总抗氧化能力检测试剂盒 (FRAP 法 )

小麦叶片总抗氧化能力测定（ F R A P 法）一、实验原理FRAP 法测定总抗氧化能力的原理是酸性条件下抗氧化物可以还原Ferric-tri-pyridyl-tria-zine（Fe 3+-TPTZ）产生蓝色的Fe2+-TPTZ,随后在593nm测定蓝色的Fe2+-TPTZ即可获得样品中的总抗氧化能力。

由于反应在酸性条件下进行，可以抑制内源性的一些干扰因素。

并且由于血浆等样品中的铁离子或亚铁离子的总浓度通常低于10 yM,因此血浆等样品中的铁离子或亚铁离子不会显着干扰FRAP法的检测反应。

由于反应体系中的铁离子或亚铁离子是和TPTZ螯合的，样品本身含有的少量金属离子螯合剂通常也不会显着影响检测反应。

AntioxidantFe3+-TPTZ （橘黄色） ------------- > Fe2+-TPTZ （蓝色）二、实验步骤1.FRAP工作液配制：0.3 MpH3.6醋酸缓冲液：0.364g无水醋酸钠+3.2mL冰乙酸定容至200mL用1MHCI 调节pH至3.6 ;10mmol/L TPTZ溶液25mL 0.078g TPTZ 用40mM盐酸溶液定容至25mL20mmol/L FeCh溶液50mL 2.78g 用RO水定容至50mL上述溶液以10:1:1 的比例混合（现配现用）。

2.取叶片0.1g，加入2.5mL蒸馏水研磨稍沉淀后取1.5mL 12000g离心10min （4o C）,取上清液。

3.在反应管中加入100uL上清液，再加入2.4mL工作液，37°C条件下水浴10min,于593nm 处测定吸光度，4.标准曲线绘制：以0.1-1.6mmol/L的FeSO的标准液替代样品绘制标准曲线。

三、结果计算以1.0mmol/L的FeSQ为标准，样品抗氧化活性以达到同样吸光度值为一个FRAP fi,计算结果Z82 Ferric Reducmg/Antioxidant Power (FRAP) assay Briefly, the FRAP reagent contained 2.5 mL 10 mM L1 TPTZ solution in 40 mlVI L1 HGI plus 2,5 mL 20 mM L1 FeCI3 and 25 mL 0.3 M L1acetate buffer, pH 3.6 was prepared freshly and warmed at 37c C. After addition of root ethanol extracts (prepared as in section 2.7) and incub^tion at 37°C for5 absorbanee of the reactionmixture was measured at 593 nm. The final result was expressed as the concentration of antioxidants having a ferric reducing ability equivalent to that of 1 mM L_1 FeSO4 based on the standard curve for FeSO4 x 7H2O at a concentration range between 100 and 1000 uM L_1[31].[1]Be nzie IF F, Strain J J. The Ferric Reduci ng Ability of Plasma (FRAP) as a Measure of “ An tioxida ntPower” ： The FRAP Assay[J]. Analytical Biochemistry, 1996, 239(1):70 -6.[2]Katarz yna Szafra n ska, Rafa? Szewczyk, Krysty na Maria Jan as. In volveme nt of melato nin applied toVigna radiata, L. seeds in pla nt resp onse to chilli ng stress[J]. Cen tral Europea n Jour nal of Biology, 2014,9(11):1117-1126.。

抗氧化物活性测定方法总结抗氧化物活性测定方法是通过对样品中的抗氧化物质含量和抗氧化活性进行定量分析，评估其对自由基的清除能力和抗氧化能力。

随着抗氧化研究的不断深入，测定方法也逐渐完善。

以下是对常见的抗氧化物活性测定方法的总结。

1. ORAC法（氧化应激反应活性测定法）：该方法通过测定样品清除自由基的能力来评估其抗氧化活性。

实验中，将样品与荧光试剂（如2,2'-azobis(2,4-dimethylvaleronitrile)）共同作用，观察其清除自由基的能力，并通过建立标准曲线计算样品的ORAC值。

