常见标本细菌涂片-1

细菌涂片和革兰染色法是常用的微生物学实验技术，用于观察和鉴定细菌。

细菌涂片是一种简单而常见的方法，用于制备细菌样品的薄层。

它通常包括以下步骤：
1.取少量细菌样品：从培养基或临床标本中取少量细菌，并使用吸管或接种环在玻璃
片上均匀涂抹。

2.干燥：将涂片放置在室温下使其自然干燥，以确保细菌固定在玻璃片上。

3.固定：通过加热或使用特定化学药剂（如甲醇）进行固定，以保持细菌在涂片上的
形态结构。

4.染色：涂片可以使用不同的染色方法进行染色，例如格拉姆染色、苏木精染色等，
以区分不同类型的细菌。

5.观察：准备好的细菌涂片可在显微镜下观察。

通过观察细菌的形态、大小、排列方
式等特征，可以初步判断细菌的类型和特性。

革兰染色法是最常用的细菌染色方法之一，用于区分细菌的革兰氏阳性（G+）和革兰氏阴性（G-）两类。

它包括以下步骤：
1.取少量细菌样品：从培养基或临床标本中取少量细菌，并涂抹在玻璃片上。

2.固定：对细菌进行固定，通常使用加热的方法使其附着在玻璃片上。

3.染色：首先将细菌涂片涂上紫色的革兰染色试剂（如紫晶染剂），然后用碘溶液形
成复合物。

接下来，使用酒精溶液洗去多余染料，并进行脱色。

最后，用蓝色的对
照染剂（如苏木精）进行染色。

4.观察：通过显微镜下观察细菌涂片。

革兰阳性细菌会呈现紫色或深紫色，而革兰阴
性细菌则呈现粉红色。

革兰染色法的结果可以提供有关细菌类型及其细胞壁结构的信息，这对于细菌分类和鉴定非常重要。

它是微生物学中常用的一种初步鉴定方法。

实验一 细菌形态和结构观察，涂片制作及染色法 课程名称：兽医微生物学 实验学时： 2学时一、目的要求1．了解、熟悉油镜的使用和使用原理。

2．掌握细菌抹片的制备及美蓝和革兰氏染色方法。

3．能够识别革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的染色特征。

4．熟悉细菌的基本形态学特征和特殊构造。

二、知识背景细菌个体微小，无色透明，在一般显微镜下不易识别，必须用适当的染料使其着色后，才能看到其形态、排列和结构。

某些细菌因有特殊的染色性，更可借特殊的染色方法加以鉴别。

因此染色技术是细菌鉴定中的基本技术之一。

检查微生物标本，需要使用显微镜。

比较多用的是普通光学显微镜。

根据不同要求，可使用暗视野显微镜、相差显微镜、荧光显微镜和电子显微镜。

前几种显微镜用可见光线或紫外光线作照明光源，它们都属于光学显微镜；电子显微镜则是用电子流代替照明光源，与光学显微镜不同。

［普通光学显微镜的构造和使用］普通光学显微镜（或称生物显微镜）的构造，使用与保护方法，已在《组织学与胚胎学》教材中讲过，这里概述油镜的原理和使用要点：检查细菌标本，多用油镜进行，油镜是一种高倍放大（95-100倍）的物镜，一般都标有放大倍数（如95×；100×等）和特别标记，以便识别。

国产镜多用“油”字表示，国外产品则常用“Oil 或“HI”作记号。

油镜上还常漆有黑环或红环，而且油镜镜身比高倍镜和低倍镜长，镜片最小，这也是识别的另一个标志。

油镜头的晶片细小，进入镜中的光量也较少，其视野比用高倍镜时为暗。

当油镜头和载玻片之间为空气层所隔时，因为空气的折光指数与玻璃的不同，故有一部分光线被折射而不能进入镜头之内，使视野更暗；若在镜头与载玻片之间放上与玻璃的折光指数相似的油类，如香柏油等，使光线不致于因折射而大为损失，则可使视野充分照明，并能使操作者清楚地进行观察和检查（图l ）。

