技能训练2 细菌标本片的制备和染色法

技能训练2 细菌标本片的制备和染色法一、目的要求：正确掌握细菌培养物涂片的制作和常用染色法二、设备材料病料、细菌培养物、接种环、玻片、酒精灯、染色缸、染色架、染色液等。

三、操作方法细菌标本片制作的基本步骤为：涂片或触片→干燥→固定→染色→镜检。

(一)细菌涂片的制备1．液体培养物及液体病料(1)涂片用接种环取一滴培养液或液体病料，于玻片的中央均匀地涂布成适当大小的薄层。

(2)干燥一般采用自然干燥，天气较冷时也可于酒精灯火焰上方30～40cm处适当加热干燥。

(3)固定分为火焰固定和化学固定两种。

火焰固定时，将干燥好的玻片涂面朝上，以其背面在酒精灯火焰上来回通过数次，略作加热，以不烫手背为度；化学固定时，可将干燥好的玻片浸入甲醇中2～3min后取出晾干，或在涂片上滴加数滴甲醇使其作用2～3min后自然挥发干燥。

此外，丙酮和酒精也可用作化学固定剂；作瑞特氏染色的涂片不需固定，因染色液中含有甲醇，有固定作用。

(4)染色根据不同的材料和菌种选择不同的染色法。

2．固体培养物用接种环取一滴生理盐水于玻片的中央→用接种环挑取一个菌落于生理盐水中混合→均匀地涂布成适当大小的薄层→干燥→固定→染色。

(二)细菌触片的制备将固体病料(病变组织)作无菌切开→用切面在玻片的中央接触一下或稍用力印压成一薄层→干燥→固定→染色。

(三)细菌的染色法1．单染色法又称简单染色法，即只应用一种染料进行染色的方法。

(1)美蓝染色法在已干燥、固定好的涂片或触片上滴加适量的美蓝染色液1—2min后，水洗，干燥(吸水纸吸干或自然干燥)，镜检。

(2)瑞特氏染色法在已干燥、固定好的涂片或触片上滴加瑞特氏染色液，为避免干燥，可适当多加一些，或视情况补充滴加，1—3min后再加与染液等量的中性蒸馏水或缓冲液，轻轻晃动玻片，使之与染色液混合均匀，再经3—5min后，直接用水冲洗，吸干或烘干后镜检。

也可在玻片上的涂抹处盖一适当大小的滤纸，然后再在滤纸上轻轻滴加瑞特氏染色液，至略浸过滤纸，视情况补充滴加，维持不干，3—5min后直接用水冲洗，吸干或烘干后镜检。