2.DPPH法（1,1-二苯基-2-苦味基-苦味酸磷）：该方法是一种常用的快速测定抗氧化活性的方法。

实验中，将样品与DPPH稳定自由基共同作用，通过比色反应观察DPPH自由基被样品清除的程度，从而评估抗氧化活性。

3.ABTS法（2,2'-联氮双5-苯砜酸）：该方法通过ABTS离子自由基的生成和清除反应来测定样品的抗氧化活性。

实验中，ABTS与过氧化氢反应生成ABTS离子自由基，通过观察样品对其的清除能力来评估抗氧化活性。

4.FRAP法（亚铁离子还原能力）：该方法基于样品对人造抗坏血酸（Fe3+）的还原能力，通过测量还原后的Fe2+离子的生成量来评估抗氧化活性。

实验中，将样品与Fe3+离子反应生成Fe2+离子，通过比色反应来测定Fe2+的含量。

5. 碘标法（Iodine value）：该方法用于测定油脂、脂肪等样品的抗氧化活性。

实验中，将已知量的碘与样品中的不饱和化合物反应，在光反应下观察反应终点的颜色变化，并根据标准曲线计算样品的抗氧化活性。

6. 硝酸盐法（Nitrite method）：该方法用于测定样品中亚硝酸盐的含量，从而评估其抗氧化活性。

实验中，样品经过还原反应生成亚硝酸盐，然后与DANO（N-乙基-N-（2-苯基乙基）-对硝基苯胺）反应生成稳定的偶氮染料，通过比色测定反应终点的吸光度来计算样品中亚硝酸盐的含量。

抗氧化物活性测定方法总结抗氧化物活性 (antioxidant activity)描述了化学物质在抑制或减少氧化反应中所起的作用。

抗氧化物是一类具有亲电子的分子，它们容易被氧化，从而中和自由基。

抗氧化物具有重要的生物学和医学意义，因为氧化损害是许多疾病和老化的主要原因。

因此，抗氧化物活性测定方法是目前研究的热点之一，现将抗氧化物活性测定方法进行总结:1. DPPH法：该方法是一种常用的体外抗氧化测定方法。

含有DPPH（1,1-二苯基-2-三硝基苯肼）的溶液表现为紫色，DPPH自由基上的氢原子被抗氧化物夺取后，DPPH自由基变成无色，从而可以通过紫外可见光谱测定其吸光度的降低来表示抗氧化物活性。

