《微生物学实验技术》实验教学大纲一、课程的性质与任务微生物学实验是配合微生物教学开设的一门培养学生动手能力和综合素质的实验课程，通过实验使学生加深对所学知识的理解和掌握，使学生掌握微生物实验技术的基本操作和技能，同时使学生初步了解和掌握先进的技术和方法，与迅速发展的学科前沿接轨。
二、实验目的与基本要求1. 掌握观察、培养微生物的基本操作和技能。
包括：显微镜的使用、无菌操作、培养基的配制和灭菌。
2. 掌握常用微生物的染色方法，进一步掌握植物病源微生物的鉴定和分类。
3. 通过实验加深对植物病源细菌、真菌的形态、大小及二者之间的差别。
4. 根据所学知识和技能，能够自行设计微生物实验。
5. 利用微生物的生理生化反应鉴别植物病源微生物。
三、实验考核方式及办法实验成绩评定方法：实验课成绩单独按五级分记录考试成绩。
凡实验成绩不及格者，该门课程必须重修。
学生的实验成绩应以平时考查为主，一般应占总分的70%，其平时成绩又要以实验实际操作的优劣作为主要考核依据。
在学期末或课程结束时，为复习和巩固实验教学内容，进一步对学生作补充了解，也可举行一定的实验操作考试，但无论采取何种方式进行考核，都必须按实验课的目的要求，以实际实验工作能力的强弱作为评定成绩的主要依据。
因此，最终的集中考试结果只能占总成绩的30%。
评定各级成绩时，可参考以下标准：（一）优秀（很好）能正确理解实验的目的要求，能独立、顺利而正确地完成各项微生物实验操作，会分析和处理实验中遇到的问题，能掌握所学的各项实验技能，能较好地完成实验报告及其它各项实验作业，有一定创造精神和能力。
有良好的实验室工作作风和习惯。
（二）良好（较好）能理解实验的目的和要求，能认真而正确地完成各项实验操作，能分析和处理实验中遇到的一些问题。
能掌握所学实验技能的绝大部分，对难点较大的操作完成有困难。
能一般完成实验报告和其它实验作业。
有较好的实验习惯和工作作风。
（三）中等（一般）能粗浅理解实验目的要求，能认真努力进行各项实验操作，但技巧较差。
能分析和处理实验中一些较容易的问题，掌握实验技能的大部分。
有30%掌握得不好。
能一般完成各项实验作业和报告。
处理问题缺乏条理。
工作作风较好。
能认真遵守各项规章制度。
学习努力。
（四）及格（较差）只能机械地了解实验内容，能一般按图、或按实验步骤“照方抓药”完成实验操作，能完成60%所学的实验技能，有些虽作但不准确。
遇到问题常常缺乏解决的办法，在别人启发下能作些简单处理，但效果不理想。
能一般完成实验报告，能认真遵守实验室各项规章制度，工作中有小的习惯性毛病（如工作无计划，处理问题缺乏条理）。
（五）不及格（很差）盲目地“照方抓药”，只掌握50%的所学实验技能。
有些实验虽能作，但一般效果不好，操作不正确。
工作忙乱无条理。
一般能遵守实验室规章制度，但常有小的错误。
实验报告较多的时候有结果，遇到问题时说不明原因，在教师指导下也较难完成各项实验作业。
或有些小聪明但不努力，不求上进。
四、实验报告要求实验完毕，应用专门的实验报告纸，根据预习和实验中的现象及数据记录等，及时而认真地写出实验报告。
微生物学实验报告一般包括以下内容：实验（编号）实验名称（一）实验目的（二）实验原理（三）主要试剂和仪器列出实验中所要使用的主要试剂和仪器。
（四）实验步骤应简明扼要地写出实验步骤流程。
（五）实验数据及其处理应用文字、表格、图形、将数据表示出来。
根据实验要求及计算公式计算出分析结果并进行有关数据和误差处理，尽可能地使记录表格化。
（六）问题讨论包括实验教材上的思考题和对实验中的现象、产生的误差等进行讨论和分析，尽可能地结合分析化学中有关理论，以提高自己的分析问题、解决问题的能力，也为以后的科学研究打下一定的基础。
