应是24小时内的培养物。
特殊结构染色细菌的鞭毛、芽孢、荚膜等特殊结构，必须用特殊方法才能使其着色。
芽孢染色：芽孢壁较厚，染料不易透过，但着色后亦不易脱色。
芽孢染色一般需用培养24～48小时的菌种，涂片风干后，加5％孔雀绿染液3～5滴，用酒精灯微火加热至出现蒸气（不断补充染液，使其保持不干，也不沸腾），染色5～10分钟，冷却后，用水冲洗，再用0.5％番红液复染1分钟，水洗，风干后镜检。
菌体红色，芽孢绿色。
用结晶紫等染液对芽孢菌简单染色，也可看到芽孢，此时染料使未形成芽孢的菌体着色，芽孢壁亦稍着色，芽孢内部为一未着色的空圈，若芽孢已脱离菌体，可形成一四周着色的空圈，在显微镜下清晰可见。
荚膜染色：荚膜对染料的亲和力较差，不易着色。
用简单染色法可使菌体着色，荚膜呈浅色或无色，镜检时可见，但不易与背景区分。
若经简单染色后（石碳酸复红染1分钟，水洗，风干），在载片的一侧加墨汁1滴，再用吸水纸条吸引，使墨汁经涂菌面引向另一侧，风干后镜检，菌体红色，背景黑色，菌体周围不着色的一圈即荚膜。
荚膜染色用培养24～48小时的产荚膜菌种（常用圆褐固氮菌）。
因荚膜较薄且易变形或脱落，故制片时要轻轻涂抹，不加热，自然风干固定，以免荚膜变形。
鞭毛染色：细菌的鞭毛直径仅0.02～0.03微米，经特殊方法染色处理后，可在光学显微镜下观察。
染色方法各有不同，但主要原理都是用不稳定的胶体溶液为媒染剂，使其沉淀在鞭毛上，经染色后，鞭毛加粗。
鞭毛染色所用菌种需在新制备的斜面培养基上培养16～20小时。
如菌种长期未用，需在新鲜培养基上连续移种2～3次，使其活化。
染色步骤：（1）在培养好的菌种斜面管中，沿管壁加入0.5～1毫升无菌水，放37℃温箱中静置半小时，制成菌悬液。
用滴管自表面取菌液，滴在干净的载玻片上，每片1滴，可连续滴数片。
轻轻晃动玻片，使菌液散开成片（不可涂布，以免鞭毛脱落），平放风干。
（2）滴加甲液，静置3～5分钟，用蒸馏水轻轻冲洗，将甲液充分洗去，再用乙液冲去残水，加乙液数滴，在酒精灯上微温，使产生蒸气但勿干涸，经30～60秒，用蒸馏水轻轻冲去乙液。
擦去背面及周围水渍，风干。
甲、乙液见鞭毛染色剂。
镜检可见菌体褐色，鞭毛浅褐色。
应多找几个视野，因往往只在部分视野能见到已着色的具鞭毛的菌体。
注意：鞭毛染色所用玻片必须十分清洁，毫无油渍；操作过程各步均需认真仔细。
细菌运动的观察生有鞭毛的细菌，可在水中自由运动（快速前进、摆动或滚动），用适当方法，可在高倍镜下观察细菌（纯菌种，或牙垢，污水）的运动。
最简便的方法即压滴法：取十分清洁的盖片及载片，在载片中央滴上菌液，将盖片一侧接触菌液缓缓放下，使其稍悬浮但无气泡，轻轻放在载物台上，将视野调暗，先用低倍镜，再用高倍镜观察，小而透明的菌体常呈淡绿色的小亮点或细小的杆状，运动迅速。
观察细菌运动的关键是载片和盖片必须十分清洁，毫无油渍。
若使用有鞭毛菌的纯菌种，应按鞭毛染色的菌种要求进行活化和培养。
用高倍镜观察时必须十分仔细，以免污染或损坏镜头。
常用细菌染色剂的配制细菌的菌体多带负电荷，易和带正电荷的碱性染料结合而着色。
常用的结晶紫、复红、美蓝、孔雀绿等，均为碱性染料。
普通染色用的染色剂配制方法：石碳酸复红：碱性复红（basic fuchsin）0.5克，溶于95％酒精10毫升；石碳酸5克，溶于蒸馏水95毫升，两液混合，摇匀，用滤纸过滤。
用时稀释5～10倍，保存原液。
吕氏美蓝：美蓝酒精饱和液（美蓝（methylene blue）5克溶于95％酒精）30毫升；0.01％KOH水溶液100毫升，二液混合，过滤。
革兰氏染色剂：结晶紫（crystal violet）染液：甲液：结晶紫2克，95％乙醇20毫升。
乙液：草酸铵0.8克，蒸馏水80毫升。
结晶紫与酒精混匀，搅拌至溶解；草酸铵溶于蒸馏水中，二液混合，摇匀，静置48小时后使用。
此液置棕色瓶中可保存数月。
亦常用于简单染色。
卢戈（Lugol）氏碘液：碘片（I2）1克，碘化钾（KI）2克，蒸馏水300毫升。