2. ABTS法：该法通过测定2,2’-联氮双(3-乙基苯并咪唑啉硫酸铵) (ABTS)自由基的消除能力来测定抗氧化活性。

该法也是一种体外抗氧化测定方法，溶液发生颜色变化，从而通过紫外可见光谱测定其吸光度的降低来表示抗氧化物活性。

3. ORAC法：ORAC（氧化还原能力值）法对不同化学物质的体内抗氧化活性进行定量测定，其原理是将抗氧化剂加入与有氧气气氛接触的荧光染料溶液中，由于受到氧自由基的攻击，染料随着时间流逝会逐渐减少。

为了确定不同化学物质的抗氧化活性，十分重要的是应该不断输入氧自由基。

4. FRAP法：铁还原能力 (FRAP) 方法测量样品对Fe3+的还原能力，其原理是将含有Fe3+的试液与抗氧化剂反应后，Fe3+被还原为Fe2+，测试Fe2+的含量即可评估抗氧化剂的抗氧化性能。

5. TBARS法：该方法是用于评估脂质过氧化物含量，从而推断抗氧化剂的能力。

该评估方法是通过测定细胞膜上的脂质过氧化产物（丙二醛）来分析抗氧化剂活性。

6. Total Phenolic Content (TPC)法：该方法最初是用来测定葡萄酒和咖啡中酚类化合物含量的。

后来发现大多数植物成分含有大量的酚类化合物，故也用于测定植物中的酚类含量。

3种抗氧化活性测定方法抗氧化活性测定是评估物质抗氧化能力的重要方法，常用于食品、药物和化妆品等领域。

下面将介绍三种常用的抗氧化活性测定方法。

一、DPPH自由基清除法DPPH(2,2-二苯基-1-苦味肼)是一种常用的抗氧化剂，它能采用紫色的自由基形式存在，并且在反应中会转变为无色的稳定形式。

DPPH自由基清除法是一种简单而直观的测定方法。

该方法的基本原理是将待测物添加到预先溶解的DPPH中，反应一段时间后，根据颜色变化程度来评估抗氧化活性。

通过测量样品溶液吸光度的降低来计算其清除率，清除率越高，抗氧化能力越强。

二、FRAP法FRAP(铁还原能力)法是一种评估抗氧化物质电子给予能力的方法。

抗氧化物质能够通过给予电子来中和自由基的电子，从而保护细胞免受氧化损伤。

FRAP法通过反应产生的铁（II）络合物的吸光度变化来评估样品的抗氧化能力。

具体操作中，将待测物加入到铁（III）试剂（通常为铁(III)氯化物）中，待反应一定时间后，读取吸光度。

样品的抗氧化能力可以通过吸光度的变化来计算。

三、TBARS法TBARS(硫代巴比妥酸反应物)法是一种评估脂质过氧化的方法。

脂质过氧化是一种自由基引起的反应，会导致脂质的氧化和脂质分解产生不稳定化合物。

TBARS法主要用于评估食品和药物等样品中脂质过氧化的程度。

该方法通过将待测样品与反应试剂（如硫代巴比妥酸）反应生成稳定的色素产物，然后测量这种产物的吸光度来评估脂质过氧化的程度。

吸光度越高，脂质过氧化程度越高。

综上所述，DPPH自由基清除法、FRAP法和TBARS法是常用的抗氧化活性测定方法。

每种方法都有其独特的原理和应用范围，选择适合的方法可以准确评估样品的抗氧化能力。

在实际应用中，可以根据实验需求选择合适的方法，或结合多种方法综合评估抗氧化活性。

FRAP法测定抗氧化活性-铁离子还原法- TPTZ实验1 实验原理FRAP, 是Ferric ion reducing antioxidant power的缩写。

大意是指：用铁离子(Fe3+)还原的方法，测定物质的抗氧化活性，本质上属于一种用氧化还原原来评价抗氧化活性的化学方法。

铁离子(Fe3+)还原后，生成亚铁离子(Fe2+)，亚铁离子与2,4,6-三吡啶基三嗪三吡啶三嗪TPTZ (2,4,6-Tris(2-pyridyl)-s-triazine)结合，生成Fe2+-TPTZ络合物。

反应可简单地表示如下：由于Fe2+-TPTZ络合物在593nm处在很高的吸收峰，且显深蓝色，所以，可能通过测量A593 nm值可以反映出Fe2+浓度。

从而反映出亚铁离子(Fe2+)的生成量，进一步地，反映出物质(抗氧化剂A)的还能能力。

还原性，就是供电子能力。

而供电子能力又是抗氧化活性的重要的一个方面。

所以，FRAP测定法就可以间接地反应某物质的抗氧化活性。

间接地，反映出物质(抗氧化剂A)的抗氧化能力。

这个反应需要在低pH的溶液中进行。

FeCl3要过量[1].2 溶液的配制[1]样品液:用适当的溶剂(如乙醇，水)配制浓度分别为0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0 mg/mL各样品溶液(根据其还原活性进行调整)和对照Trolox溶液和BHA溶液。

盐酸溶液(40 mmol/L):取浓盐酸(12 mol/L) 0.1 mL加水至30 mL，置于避光处，备用。

醋酸钠缓冲溶液(0.3 mol/L):称取醋酸钠5.1 g，加冰醋酸20 mL,用水稀释定容至250 mL，至PH为3.6，置于避光处。

TPTZ溶液(10 mmol/L):称取TPTZ样品31.233 mg，用40 mmol/L的盐酸定容至10 mL, 置于冰箱中冷藏备用。

FeCl3.溶液(20 mmol/L)：称取FeCl3.3(H2O) 27.05mg加入5mL蒸馏水，混匀，备用。

总抗氧化能力（FRAP 法）试剂盒说明书微量法100T/96S 注　意：正式测定之前选择2-3 个预期差异大的样本做预测定。

研究意义：测定对象中各种抗氧化物质和抗氧化酶等构成总抗氧化水平。

在生物学、医学和药学研究中常常检测血浆、血清、唾液、尿液等各种体液，细胞或组织等裂解液、植物或中草药抽提液及各种抗氧化物(antioxidant)溶液的总抗氧化能力。

测定原理：在酸性环境下，抗氧化物质还原Fe3+-三吡啶三吖嗪(Fe3+-TPTZ)产生蓝色的Fe2+-TPTZ 的能力反映了总抗氧化能力。

自备实验用品：恒温水浴锅、低温离心机、酶标仪、96 孔板和蒸馏水。

试剂组成和配制：提取液：液体120mL×1 瓶，使用前预冷。

试剂一：液体20 mL×1 瓶，避光保存。

试剂二：液体2 mL×1 瓶，4℃避光保存。

试剂三：液体2 mL×1 瓶，避光保存。

混合液(现配现用)：将试剂一、试剂二、试剂三按10:1:1 的比例混合，使用前37℃预温。

样品的制备：(1) 血清、血浆、唾液或尿液等液体样品血浆（制备时可以使用肝素或柠檬酸钠抗凝，不宜使用EDTA 抗凝）4℃，5000rpm 离心10min，取上清待测。

血清、唾液或尿液样品直接用于测定，也可以-80℃冻存（不宜超过30 d）后再测定。

(2) 组织样品按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10 的比例（建议称取约0.1g 组织，加入1mL 提取液）进行冰浴匀浆，然后10000g，4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