实验室中几种常用物质的折光指数 品名 玻璃 檀香油香柏油 加拿大树胶二甲苯 液体石蜡松节油甘油 水 折光指数 1.52-1.59 1.52 1.51 1.52 1.49 1.48 1.47 1.47 1.33进行油镜检查时，应先对好光线，但不可直对阳光，采取最强亮度（升高集光器，开大光圈，调好反光镜等）。

常见微生物标本的采集、处理与检测标本采集的基本原则：尽早采集、根据可疑的病原体，选择不同采集时机和标本种类、在抗生素应用前采集、遵守无菌操作、正确保存和运送。

容器应密封不易碎，标本不得污染容器的口和外壁。

1.血液标本正常人的血液是无菌的。

当细菌侵入时可引起严重的菌血症或败血症。

一般情况下在患者发热初期或发热高峰时采集；持续性菌血症可随时采集；间歇性菌血症，应预测其体温上升期进行采血。

一般在使用抗生素前采集2~3次；多部位采集，如两侧肘静脉或动、静脉同时采取；对于已使用抗生素而无法停止的患者，也应在下次用药前采取。

在感染局部的附近血管中采血，可提高阳性率。

采血量成人一般5~10ml，婴幼儿1~2ml。

采集的血液标本注入培养瓶中先进行增菌培养，培养基和血液标本量的比例应>10：1，将血液中的各类杀（抑）菌物质充分稀释。

需氧菌常用培养基有胰酪蛋白大豆胨肉汤和葡萄糖酚红肉汤等，常加入对氨基苯甲酸（PABA）50μg/ml中和磺胺类，青霉素酶2单位/ml破坏青霉素类，硫酸镁中和链霉素、四环素、土霉素、金霉素、新霉素及多粘菌素等抗生素。

加入0.03~0.05%的聚茴香磺酸钠（sodium polyanethol sulfonate, SPS）可抑制血清中的抗菌物质，并对氨基糖苷类和多肽类抗生素有灭活效果。

并加入Ⅹ、Ⅴ因子等生长因子。

培养瓶每天观察一次。

如发现①培养瓶内液体浑浊；②血球层上面出现颗粒状的生长物，并且有自下而上的溶血；③有明显的凝块；④液体表面有菌膜，培养液清晰或浑浊等，表明有细菌生长。

直接进行涂片染色初步报告。

同时分别接种血平板、巧克力（色）平板，普通培养和5%CO2 35℃培养。

也可直接进行体外药敏试验。

无细菌生长迹象的培养瓶孵育至第7d，接种血平板、巧克力（色）平板，分别进行普通培养和5%CO2环境35℃孵育24h。

为了提高检出的速度，在培养的第2~3d时应移种一次。

有厌氧菌感染时，同时注入需氧瓶和厌氧瓶，厌氧培养基通常用硫乙醇酸盐培养基、牛心脑浸液肉汤等；培养液中有刃天青，无氧时无色，有氧时呈红色。

细菌涂片法步骤
涂片法是装片法制作玻片标本的一种方法。

制作方法是，细菌可以用细菌液直接涂布在载玻片上，盖上盖片直接观察或干燥后染色观察，染色观察通常需要洗去染色液后观察。

为了观察细菌的典型形态,应取处于对数生长期的细菌进行涂片。

实验准备材料：酒精灯、接种环、染液、载玻片、菌种、生理盐水等步骤：
1.取清洁无油玻片一块，置火焰上通过数次，用烧灼并冷却了的接种环取菌液1～2环，均匀涂布于载玻片中央（直径1～1.5 cm）。

注意：将接种环在火焰上烧灼灭菌，要保证接种环是无菌的。

3.待接种环冷却后从固体培养基上挑取少许菌落，注意挑取菌落不宜太多，避免造成细菌堆积。

4.将接种环挑取的菌落与置于载玻片的生理盐水上混匀，形成直径约1cm的涂面，要薄而均匀，使细菌呈现单层分布，涂匀后再次将接种环在酒精灯上烧灼灭菌。

5.干燥：涂片放室温自然干燥；也可将标本面向上，在离火焰约15 cm高处微微加热烘干，切勿靠近火焰；或用电吹风吹干。

6.固定涂片：常用加热固定法，固定的方法是手执载玻片一端，标本面向上，在火焰外焰上水平地以钟摆速度来回通过3次，注意温度不宜太高，以玻片反面触及手背部皮肤感觉热而不烫为宜。