细菌标本片的制备及染色方法1.材料准备-细菌培养物：选择代表性的细菌培养物，如液体培养物、固体培养物、接种物等。

-玻片：选择无痕的玻片，经高温消毒或与有机溶剂清洗后晾干备用。

-液体固定剂：如95%乙醇、甲醛等。

-染色剂：如碘酒、靛蓝溶液、絮状靛蓝等。

-水：经蒸馏水或高纯水处理。

2.细菌标本片制备(1)涂薄法：采取适量的培养物，滴于玻片上，使用无菌铁环将培养物涂匀于玻片表面，待溶液蒸发，自然晾干。

(2)刮刀法：将细菌培养物取下适量，用棉签或刮刀将菌落刮到玻片上，制成薄层。

(3)叠片法：将细菌培养物滴于玻片上，然后使用另一片玻片压在上面，使培养物均匀分布在两片玻片之间。

然后慢慢滑动两片玻片，使液体薄层均匀分布。

3.细菌标本片固定(1)液体固定法：加入同等体积的液体固定剂于细菌标本片上，浸泡5-10分钟。

固定剂能使细菌细胞变硬，保持细胞原态形态。

(2)干燥法：将细菌标本片放置在室温下，自然晾干，使细菌固定在玻片上。

此方法适用于脆性细菌。

4.细菌标本片染色(1)碘酒染色：取适量碘酒滴于细菌标本片上，置于室温下静置10-20秒。

然后用水冲洗，使过多的碘酒洗掉。

(2)靛蓝溶液染色：取适量靛蓝溶液滴于细菌标本片上，置于室温下静置10-20秒。

然后用水冲洗，使过多的靛蓝洗掉。

5.透明化处理(1)絮状靛蓝法：将细菌标本片在300倍以下的低倍率镜下观察，确定细菌形态无误后，将玻片倾斜，滴入絮状靛蓝液。

待颜色由淡到重，停在合适的颜色时，用水冲洗玻片上多余的靛蓝。

(2)水透明化法：可使用蒸馏水或高纯水将细菌标本片浸泡5-10分钟，然后取出晾干。

透明化后，细菌会变得透明，观察细胞内部结构会更清晰。

6.滴水封片在制备完成的细菌标本片上滴一滴蒸馏水或高纯水，将盖片平放在上面。

用纸巾或吸水纸轻轻按压玻片两侧，使水均匀分布。

然后将封片剂滴于玻片四周，使玻片与盖片紧密结合，定期晾干即可。

实验二细菌抹片的制备及染色一、提前十分钟进入实验室，抄写板述。

上课，点名入座。

板述内容：一）、目的要求1、掌握细菌抹片的制备方法2、掌握细菌的革兰氏染色法二）、实验内容1、每人做一张葡萄球菌的固体抹片，用美兰染色。

2、每人做一张大肠杆菌与葡萄球菌的混合抹片，并用革兰氏法染色。

3、油镜观察自制的玻片及真菌标本片，（烟曲霉、黄曲霉、酵母菌）4、组织抹片，并用瑞氏染色液染色（示教）三）作业1、叙述细菌抹片的制备方法2、叙述革兰氏染色的方法3、绘出细菌形态图并注明染色方法二、总结上次实验作业，有两个突出问题。

1、多数同学画的是书上的细菌图，细胞臂、荚膜清晰可见，而镜检时只能看到细菌的大致形态，如大肠杆菌是一个两端钝圆的杆状轮廓，另外，镜检时菌毛和鞭毛是不能观察到的，除非用特殊的染色方法。

2、有的同学没有用圆规画图，图片绘制得过大或过小。

三、实验第一部分：抹片的制备1、实验的目的和意义细菌细胞微小，无色而半透明，原样直接在普通光学显微镜下观察，只能大致见到其外貌，制成抹片和染色之后，则能较清楚地显示其形态和特殊构造，也可以根据不同的染色反应，作为鉴别细菌的一种依据。

2、细菌抹片的制备进行细菌染色之前，须先作好细菌抹片，其方法如下：（1）玻片准备载玻片应清晰透明、洁净而无油渍，滴上水后，能均匀展开，附着性好。

如有油渍，可按下列方法处理：A、滴上95%酒精2-3滴，用洁净纱布揩擦，然后在酒精灯火焰上轻轻拖过几次。

B、若上法仍未能去除油渍，可再滴上1-2滴冰醋酸，用纱布擦净，再在酒精灯火焰上轻轻通过。

（2）抹片所用材料情况不同，抹片方法亦有差异。

A、液体材料（如液体培养物、血液、渗出液、乳汁等）可直接用灭菌接种环取一环材料，于玻片的中央均匀地涂布成适当大小的薄层。

B、非液体材料（如菌落、脓、粪便等）则应先用灭菌接种环取少量生理盐水或蒸馏水，置于玻片中央，然后再用灭菌接种环取少量材料，在液滴中混合，均匀涂布成适当大小的薄层。

实验二细菌抹片的制备及染色一、提前十分钟进入实验室，抄写板述。

上课，点名入座。

板述内容：一）、目的要求1、掌握细菌抹片的制备方法2、掌握细菌的革兰氏染色法二）、实验内容1、每人做一张葡萄球菌的固体抹片，用美兰染色。

2、每人做一张大肠杆菌与葡萄球菌的混合抹片，并用革兰氏法染色。

3、油镜观察自制的玻片及真菌标本片，（烟曲霉、黄曲霉、酵母菌）4、组织抹片，并用瑞氏染色液染色（示教）三）作业1、叙述细菌抹片的制备方法2、叙述革兰氏染色的方法3、绘出细菌形态图并注明染色方法二、总结上次实验作业，有两个突出问题。

1、多数同学画的是书上的细菌图，细胞臂、荚膜清晰可见，而镜检时只能看到细菌的大致形态，如大肠杆菌是一个两端钝圆的杆状轮廓，另外，镜检时菌毛和鞭毛是不能观察到的，除非用特殊的染色方法。

