流加发酵与高密度培养
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【课堂笔记】《发酵⼯程》《发酵⼯程笔记》笔者:赵可⽬录第⼀章绪论(p1) (1)1.1概念 (1)1.2发酵⼯程的研究内容 (1)1.3发酵过程的特点 (2)1.4发酵过程的问题 (2)1.5发酵⼯程的发展简史 (2)1.6发酵⼯程⼯程的任务 (2)1.7发展⽅向 (3)第⼆章⽣物发酵的基本过程(p36) (3)2.1发酵的基本过程 (3)2.2发酵过程的⼀般过程和操作⽅式 (3)2.3微⽣物的发酵类型 (4)2.3.1液体发酵 (4)2.3.2固体发酵 (4)2.3.3好氧发酵 (5)2.3.4厌氧发酵 (5)第三章种⼦扩⼤配培养(p44) (5)3.1概念 (5)3.2种⼦扩⼤培养⼯艺 (6)3.2.1制备流程 (6)3.2.2优良种⼦具备的条件 (6)3.2.3影响种⼦的质量因素 (6)3.2.4种⼦质量控制措施 (6)第四章发酵培养基(p48) (6)4.1⼀般特点 (6)4.2发酵培养基的组成与制备 (6)4.2.1发酵培养基的组成 (6)4.2.2发酵培养基的制备要点 (7)4.3发酵培养基的设计和优化 (8)4.3.1设计发酵培养基要考虑的因素: (8)4.3.2摇瓶实验: (8)4.3.3正交实验:多因素多⽔平 (8)第五章发酵过程产物分析(p53) (8)5.1分析项⽬按性质分可分三类: (8)5.2发酵终点的判断 (8)第六章发酵动⼒学(p59) (8)6.1发酵动⼒学概念 (8)6.2研究发酵动⼒学的⽬的 (9)6.3动⼒学 (9)6.3.1课程重点 (9)6.4⽣物反应类型 (9)6.5发酵的⽬的 (9)6.6发酵研究的关键问题 (9)6.7优化发酵过程达到⾼产⽬标的⽅法 (10)6.8发酵动⼒学研究的基本过程 (10)6.9分批发酵动⼒学 (10)6.9.1菌龄 (10)6.9.2分类 (10)6.9.3细胞⽣长动⼒学 (10)6.9.4分批发酵基质消耗动⼒学 (11)6.9.5分批发酵产物形成动⼒学 (11)6.9.6分批发酵的优缺点 (12)6.9.7重要截图(来⾃中国MOOC余龙江教授) (12)6.10讨论与问题 (13)第七章分批发酵、补料分批发酵和⾼密度发酵(p81) (14)7.1分批发酵 (14)7.1.1分批发酵的操作⼯艺 (15)7.1.2菌体⽣长规律 (15)7.1.3代谢变化 (15)7.2补料分批发酵 (16)7.2.1适⽤范围: (16)7.2.2物料流加⽅式 (16)7.2.3补料分批动⼒学 (16)7.3⾼密度发酵 (16)7.3.1影响⾼密度发酵⽣产的因素 (16)7.3.2⾼密度发酵存在的问题 (17)7.4讨论与问题 (17)7.4.1分批发酵和补料分批发酵有哪些联系和区别? (17)7.4.2分批发酵的流程 (17)7.4.3分批发酵包括哪些时期 (17)7.5课堂问题 (17)第⼋章连续发酵(p105) (19)8.1基本概念 (19)8.2连续发酵的优缺点 (19)8.3连续发酵的类型 (19)8.4连续发酵操作⽅式 (20)8.4.1开放式连续发酵 (20)8.4.2封闭式连续发酵 (20)8.5膜连续发酵 (21)8.6连续发酵的控制⽅式 (21)8.7连续发酵的实际应⽤ (22)8.7.1连续发酵 (22)8.7.2分批发酵 (22)8.7.3补料分批发酵 (22)8.7.4连续发酵在⼯业上的应⽤ (23)第九章微⽣物的现代固态发酵(p121) (23)9.1固态发酵 (23)9.1.1固态发酵的特点 (23)9.1.2固体培养的优点 (23)9.1.3固液发酵的⽐较 (23)9.1.4传统固态发酵与现代固态发酵 (24)9.1.5固态发酵分类 (25)9.1.6适合固态发酵的微⽣物 (25)9.1.7固态发酵的界⾯作⽤ (25)9.2固态发酵反应器 (25)9.2.1静态固态发酵反应器 (25)9.2.2动态固态发酵反应器 (26)9.2.3固态发酵反应器 (26)9.3固态发酵的应⽤ (26)第⼗章基因⼯程菌株发酵(p154) (27)10.1⼯业化⽣产的基因⼯程菌应具备的条件 (27)10.2基因⼯程菌的发酵 (27)10.2.1培养操作和发酵设备 (27)10.3讨论与问题 (27)10.3.1基因⼯程菌的不稳定性 (27)10.3.2改善措施: (27)10.3.3⽣产过程: (27)第⼗⼀章发酵过程中氧的溶解、传递、测定及其影响因素(p167) (28)第⼗⼆章发酵控制⼯程(p183) (28)12.1讨论与问题 (28)第⼗三章空⽓除菌(p250) (29)13.1⼏个基本概念 (29)13.2染菌的危害 (29)13.3树⽴⽆菌概念,强调⽆菌操作 (29)13.4灭菌和除菌的基本原理 (30)13.5发酵⼯程的灭菌⼯程(p228) (30)13.5.1化学物质灭菌 (30)13.5.2⼲热灭菌法 (30)13.5.3湿热灭菌法 (31)13.5.4射线灭菌 (31)13.5.5过滤介质除菌 (31)13.5.6静电除菌 (31)13.5.7臭氧灭菌 (31)13.6名词概念 (32)13.7培养基和发酵设备的灭菌 (32)13.7.1温度和时间对培养基的影响 (32)13.7.2影响培养基灭菌的其他因素 (33)13.7.3培养基分批灭菌 (33)13.7.4发酵设备的灭菌 (34)13.8空⽓除菌 (34)13.8.1发酵⽤⽆菌空⽓的概念和质量标准 (34)第⼗四章发酵⼯程设备(p265) (35)14.1通⽓发酵罐 (35)14.1.1机械搅拌通⽓发酵罐 (35)14.1.2⾃吸式发酵罐 (35)14.2嫌⽓发酵罐 (36)14.2.1基本要求 (36)《发酵⼯程》1-14章节笔记第⼀章绪论(p1)1.1概念发酵⼯程利⽤微⽣物或动植细胞的⽣长繁殖和代谢活动以及特定功能,通过现代化⼯程技术⽣产有⽤物质或直接应⽤于⼯业化⽣产的技术体系;是将传统发酵与现代的DNA重组,细胞融合,分⼦修饰,和改造新技术结合并发展起来的现代发酵技术;它是渗透有⼯程学的微⽣物学和细胞⽣物学,是现代⽣物技术产业的基础与核⼼。
1、工业菌种改良的方法有哪些?(1)解除或绕过代谢途径中的限速步骤:通过增加特定基因的拷贝数或增加相应基因的表达能力来提高限速酶的含量;在代谢途径中引伸出新的代谢步骤,由此提供一个旁路代谢途径。
(2)增加前体物的浓度。
(3)改变代谢途径,减少无用副产品的生成以及提高菌种对高浓度的有潜在毒性的底物、前体或产品的耐受力。
(4)抑制或消除产品分解酶。
(5)改进菌种外泌产品的能力。
(6)消除代谢产品的反馈抑制。
如诱导代谢产品的结构类似物抗性。
2、基因克隆的最后一步是从转化细菌菌落中筛选出含有阳性重组子的菌落,并鉴定重组子的正确性,有哪些方法,其原理是什么?一、抗药性标志的筛选:如果克隆载体带有某种抗药性标志基因如ampr 或tetrr ,转化后只有含这种抗药基因的转化子细菌才能在含该抗菌素的平板上幸存并形成菌落,这样就可将转化菌与非转化菌区别开来。
如果重组DNA时将外源基因插入标志基因内,该标志基因失活,通过有无抗菌素培养基对比培养,还可区分单纯载体或重组载体(含外源基因)的转化菌落。
二、β-半乳糖苷酶系统筛选:很多载体都携带一段细菌的lacZ基因,它编码β-半乳糖苷酶N-端的146个氨基酸,称为α-肽,它表达β-半乳糖苷酶的C-端肽链。
当宿主的细胞的β-半乳糖苷酶基因发生删除突变,缺失N-端的一段氨基酸序列,使酶失活,但在α-肽存在时可以互补使酶恢复活性。
携带pUC质粒载体的大大肠杆菌在异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(isopropylthio-β-D-半乳糖苷,ITPG)的诱导下发生α-互补,可使呈色底物5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷被分解产生蓝色。