(3) 细胞样品按照细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1 的比例（建议500 万细胞加入1mL 提取液），冰浴超声波破碎（功率200W，超声3s，间隔10s，重复30 次）；10000g，4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

操作步骤：1、酶标仪预热30min，调节波长至593nm。

抗氧化物活性测定方法总结抗氧化物活性测定方法（倾向于考虑DPPH法和ORAC法）1.FRAP法:铁离子还原抗氧化能力测定法[1]FRAP(ferric ion reducing antioxidant power)方法，在低pH值的溶液中，Fe3+-TPTz(Fe3+-三吡啶三嗪)被抗氧化剂还原成有色的Fe2+-TPTZ。

反应的结果常以Fe2+当量或标准物质的抗氧化能力表示。

该法快速简便、易于操作、重复性好，但FRAP反应属于电子转移(SET)反应，因此FRAP方法不能够测定氢转移反应(HAT)起作用的物质。

而且该法实际测定的是待测生物活性物质将Fe3+还原为Fe2+的能力，因此没有抗氧化能力的生物学相关性。

2.TEAC法(trolox equivalent antioxidant capacity)ABTS(2,2'-amino-di(2-ethyl-benzothiazoline sulphonic acid-6)ammonium salt,2,2'氨基-二(3-乙基-苯并噻唑啉磺酸-6)铵盐)与过氧化物酶和氢过氧化物在一起形成ABTS+阳离子自由基。

在抗氧化剂存在时，这种自由基混合物的光吸收值下降，下降程度取决于抗氧化剂的抗氧化能力，测得的结果以TEAC表示，即被测抗氧化剂清除ABTS·+的能力(吸光度大小的变化)与标准抗氧化剂trolox(VE的水溶性类似物)清除ABTS·+的能力的比值。

TEAC法十分简单，适用于大量样品的分析检测。

但是，ABTS·+并非生理自由基，缺乏生理相关性，而且与FRAP方法相似，ABTS·+与不同抗氧化剂问的氧化反应时间不同，因此，只能定性不能定量评价样品的抗氧化能力。

3.DPPH法[2，3](2，2-diphenyt-l-picrylhydrazyl radical scavenging capacity)DPPH·(二苯代苦味肼基自由基)法是较常用的方法之一。

总抗氧化能力（T-AOC ）检测试剂盒说明书可见分光光度法货号：BC1310规格：50T/48S产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。

试剂名称规格保存条件提取液液体50mL×1瓶2-8℃保存试剂一液体35mL×1瓶2-8℃保存试剂二液体20mL×1瓶2-8℃保存试剂三液体5mL×1瓶2-8℃保存标准品粉剂×1支2-8℃保存溶液的配制：1、提取液：使用前置于4℃冰箱或冰上预冷；2、标准品：10mg FeSO 4·7H 2O 。

临用前加入0.9mL 蒸馏水，20μL 浓硫酸，配制成40µmol/mL FeSO 4标准溶液备用；3、混合液：将试剂一、试剂二、试剂三按7:1:1的比例混合，现配现用，用多少配多少。

使用前置于37℃水浴锅或37℃恒温培养箱中预热10min 。

产品说明：测定对象中各种抗氧化物质和抗氧化酶等构成总抗氧化水平。

在生物学、医学和药学研究中常常检测血浆、血清、唾液、尿液等各种体液，细胞或组织等裂解液、植物或中草药抽提液及各种抗氧化物(antioxidant)溶液的总抗氧化能力。

在酸性环境下，还原Fe 3+-三吡啶三吖嗪（Fe 3+-TPTZ）产生蓝色的Fe 2+-TPTZ 的能力反映了总抗氧化能力。

Fe 3+-Tripyridyltriazine Fe 2+-Tripyridyltriazine (593nm)技术指标：最低检出限：0.00056μmol/mL 线性范围：0.00078125-0.05μmol/mL注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。

如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：可见分光光度计、1mL 玻璃比色皿、恒温水浴锅、低温离心机、细胞超声破碎仪、研钵/匀浆器、浓硫酸、冰和蒸馏水。

Antioxidant H +Beijing Solarbio Science &Technology Co.,LtdTel:400-968-6088Fax:************操作步骤：一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）1、血清、血浆、唾液或尿液样本血浆（制备时可以使用肝素或柠檬酸钠抗凝，不宜使用EDTA抗凝）5000r/min离心10min，取上清待测。

总抗氧化能力测定(F R A P法)小麦叶片总抗氧化能力测定（FRAP法）一、实验原理FRAP法测定总抗氧化能力的原理是酸性条件下抗氧化物可以还原Ferric-tri-pyridyl-tria-zine(Fe3+-TPTZ)产生蓝色的Fe2+-TPTZ，随后在593nm测定蓝色的Fe2+-TPTZ即可获得样品中的总抗氧化能力。