五、实验项目一览表微生物学实验项目一览表序实验项目实验实验适用学号名称类型要求专业时1 细菌的单染色法和革兰氏染色法验证性必做生物类 42 细菌的芽孢染色和鞭毛染色验证性必做生物类 43 植物病源微生物的形态观察综合性必做生物类 44 植物病原细菌及其所致病害症状观察综合性必做生物类 45 植物病原菌物一般形态和接合菌门真菌基本形态及所致病害观察综合性必做生物类 46 担子菌门真菌的基本形态及所致病害的观察综合性必做生物类 47 有丝分裂孢子真菌的基本形态及所致病害的观察综合性必做生物类 48 病原物的分离培养与接种综合性必做生物类 49 植物的抗病性和病原菌的生理分化设计性必做生物类 4六、实验项目的具体内容：实验一细菌的单染色法和革兰氏染色法1、目的、1）掌握显微镜油镜正确使用方法；2）学习微生物涂片、染色的基本技术，掌握细菌的单染色法和革兰氏染色法；3) 单染色法注意固定时不能烤，水洗水流不宜大急；4) 革兰氏染色的关键在于严格掌握酒精脱色的程度；涂片要薄，否则影响脱色；菌龄也影响染色结果，掌握好染色的时机。
2、内容、材料和方法细菌的涂片和染色是微生物学实验中的一项基本技术。
细菌的细胞小而透明，在普通光学显微镜下不易识别，必须对它们进行染色，使经染色后的菌体与背景形成明显的色差，从而能更清楚地观察到其形态和结构。
所谓简单染色法是利用单一染料对细菌进行染色的一种方法。
此法操作简便，可用以观察微生物的形状、大小及细胞排列状态，是微生物技术中应用广泛，操作简便的染色法。
用于生物染色的染料主要有碱性染料、酸性染料和中性染料三大类。
碱性染料的离子带正电荷，能和带负电荷的物质结合。
因细菌蛋白质等电点较低，当它生长于中性、碱性或弱酸性的溶液中时常带负电荷，所以通常采用碱性染料使其着色。
例如，美蓝(亚甲蓝)实际上是氯化亚甲蓝盐(methylene blue chloride，缩写为M B C)；它可被电离成正、负离子：M B C→methylene blue++chloride-带正电荷的染料离子可使细菌细胞染成蓝色。
常用的碱性染料除美蓝外，还有结晶紫(crystal violet)、碱性复红(basic fuchsin)、番红(又称沙黄，safranine)等。
酸性染料的离子带负电荷，能与带正电荷的物质结合。
当细菌分解糖类产酸使培养基pH下降时，细菌所带正电荷增加，因此易被伊红、酸性复红或刚果红等酸性染料着色。
中性染料是前两者的结合物又称复合染料，如伊红美蓝、伊红天青等。
染色前必须先固定细菌，其目的有二：一是杀死细菌，使细胞质凝固，菌体粘附于玻片上；二是增加其对染料的亲和力。
常用的有加热和化学固定两种方法。
固定时应尽量维持细胞原有形态，防止细胞膨胀或收缩。
革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家C．Gram所创立的。
革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌(G+)和革兰氏阴性菌(G-)两大类，是细菌学上最常用的鉴别性染色法。
革兰氏染色法的主要步骤是先用结晶紫进行初染；再加媒染剂--碘液，以增加染料与细胞间的亲和力，使结晶紫和碘在细胞膜上形成分子量较大的复合物；然后用脱色剂(乙醇或丙酮)脱色；最后用蕃红复染。
凡细菌不被脱色而保留初染剂的颜色(紫色)者为革兰氏阳性菌，如被脱色后又染上复染剂的颜色(红色)者为革兰氏阴性菌。
该染色法所以能将细菌分为G+菌和G-菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。
G-菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经蕃红复染后就成红色。
G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时的颜色。