2、有的同学没有用圆规画图，图片绘制得过大或过小。

三、实验第一部分：抹片的制备1、实验的目的和意义细菌细胞微小，无色而半透明，原样直接在普通光学显微镜下观察，只能大致见到其外貌，制成抹片和染色之后，则能较清楚地显示其形态和特殊构造，也可以根据不同的染色反应，作为鉴别细菌的一种依据。

2、细菌抹片的制备进行细菌染色之前，须先作好细菌抹片，其方法如下：（1）玻片准备载玻片应清晰透明、洁净而无油渍，滴上水后，能均匀展开，附着性好。

如有油渍，可按下列方法处理：A、滴上95%酒精2-3滴，用洁净纱布揩擦，然后在酒精灯火焰上轻轻拖过几次。

B、若上法仍未能去除油渍，可再滴上1-2滴冰醋酸，用纱布擦净，再在酒精灯火焰上轻轻通过。

（2）抹片所用材料情况不同，抹片方法亦有差异。

A、液体材料（如液体培养物、血液、渗出液、乳汁等）可直接用灭菌接种环取一环材料，于玻片的中央均匀地涂布成适当大小的薄层。

B、非液体材料（如菌落、脓、粪便等）则应先用灭菌接种环取少量生理盐水或蒸馏水，置于玻片中央，然后再用灭菌接种环取少量材料，在液滴中混合，均匀涂布成适当大小的薄层。

一、细菌标本片的制备1.抹片（1）固体培养物：取洁净的玻片一张，把接种环在酒精灯火焰上灼烧灭菌后，取1-2环无菌生理盐水，放于载玻片的中央，再将接种环灭菌，冷却后，从固体培养基上挑取菌落或菌苔少许，与水混匀，作成直径1cm的涂面。

接种环用后需要灭菌。

（2）液体培养物：可直接用灭菌接种环钩取细菌培养液1-2环，在玻片上作直径1cm涂面。

（3）液体病料（血液，渗出液，腹水）：取一张边缘整齐的载玻片，用一端蘸取血液等液体材料少许，在另一张洁净的玻片上，一45°角均匀推成一薄层的涂面。

（4）组织病料：以无菌剪刀、镊子剪去被检组织一小块，以其新鲜切面在玻片上做3-5个压印或涂抹成适当大小的一薄层。

无论何种方法，切忌涂抹太厚，否则不利于染色和观察2.干燥涂片应在室温下自然干燥，必要时将涂片涂面向上，置于火焰高处微加热干燥。

3.固定（1）火焰固定。

是常用的方法，将干燥好的抹片涂面向上，在火焰上来回通过数次（4-6次），以手背触及玻片微烫手为宜。

（2）化学固定。

有的血片，组织触片用姬姆萨染色时，要用甲醇固定3-5min二、常用的细菌染色法1.美蓝染色法：在经火焰固定的涂片上，滴加适量美蓝染色液覆盖涂面，染色2-3min，水洗，晾干或吸水纸轻压吸干镜检，结果，菌体呈蓝色2.革兰氏染色法。

（1）在固定好的抹片上，滴加草酸铵结晶紫染色液，染1-3min，水洗（2）加革兰氏碘液媒染，作用1-2min，水洗（3）加95%酒精脱色约30s至1min，水洗（4）加稀释石碳酸复红或沙黄水溶液复染30s左右，水洗，吸干后镜检3.瑞士染色法细菌抹片自然干燥后，滴加瑞士染色液于涂片上以固定标本，1-3min后，再滴加与染色液等量的磷酸盐缓冲液或中性蒸馏水与玻片上，轻轻摇晃使染色液混合均匀，5min左右水洗，干后镜检，菌体呈蓝色，组织细胞的胞浆呈红色，细胞核呈蓝色4.姬姆萨染色法。

血片或组织触片自然干燥后，用甲醇固定3-5min，干燥后在其上滴加足量染色液或将抹片浸入盛有染色液的缸里，染色30min，或者染色数小时或24h，取出水洗，吸干或烘干，镜检。

细菌标本片的制备及染色同学们，大家好！今天我们要学习的内容是--《细菌标本片的制备及染色》。

我们这节课要用到的仪器和材料有酒精灯、接种环、载玻片、吸水纸、生理盐水、革兰氏染色液、洗瓶、显微镜、香柏油、擦镜纸、细菌培养物、细菌病料、无菌镊子和剪刀、铅笔等。