由于反应在酸性条件下进行，可以抑制内源性的一些干扰因素。

并且由于血浆等样品中的铁离子或亚铁离子的总浓度通常低于10μM，因此血浆等样品中的铁离子或亚铁离子不会显著干扰FRAP法的检测反应。

由于反应体系中的铁离子或亚铁离子是和TPTZ螯合的，样品本身含有的少量金属离子螯合剂通常也不会显著影响检测反应。

AntioxidantFe3+-TPTZ（橘黄色）——————> Fe2+-TPTZ (蓝色)二、实验步骤1.FRAP工作液配制：0.3 M pH 3.6 醋酸缓冲液：0.364g无水醋酸钠+3.2mL冰乙酸定容至200mL，用1M HCl调节pH至3.6；10mmol/L TPTZ溶液25mL：0.078g TPTZ用40mM 盐酸溶液定容至25mL；20mmol/L FeCl溶液50mL：2.78g用RO水定容至50mL；3上述溶液以10:1:1的比例混合（现配现用）。

2.取叶片0.1g，加入2.5mL蒸馏水研磨稍沉淀后取1.5mL 12000g离心10min（4o C），取上清液。

3.在反应管中加入100uL上清液，再加入 2.4mL工作液，37 o C条件下水浴10min，于593nm处测定吸光度，的标准液替代样品绘制标准曲4.标准曲线绘制：以0.1-1.6mmol/L的FeSO4线。

三、结果计算以1.0mmol/L的FeSO4为标准，样品抗氧化活性以达到同样吸光度值为一个FRAP值，计算结果。

[1]Benzie I F F, Strain J J. The Ferric Reducing Ability of Plasma (FRAP) as a Measure of “Antioxidant Power”: The FRAP Assay[J]. Analytical Biochemistry, 1996, 239(1):70-6.[2]Katarzyna Szafrańska, Rafał Szewczyk, Krystyna Maria Janas. Involvem ent of melatonin applied to Vigna radiata, L. seeds in plant response to chilling stress[J]. Central European Journal of Biology, 2014, 9(11):1117-1126.。

抗氧化物活性测定方法（倾向于考虑DPPH法和ORAC法）1.FRAP法:铁离子还原抗氧化能力测定法[1]FRAP(ferric ion reducing antioxidant power)方法，在低pH值的溶液中，Fe3+-TPTz(Fe3+-三吡啶三嗪)被抗氧化剂还原成有色的Fe2+-TPTZ。

反应的结果常以Fe2+当量或标准物质的抗氧化能力表示。

该法快速简便、易于操作、重复性好，但FRAP反应属于电子转移(SET)反应，因此FRAP方法不能够测定氢转移反应(HAT)起作用的物质。

而且该法实际测定的是待测生物活性物质将Fe3+还原为Fe2+的能力，因此没有抗氧化能力的生物学相关性。

2.TEAC法(trolox equivalent antioxidant capacity)ABTS(2,2'-amino-di(2-ethyl-benzothiazoline sulphonic acid-6)ammonium salt,2,2'氨基-二(3-乙基-苯并噻唑啉磺酸-6)铵盐)与过氧化物酶和氢过氧化物在一起形成ABTS+阳离子自由基。

在抗氧化剂存在时，这种自由基混合物的光吸收值下降，下降程度取决于抗氧化剂的抗氧化能力，测得的结果以TEAC表示，即被测抗氧化剂清除ABTS·+的能力(吸光度大小的变化)与标准抗氧化剂trolox(VE的水溶性类似物)清除ABTS·+的能力的比值。

TEAC法十分简单，适用于大量样品的分析检测。

但是，ABTS·+并非生理自由基，缺乏生理相关性，而且与FRAP方法相似，ABTS·+与不同抗氧化剂问的氧化反应时间不同，因此，只能定性不能定量评价样品的抗氧化能力。

3.DPPH法[2，3](2，2-diphenyt-l-picrylhydrazyl radical scavenging capacity)DPPH·(二苯代苦味肼基自由基)法是较常用的方法之一。

精品文档小麦叶片总抗氧化能力测定（FRAP法）一、实验原理FRAP法测定总抗氧化能力的原理是酸性条件下抗氧化物可以还原Ferric-tri-pyridyl-tria-zine（Fe 3+-TPTZ）产生蓝色的 Fe2+-TPTZ,随后在 593nm测定蓝色的Fe2+-TPTZ即可获得样品中的总抗氧化能力。