菌种大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草杆菌(Bacillus subtilis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)或蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)；实验步骤（一）细菌的简单染色1、涂片在洁净无油腻的玻片中央放一小滴蒸馏水，用灼烧灭菌冷却后的接种环挑取少量菌体与水滴充分混匀，涂成极薄的菌膜。
2、干燥将涂片于空气中自然晾干，或将涂片置于火焰高处微热烘干，但不能直接在火焰上烘烤，以免菌体变形。
3、固定手执玻片一端，有菌膜的一面朝上，通过迅速通过火焰2-3次(用手指触涂片反面，以不烫手为宜)。
待玻片冷却后，再加染料；4、染色玻片置于玻片搁架上，加适量(以盖满菌膜为度)结晶紫染色液(或石炭酸复红液)于菌膜部位，染0.5-1min。
5、水洗倾去染色液，用洗瓶中的自来水自玻片一端轻轻冲洗，至流下的水中无染色液的颜色时为止。
6、干燥自然干燥或用吸水纸盖在涂片部位以吸去水分(注意勿擦去菌体)。
7、镜检用油镜观察并绘出细菌形态图。
8、清理实验完毕，擦净显微镜。
有菌的玻片置消毒缸中，清洗、晾干后备用。
（二）细菌的革兰氏染色1、涂片在一张载玻片上加两滴蒸馏水后，分别涂布枯草芽孢杆菌和大肠杆菌(注意涂片切不可过于浓厚)。
2、固定将制成的涂片干燥固定，固定时通过火焰1-2次即可，不可过热，以载玻片不烫手为宜。
3、染色⑴初染将玻片置于玻片搁架上，加草酸铵结晶紫染色液(加量以盖满菌膜为度)，染色1-2min。
倾去染色液，用自来水小心地冲洗。
⑵媒染滴加(Lugol)碘液，染1-2min，水洗。
⑶脱色滴加95%乙醇，脱色20-25s立即水洗，以终止脱色。
⑷复染滴加蕃红，染色2-3min，水洗。
最后用吸水纸轻轻吸干。
4、镜检干燥后，置油镜观察。
被染成紫色者即为革兰氏阳性菌(G )；被染成红色者是革兰氏阴性菌(G-)。
实验二细菌的芽孢染色和鞭毛染色1、目的、（1）学习并掌握芽孢染色法。
（2）学习并掌握细菌鞭毛染色的基本方法及观察细菌鞭毛的着生情况。
（3）学习用压滴法和悬滴法观察细菌的运动性。
2、内容、材料和方法细菌的特殊结构有芽孢、荚膜和鞭毛等，对于它们的显微镜检查必须用特殊染色方法，才能获得良好的效果。
细菌的芽孢具有厚而致密的壁不易着色，若用一般染色法只能使菌体着色而芽孢不着色(芽孢呈无色透明状)。
芽孢染色法就是根据芽孢既难以染色而一旦染上后又难以脱色这一特点而设计的。
所有的芽孢染色法都基于同一个原则：除了用着色力强的染料外，还需要加热，以促进芽孢着色，再使菌体脱色，而芽孢上的染料则难以渗出，故仍保留原有的颜色，然后用对比度强的染料对菌体复染，使菌体和芽孢呈现出不同的颜色，因而能更明显地衬托出芽孢，便于观察细菌的鞭毛极细，直径一般为10-20nm，只有用电子显微镜才能观察到。
但是，如采用特殊的染色法，则在普通光学显微镜下也能看到它。
鞭毛染色方法很多，但其基本原理雷同，即在染色前先用媒染剂处理，让它沉积在鞭毛上，使鞭毛直径加粗，然后再进行染色。
常用的媒染剂由丹宁酸和氯化高铁或钾明矾等配制而成菌种枯草芽孢杆菌（ Bacillus subtilis )，蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)，苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)，大肠杆菌(Escherichia coli)，金黄色葡萄球菌（ Staphylococcus aureus）；实验步骤（一）细菌芽孢染色（1）取菌种分别制片，固定。