（实物照片或网上图片）本次实验的基本流程是：制片—干燥—固定—染色好，我们开始今天的实验:（一）玻片准备：选择干净、清晰、透明、无油渍的载玻片，滴上水后能均匀展开。

（学生演示）（二）细菌标本片的制作过程，根据所用材料不同，制片的方法有差异，这节课我们以制作葡萄球菌标本片为例，给大家做个示范。

1. 先用灭菌接种环取1~2环无菌生理盐水，置于玻片中央，再将接种环灭菌，冷却后挑取少量葡萄球菌，与水混合，涂布成适当大小的薄层。

接种环用后需再次灭菌。

（学生演示）在涂布时切忌涂抹过厚，否则不利于染色和观察。

2.干燥：将涂面向上置火焰高处微烤加热干燥（学生演示）3.固定：将干燥好的抹片涂面向上，在火焰上来回通过数次（一般4~6次），以手背触及玻片微烫手为宜。

（学生演示）固定的目的是使菌体蛋白质凝固，形态固定，易于着色，并且经固定的菌体牢固黏附在玻片上，水洗时不易冲掉。

（三）革兰氏染色法：1.初染：在固定好的抹片上，滴加草酸铵结晶紫染色液，经1~2min，水洗。

2.媒染：加革兰氏碘液媒染，作用1~3min，水洗。

3.脱色：加95%酒精脱色0.5~1min，水洗。

4.复染：加稀释石碳酸复红复染30s左右，水洗，吸干后镜检。

（动画展示或学生演示）结果：革兰氏阳性菌呈蓝紫色，革兰氏阴性菌呈红色。

因葡萄球菌为革兰氏阳性菌，所以称蓝紫色。

（四）镜检观察应用拓展：革兰氏染色液的配制课后练习：同学们根据今天所学的细菌标本片的制备及染色方法，练习大肠杆菌的标本制片及染色。

实验二细菌抹片的制备及染色目的要求1．掌握细菌抹片的制备方法和几种常用的染色方法。

2．认识革兰氏染色的反应特性。

操作步骤染色是细菌学上一个重要而基本的技术。

由于细菌个体微小，且半透明，如不经染色往往不易识别。

因此，借助于染色法可使细菌着色，与背景形成鲜明的对比，便于在显微镜下进行观察。

也可根据不同的染色反应，作为鉴别细菌的一种依据。

一、载玻片处理载玻片应清晰透明，清洁而无油渍，滴上水后，能均匀展开，附着性好，如有残余油渍，可按下列方法处理。

（一）滴上95％酒精2～3滴，用清洁纱布擦拭，然后以钟摆速度通过酒精灯焰3～4次。

（二）若上法仍未能除去油渍，可再滴上1～2滴冰醋酸，用纱布擦净，再在酒精灯火焰上轻轻拖过。

玻片洁净后，用玻璃铅笔在预涂材料处的背面划一个直径1.5cm的圆圈，用以标记。

二、涂片方法（一）菌落涂片方法涂片时，左手握菌种管，右手持接种环（又称铂金耳）取1～2环生理盐水，置于载玻片上，然后将接种环在火焰上灭菌，待冷后，从菌种管内钓取少许菌落，置于生理盐水中混匀，涂成直径1.5cm的涂膜，此膜既薄又均匀为好，待干即成。

（二）菌液涂片法用灭菌接种环沾取菌液（液体培养物、血清、乳汁、组织渗出液等）1～2接种环，均匀涂抹在载玻片上,使成直径为1.5cm左右圆形或椭圆形涂膜，自然干燥后备用。

（三）血液涂片方法先取一张干净无油垢边缘整齐的载玻片，其一端沾取少许血液，以45度角放在另一张干净无油垢的载玻片一端，从这端向另一端推成薄而均匀的血膜，待干后备用。

（四）组织涂片方法先用镊子夹持组织局部，然后以灭菌剪刀剪取一小块，夹出后以其新鲜切面在载玻片上压印或涂成一薄层。

三、干燥涂片最好在室温中自然干燥。

必要时，可将标本面向上，在离酒精灯火焰远处烘干，切勿紧靠火焰，以免标本糊焦而不能检查。

四、固定有两种固定方法（一）火焰固定将已干燥好的抹片，使涂面向上，以钟摆速度通过酒精灯火焰四次，使固定后的标本触及皮肤时，稍感烧烫为度。