涂片的制作有一定要求，即涂片不能太厚，细菌在涂片中应呈单层分布。

肺炎克雷伯菌1.宇文皓月2.形态结构：肺炎克雷伯菌肺炎亚种为革兰阴性杆菌，无鞭毛，无芽孢，标本直接涂片或在营养丰富培养基上的营养物可见菌体外有明显的荚膜。

3.培养特性：兼性厌氧，营养要求不高，在初次分离培养基可形成较大、凸起灰白色黏液型的菌落。

菌落大而厚实、光亮，相邻菌落容易发生融合，用接种蘸取时可挑出长丝状细丝。

在麦康凯琼脂（MAC）培养基上形成较大的黏液型、红色的菌落，红色可扩散至菌落周围的培养基中。

在伊红美蓝琼脂（EMB）上为大、粘稠、红色、易融合成一片的菌落。

在血琼脂上为灰白色、大而黏、光亮且形成菌丝的菌落。

4.生化特性：氧化酶阴性，葡萄糖产酸产气，动力阴性，吲哚阴性，脲酶阳性。

金黄色葡萄球菌典型的金黄色葡萄球菌为球型，直径0.8μm左右，显微镜下排列成葡萄串状。

金黄色葡萄球菌无芽胞、鞭毛，大多数无荚膜，革兰氏染色阳性。

金黄色葡萄球菌营养要求不高，在普通培养基上生长良好，需氧或兼性厌氧，最适生长温度37°C，最适生长pH7.4。

平板上菌落厚、有光泽、圆形凸起，直径1-2mm。

血平板菌落周围形成透明的溶血环。

在EMB培养基上基本不生长。

金黄色葡萄球菌有高度的耐盐性，可在10-15%NaCl肉汤中生长。

可分解葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖，产酸不产气。

甲基红反应阳性，VP反应弱阳性。

许多菌株可分解精氨酸，水解尿素，还原硝酸盐，液化明胶。

金黄色葡萄球菌具有较强的抵抗力，对磺胺类药物敏感性低，但对青霉素、红霉素等高度敏感。

大肠埃希氏菌1．形态与染色特性菌体两端钝圆、中等大小，杆状(有时呈卵圆形)、1—3um X0.6um、周生鞭毛，能运动，不发生荚膜，革兰氏阴性，而且一般是对碱性染料着色较好，但有时两端着色较浓，要与巴氏杆菌区分开来。