由于反应在酸性条件下进行，可以抑制内源性的一些干扰因素。

并且由于血浆等样品中的铁离子或亚铁离子的总浓度通常低于10側，因此血浆等样品中的铁离子或亚铁离子不会显著干扰FRAP法的检测反应。

由于反应体系中的铁离子或亚铁离子是和TPTZ螯合的，样品本身含有的少量金属离子螯合剂通常也不会显著影响检测反应。

AntioxidantFe3+-TPTZ （橘黄色）---------- >Fe2+-TPTZ （蓝色）二、实验步骤1. FRAPT作液配制：0.3 M pH 3.6醋酸缓冲液：0.364g无水醋酸钠+3.2mL冰乙酸定容至200mL 用1M HCl调节pH至3.6 ;10mmol/L TPTZ溶液25mL 0.078g TPTZ 用40mM盐酸溶液定容至25mL 20mmol/L FeCl3溶液 50mL 2.78g 用 RO水定容至 50mL上述溶液以 10:1:1 的比例混合（现配现用）。

2. 取叶片0.1g，加入2.5mL蒸馏水研磨稍沉淀后取 1.5mL 12000g离心10min（4°C）,取上清液。

3. 在反应管中加入100uL上清液，再加入2.4mL工作液，37°C条件下水浴10min, 于593nm处测定吸光度，4. 标准曲线绘制：以0.1-1.6mmol/L的FeSQ的标准液替代样品绘制标准曲线。

三、结果计算以1.0mmol/L的FeSQ为标准，样品抗氧化活性以达到同样吸光度值为一个FRAP fi，计算结果。

精品文档2.8.2. Ferric Reducing/Antioxidant Power (FRAP) assayBriefly, the FRAP reagent contained 2.5 mL 10 mM L_1TPTZ solution in 40 mM L1HCI plus 2.5 mL 20 mM L1 FeCI^ and 25 mL 0+3 M L1acetate buffer, pH 3*6 was prepared freshly and warmed at 37°C・After addition of root ethanol extracts (prepared as in section 2.7) and incubation at 37°Cfor 5 min, absorbance of the reaction mixture was measured at 593 nm. The final result was expressed as the concentration of antioxidants having a ferric reducing ability equivalent to that of 1 mM L_1 FeSO4based on the standard curve for FeSO4 x 7H.0 at a concentration range between 100 and 1000 pM L_1 [3 口[1] Benzie I F F, Strain J J. The Ferric Reducing Ability of Plasma (FRAP) as aMeasure of “ntioxidant Power”： The FRAP Assay[J]. Analytical Biochemistry, 1996, 239(1):70-6.[2] Katarz yna Szafra nska, Rafa? Szewczyk, Kryst yna Maria Jan as. In volveme nt ofmelat onin applied to Vig na radiata, L. seeds in pla nt resp onse to chilli ng stress[J].Central European Journal of Biology, 2014, 9(11):1117-1126.精品文档欢迎您的下载，资料仅供参考!致力为企业和个人提供合同协议，策划案计划书，学习资料等打造全网一站式需求。

分光光度计测：40mmol/L盐酸溶液：取浓盐酸(12mol/L)0.1ml加水至30ml，置于避光处，备用。

，用蒸馏水定容至50ml，置于避光处，备三氯化铁溶液：称取0.1625g的FeCl3用。

0.3mol/L醋酸钠缓冲溶液：称取醋酸钠5.1g，加冰醋酸20ml，用水稀释定容至250ml，置于避光处，备用。

10mmol/L TPTZ溶液：称取TPTZ样品31．233mg，用40mmol/L的盐酸定容至10ml，置于冰箱中冷藏备用。

(2)番茄乙醇提取物总抗氧化能力的测定FRAP法Fe3+吡啶三吖嗪可被样品中还原物质还原为二价铁形式，呈现出蓝色，并于593nm处具有最大光吸收，根据吸光度大小计算样品抗氧化活性的强弱。

取0.3ml样品，加2.7ml预热至37o C的FRAP工作液，摇匀后放置10min，于593nm 测其吸光度值(A值)。

样品分别作10倍、20倍、40倍稀释，做三个稀释度(用无水乙醇作为参比)，以无水乙醇代替样品加入FRAP工作液作为空白，每个稀释度做3次平行试验，求平均值。

根据反应后A值，在标准曲线上求得相应FeSO4的浓度(μmol/L)，定义为FRAP值。

FRAP值越大，抗氧化活性越强。

标准曲线的绘制：准确称取6．08mg硫酸亚铁溶于适量的水中，加入FeSO418mol/L的硫酸0.25ml，再加水稀释至50ml定容，并置入小铁钉。

取上述溶液标准溶液。

预先用小试5ml于5ml的水，定容至50ml，即为800μmol/L FeSO4(800μmol/L)标准溶液加入试管中，配制得400μmol/L 管装5ml水，取5mlFeSO4标准溶液，按此方法依次进行，配制200μmol/L、100μmol/L。