先用少量蒸馏水溶解碘化钾，再投入碘片，溶解后，加入余下的蒸馏水，置棕色瓶中。
可保存数月。
0.5％番红：番红O（safraninO，藏红O）0.5克，溶于95％酒精20毫升，再加蒸馏水80毫升。
芽孢染色剂：孔雀绿染液：孔雀绿（malachita green）5克，加少量蒸馏水搅拌溶解，稀释至100毫升，静置半小时，过滤后保存。
0.5％番红。
鞭毛染色剂：甲液：丹宁酸5克，三氯化铁（FeCl3）1.5克，福尔马林（15％）2毫升，1％氢氧化钠（NaOH）1毫升，蒸馏水100毫升。
用蒸馏水溶解丹宁酸、三氯化铁，再加入福尔马林、氢氧化钠。
乙液：硝酸银（AgNO3）2克，蒸馏水100毫升，搅拌至溶解，取出10毫升备用；向其余90毫升硝酸银中滴加浓氨水（NH4OH），即形成浓厚的沉淀，继续加至沉淀刚刚消失，成为澄清溶液。
向此澄清液中缓缓滴入备用的硝酸银液，可出现薄雾，轻轻摇动，直至薄雾经摇后不消失为止。
注意切勿过量！鞭毛染液配制过程必须严格操作，配成的染液应当天使用，过夜一般无效。
放线菌的制片方法放线菌的菌丝纤细，宽度近似杆状细菌；营养菌丝与基质结合紧密，不易观察。
为了在显微镜下观察放线菌的完整形态，可用玻璃纸法培养。
具体方法是：1.按无菌操作要求，在无菌培养皿中倒入培养基，待凝固后，放上一块灭过菌的玻璃纸（将剪成近于培养皿大小的玻璃纸夹在两层白纸中，放培养皿中灭菌后，取出备用），使其在培养基上展平并紧贴在培养基上。
在玻璃纸上接种0.1～0.2毫升放线菌孢子悬液，涂均匀，盖好后，将平皿倒置于25～28℃温箱中培养5～7天，待玻璃纸上长出白色绒毛状菌丝后，取出培养皿。
2.在一块干净载片上滴一滴水，从长菌的玻璃纸边缘剪下一小块，以其下面接触水面并展平，使无气泡，用吸水纸吸去多余的水。
注意勿使生长放线菌的玻璃纸面上沾水，以免污染镜头和影响清晰度。
观察时，不加盖片，在低倍镜下找到成团的菌丝体，再换高倍镜观察。
首先看到孢子丝、气生菌丝，再向下轻调细螺旋，可看到平展分枝的基质菌丝。
用此方法也可观察青霉、曲霉等霉菌，但接种孢子量应比放线菌少，所用培养基、培养时间和温度均按霉菌要求。
霉菌的制片方法霉菌的菌丝比放线菌粗，宽度平均3～10微米，在低倍镜下即可观察。
其菌丝也分为气生菌丝和基质菌丝。
为观察自然生长的霉菌整体形态，也需要与培养方法结合。
除采用上述玻璃纸法培养观察外，还可采用载片培养法。
具体方法如下：1.在无菌培养皿中放入折叠成4～5层的长方形无菌滤纸，加入3～5毫升冷开水，使滤纸浸湿，但不淹没。
取一干净载片，用酒精沾湿，在酒精灯火焰上灼烧灭菌。
稍凉后，放入培养皿中，置滤纸上。
2.用无菌吸管吸取少量熔化的马铃薯琼脂培养基，半开皿盖并使培养皿稍倾斜，迅速将培养基滴散在载片上，使在中央成一薄层（厚度不超过1毫米）。
3.用接种环沾取少量霉菌孢子，接种在已凝固的培养基上，注意使孢子散开。
盖好皿盖，放25～28℃温箱中培养3～5天，待长出白色菌丝及浅色的孢子时，取出载片，擦干背面及四周的水渍，置低倍镜下，调节焦距，可清晰看到向上生长的繁殖菌丝和平面生长的营养菌丝。
此种载片培养，若保持平皿内的湿度，置低温下可保存1～2周。
酵母菌的制片方法酵母菌细胞较大，宽1～5微米，在自然界常见于含糖较多的果实、蔬菜表面及土壤中，用适当方法培养后，在低倍镜下即可观察其细胞及出芽生殖。
1.配制2％的糖水（葡萄糖、蔗糖均可），放入干净的瓶中，加稀盐酸至pH3～4，接入几块成熟的葡萄皮或苹果皮（不要洗），瓶口加棉塞或纱布。
置25～28℃温箱培养1～2天，待培养液中出现混浊或沉淀后即可取出。
亦可用市售鲜酵母培养。
2.用吸管自瓶底吸取少量培养液，滴在干净载片上，自液滴一侧轻轻盖上盖片，注意勿使产生气泡，用吸水纸吸去多余水分，即可观察。
若在盖片一侧滴1滴稀释美蓝染液，用滤纸在盖片另一侧吸水，使美蓝进入盖片下与菌液混合，在显微镜下观察，可见到酵母菌的死细胞染成蓝色，活细胞无色或浅黄绿色。