2．培养特性1)需氧及兼性厌氧菌2)对营养的要求不高，在普通琼脂上就生长良好，在15C-45℃范围内均可生长，但最适生长温度为37℃，最适pH为7.2—7.4。

各种标本的涂片检验程序1.概述各种标本涂片的结果一方面可为临床提供快速的诊治依据，同时还可作为分离培养标本的质量指标。

例如，穿刺液（胆汁，胸腔积液，腹水，心包液等），脑脊液标本，因原部位是无菌的，只要检出细菌即可提示感染的原因，具有诊断意义。

粪便标本倡导微生态菌群含量甚多，粪便球杆菌比例涂片检查可反映菌群的数量和比例，有些细菌可通过直接涂片镜检来协助诊断疾病，如霍乱弧菌，难辨梭菌，假丝酵母菌感染等。

痰液涂片除了可初步判定是否有病原菌存在外，还用于确定标本取材是否合格，是否适合做细菌培养。

不同的标涂片检出不同的细菌各有不同的临床意义。

2.脑脊液涂片处理2.1.检验前处理2.1.1.革兰染色：肉眼观察，混浊或脓性脑脊液可直接涂片。

无色透明的脑脊液，首先进行2000r/min离心10min，倒去上清液用沉淀物涂片，经自然或温箱干燥、火焰固定后，进行革兰染色。

2.1.2.抗酸染色（萋-纳染色法）：脑脊液经2000r/min离心10min，倒去上清液后取沉淀物涂片，经自然或温箱干燥、火焰固定后，进行萋-纳法染色。

2.1.3.墨汁染色：脑脊液经2000r/min离心10min后弃去上清液，将离心标本沉淀物放于试管，与墨汁均匀混匀调至恰当的浓度（4:1），取一滴混合物于玻片上，然后盖上盖玻片，直接用高倍镜镜检。

2.2.染色操作各染色操作见《革兰染色操作程序》、《抗酸染色操作程序》、《墨汁染色操作程序》。

2.3.镜检与报告方式2.3.1.脑膜炎奈瑟菌涂片检查：涂片经革兰染色，在油镜下找到革兰阴性、平面相对的双球菌，细菌可位于细胞内或外。

此时可报告临床“找到革兰阴性双球菌位于细胞内（外）”。

如镜检未发现该细菌可报告“未找到革兰阴性双球菌”。

2.3.2.细菌、真菌涂片检查：涂片经革兰染色，根据细菌的染色特点、形态、排列，初步可报告“找到革兰阴性或阳性球菌呈XX排列”；如镜检未发现细菌可报告“未找到细菌”；在油镜下找到革兰阳性真菌孢子或菌丝，可报告“找到真菌孢子或菌丝”；镜检为发现真菌孢子或菌丝可报告“未找到真菌孢子和菌丝”。

细菌染色技术(2010-11-22 22:29:46)目的要求初步掌握细菌涂片制作，单染色法及革兰染色法等染色技术。

实验内容1．细菌染色一般程序涂片干燥固定初染 (媒染) 脱色复染(1) 涂片临床标本或液体培养物可直接涂抹于洁净的载玻片上，固体培养的细菌先在玻璃片上滴一滴生理盐水，然后取菌少许在盐水中磨匀，呈轻度混浊。

涂好的菌膜大小一般以1cm2左右为宜。

(2)干燥涂片最好在室温下自然干燥，或将标本面向上，置于酒精灯火焰高处慢慢烘干，切不可在火焰上烧干。

(3)固定细菌的固定常用火焰加热法，即将上述已干的涂片在火焰中迅速通过3～5次，温度以手能摸时热而不烫为度。

目的在于杀死细菌，凝固细胞质，改变细菌对染料的通透性。

(4) 初染不同的染色方法，所用染液也不同。

染液以覆盖菌膜为度。

(5) 媒染通过媒染可增加染料和被染物质的亲和力。

媒染剂还可用于固定之后，亦可含在固定液或染液中。

(6) 脱色此步骤主要目的是观察细菌与染料间结合的稳定程度，作为鉴别染色之用。

(7) 复染细菌初染色被脱色后常以复染液复染，便于观察。

复染液的颜色与初染液有明显不同。

2．常用染料原液配制一般制备100ml纯酒精饱和溶液所需染料量：美兰2g～5g；结晶紫7g～14g；碱性复红3g～7g。

3．常用的染色方法(1) 单染色法即用一种染料染色的方法。

常用吕氏美兰或稀释石炭酸复红染液。

1) 染液①吕氏美兰液美兰酒精饱和液30ml+0.01%KOH溶液70ml即成。

②稀释石炭酸复红液碱性复红酒精饱和液10ml+5%石炭酸溶液90ml，然后用蒸馏水作10倍稀释即成。

2) 菌种大肠埃希菌普通斜面培养物。

3) 染色方法于已做好的涂片上滴加吕氏美兰或稀释石炭酸复红染液，染色1min，以水冲洗至无颜色流下为止，自然干燥或以远火烘干后镜检。

4) 结果以美兰染色者菌体呈现兰色；以稀释石炭酸复红染色的菌体呈现红色。

(2) 革兰染色法1) 原理细菌被结晶紫着色后，再经媒染剂处理，染成深紫色或紫黑色。