50μmol/L、25μmol/L标准溶液，绘制标准曲线(图1)，得回归方程为：Y=0．0023X+0．191，R2=0．9996。

[4]Benzie IFF，Strain J．The ferric reducing ability of plasma(FRAP)asa measure of“antioxidant power”：the FRAP assay．Analytical Biochemistry，1996，239(3)：70-76．参照Benzie etal.(1996)的方法，原理为Fe3+-三吡啶三吖嗪(TPTZ，sigma)可被样品中还原物质还原为二价铁形式，呈现出蓝色，并于593nm处具有最大光吸收，根据吸光度大小计算样品抗氧化活性的强弱。

抗氧化测定方法流程一DPPH自由基清除能力仪器及药品：酶标仪、紫外-可见分光光度计、甲醇、DPPH等DPPH 即1，1-二苯基-2-苦肼基自由基，是一种稳定的自由基，其甲醇溶液呈紫色，并在517 nm处有强吸收。

参考Braca et al. (2001)的方法进行测量。

取0.1 ml样品，加入3 ml 0.004％DPPH 甲醇溶液（质量分数）。

（0.02g溶于500ml甲醇溶液。

）混合均匀后，静置30 min后在517 nm处测定吸光值。

抑制率采用公式[(A0－A1)/A0] · 100计算，其中A0（加0.1ml甲醇和3mlDPPH甲醇溶液）为加入样品前的吸光值，A1 为加入样品后的吸光值。

（空白样采用甲醇。

用甲醇溶液调零。

）配置各个级分不同浓度的甲醇溶液，浓度范围可以先做预实验，大致在1mg-1000mg/l 之间：测定吸光值计算DPPH自由基清除率，绘制吸收曲线，找出其IC50二FRAP法测定抗氧化能力药品：醋酸纳、醋酸、三吡啶基均三嗪（2,4,6-Tripyridyl-s-triazine，TPTZ）、盐酸、FeCl3·6H2O、维生素C（L-Ascorbic Acid）（1）300mmol/L的醋酸盐缓冲液（pH=3.6）：3.1g C2H3NaO2·3H2O ＋16mL C2H4O2 溶于1L容量瓶中定容。

（或着是1.869g醋酸钠）（2）10mmol/L三吡啶基均三嗪（2,4,6-Tripyridyl-s-triazine，TPTZ，分子量312.33）溶于40mmol/L HCl中：称取0.312g三吡啶基均三嗪溶于50ml小烧杯中，加入0.34ml浓HCl（约11.7mol/l）搅拌均匀，然后定容到100ml容量瓶中。

（3）20mmol/L FeCl3·6H2O溶液，称取2.703gFeCl3·6H2O溶解于200ml蒸馏水中，然后定容到500ml容量瓶中FRAP试剂：25mL 醋酸盐缓冲液＋2.5mL TPTZ溶液＋2.5mL FeCl3·6H2O溶液（10:1:1）标准样：0.1-1mmol/L的维生素C（L-Ascorbic Acid）溶液FRAP分析步骤：取0.1 ml 样品放入10ml试管中，加入新鲜的FRAP试剂3.0 ml，然后置于25℃恒温水浴中，5 min后用紫外分光光度计在波长为593 nm处测吸光值，（空白样采用去离子水。

抗氧化性测定方法
抗氧化性测定方法是一种用于测试物质对氧气自由基、过氧化物和其他氧化性物质的抵抗能力的方法。

以下是常见的抗氧化性测定方法：
1. DPPH自由基清除法：使用一种紫色自由基DPPH，通过测定反应前后DPPH 吸收峰的差异来评估样品的自由基清除能力。

2. ABTS自由基清除法：使用一种蓝色自由基ABTS，通过ABTS的光谱变化来衡量样品对自由基的清除能力。

3. ORAC法：利用ORAC反应器测量被测样品对氧化过程中产生的自由基的清除能力。

4. FRAP法：利用FRAP反应器测量被测样品对铁离子的还原能力。

5. TAC法：通过测量总抗氧化能力评价样品的抗氧化能力。

6. 超氧化物歧化酶(SOD)活力测定法：利用SOD对超氧化物的清除作用来评估物质的抗氧化能力。

以上方法中，DPPH和ABTS自由基清除法是较常用的评估抗氧化性的方法。

抗氧化性是很多食品和保健品评估其品质和功效的重要指标，因此，准确测定物质
的抗氧化性对于推广新产品、提高产品质量和开发功能性食品有着重要意义。

抗氧化性测定方法1.1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）法这是一种广泛应用的测定方法。

DPPH是一种深紫色的自由基，在接触到具有抗氧化能力的物质后会发生漂白反应。

在测定中，样品与DPPH 一起加入观察和记录，在吸收强度的变化可以反映出物质的抗氧化能力。

2.金属还原力抗氧化活性法（FRAP法）FRAP法基于物质的还原能力，测定物质对铁（Fe3+）的还原能力。

在该方法中，加入已知浓度的Fe3+溶液，并随着物质还原能力的增强，Fe3+逐渐被还原成可溶性Fe2+。

通过检测Fe2+的浓度变化，可以评估样品的抗氧化能力。

3.缩合亚硝酸盐法（NBT法）NBT法利用物质对亚硝酸盐的还原能力来测定其抗氧化能力。

NBT是一种黄色水溶性化合物，在接触到自由基后会转变为蓝色NBT还原物。

通过测定蓝色NBT还原物的吸光度，可以评估样品的抗氧化能力。

4.过氧化物过氧化物是一类非常有活性且具有氧化性的分子，在测定中被用作产生自由基的刺激源。

通过观察或测定样品与过氧化物产生的氧化反应，可以评估样品的抗氧化能力。

5.水溶性抗氧化能力（ORAC）法ORAC法是一种相对来说较复杂但更接近生物体内抗氧化能力的测定方法。

通过测定物质与自由基的竞争反应，以及维持反应平衡的时间，可以评估样品的抗氧化能力。

6.单线态氧发射（SOS）法SOS法是一种测定样品对单线态氧（1O2）的能力的方法。

在该方法中，通过检测样品对单线态氧的发射能力，评估其对自由基氧化损伤的能力。

在实际应用中，可以根据需要选择适当的抗氧化性测定方法，或者使用多种方法综合评估样品的抗氧化能力。

除了上述几种方法，还有其他一些方法如总抗氧化能力（TAC）法和细胞抗氧化测试（CAT）等方法也可以用于抗氧化性测定。

小麦叶片总抗氧化能力测定（FRAP法）一、实验原理FRAP法测定总抗氧化能力的原理是酸性条件下抗氧化物可以还原Ferric-tri-pyridyl-tria-zine(Fe3+-TPTZ)产生蓝色的Fe2+-TPTZ，随后在593nm测定蓝色的Fe2+-TPTZ即可获得样品中的总抗氧化能力。

由于反应在酸性条件下进行，可以抑制内源性的一些干扰因素。

并且由于血浆等样品中的铁离子或亚铁离子的总浓度通常低于10μM，因此血浆等样品中的铁离子或亚铁离子不会显著干扰FRAP法的检测反应。

由于反应体系中的铁离子或亚铁离子是和TPTZ螯合的，样品本身含有的少量金属离子螯合剂通常也不会显著影响检测反应。

AntioxidantFe3+-TPTZ（橘黄色）——————> Fe2+-TPTZ (蓝色)二、实验步骤1.FRAP工作液配制：0.3 M pH 3.6 醋酸缓冲液：0.364g无水醋酸钠+3.2mL冰乙酸定容至200mL，用1M HCl调节pH至3.6；10mmol/L TPTZ溶液25mL：0.078g TPTZ用40mM 盐酸溶液定容至25mL；20mmol/L FeCl溶液50mL：2.78g用RO水定容至50mL；3上述溶液以10:1:1的比例混合（现配现用）。

2.取叶片0.1g，加入2.5mL蒸馏水研磨稍沉淀后取1.5mL 12000g离心10min（4o C），取上清液。

3.在反应管中加入100uL上清液，再加入2.4mL工作液，37o C条件下水浴10min，于593nm处测定吸光度，4.标准曲线绘制：以0.1-1.6mmol/L的FeSO的标准液替代样品绘制标准曲线。

4三、结果计算以1.0mmol/L的FeSO为标准，样品抗氧化活性以达到同样吸光度值为一个4FRAP值，计算结果。

[1]Benzie I F F, Strain J J. The Ferric Reducing Ability of Plasma (FRAP) as a Measure of “Antioxidant Power”: The FRAP Assay[J]. Analytical Biochemistry, 1996, 239(1):70-6.[2]Katarzyna Szafrańska, Rafał Szewczyk, Krystyna Maria Janas. Involvement of melatonin applied to Vigna radiata, L. seeds in plant response to chilling stress[J]. Central European Journal of Biology, 2014, 9(11):1117-1126.。