而重组子由于基因插入使α-肽基因失活,不能形成α-互补,在含X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)的平板上,含阳性重组子的细菌为无色菌落或噬菌斑。
三、菌落快速裂解鉴定法:从平板上直接挑选菌落裂解后,直接电泳检测载体质粒大小,判断有无插入片段存在,该法适于插入片段较大的重组子初筛。
大肠杆菌发酵经验总结大肠杆菌发酵经验总结首先,补料速率与比生长速率直接影响着乙酸的生成速率和积累量(主要是补料速率与比生长速率影响发酵液中的残糖量,进而影响),所以适当的控制补料速率和比生长速率,对于控制乙酸的量有很好的效果。
其次,必须要保证充足的溶氧,并严格控制pH值,而且补酸碱的速率尽量缓和,不能太快;温度对于蛋白的表达也有很重要的影响,较低的发酵温度下所生产出的蛋白大多是有活性的,而较高的发酵温度下产生的蛋白大多一包涵体形式存在。
第三,选取合理的诱导时间非常重要,一般的诱导时间选在指数生长后期,而且诱导时的比生长速率最好能控制在0.2之内,选在此时诱导,1.将菌体的快速生长期与蛋白合成期分开,使这两个阶段互不影响,有利于蛋白的高表达;2.已经得到了大量的菌体,而且菌体的生物量基本接近稳定,不论是从动力学角度,还是能耗,物料成本方面,都比较合理。
第四,补料过程中的碳氮比也很重要。
若氮源过高,会使菌体生长过于旺盛,pH偏高,不利于代谢产物的积累,氮源不足,则菌体繁殖量少从而影响产量;碳源过多,则容易刑场较低的pH,抑制菌体生长,碳源不足,则容易引起菌体的衰老和自溶。
另外,碳氮比不当还会引起菌体按比例的吸收营养物质,从而直接影响菌体的生长和产物的合成。
根据自己的经验,一般情况下,对于一个稳定的发酵工艺下,如果总是在固定的发酵时间段出现溶菌现象,而且能排除噬菌体和染菌的可能性后,那就可能是因为碳氮比不合理造成的。
可以适当调整碳氮比。
大家讨论得较多的是关于代谢副产物乙酸对大肠杆菌发酵的影响,现总结以下几点,并作出相应解决措施。
一、代谢副产物-乙酸乙酸是大肠杆菌发酵过程中的代谢副产物,在多大的浓度下产生抑制作用各种说法不一,一般认为在好气性条件下,5~10g/L 的乙酸浓度就能对滞后期、最大比生长速率、菌体浓度以及最后蛋白收率等都产生可观测到的抑制作用。
当乙酸浓度大于10或20g/L 时,细胞将会停止生长,当培养液中乙酸浓度大于12g/L 后外源蛋白的表达完全被抑制。
大肠杆菌发酵经验总结首先,补料速率与比生长速率直接影响着乙酸的生成速率和积累量(主要是补料速率与比生长速率影响发酵液中的残糖量,进而影响),所以适当的控制补料速率和比生长速率,对于控制乙酸的量有很好的效果。
其次,必须要保证充足的溶氧,并严格控制pH值,而且补酸碱的速率尽量缓和,不能太快;温度对于蛋白的表达也有很重要的影响,较低的发酵温度下所生产出的蛋白大多是有活性的,而较高的发酵温度下产生的蛋白大多一包涵体形式存在。
第三,选取合理的诱导时间非常重要,一般的诱导时间选在指数生长后期,而且诱导时的比生长速率最好能控制在0.2之内,选在此时诱导,1.将菌体的快速生长期与蛋白合成期分开,使这两个阶段互不影响,有利于蛋白的高表达;2.已经得到了大量的菌体,而且菌体的生物量基本接近稳定,不论是从动力学角度,还是能耗,物料成本方面,都比较合理。
第四,补料过程中的碳氮比也很重要。
若氮源过高,会使菌体生长过于旺盛,pH偏高,不利于代谢产物的积累,氮源不足,则菌体繁殖量少从而影响产量;碳源过多,则容易刑场较低的pH,抑制菌体生长,碳源不足,则容易引起菌体的衰老和自溶。
另外,碳氮比不当还会引起菌体按比例的吸收营养物质,从而直接影响菌体的生长和产物的合成。
根据自己的经验,一般情况下,对于一个稳定的发酵工艺下,如果总是在固定的发酵时间段出现溶菌现象,而且能排除噬菌体和染菌的可能性后,那就可能是因为碳氮比不合理造成的。
可以适当调整碳氮比。
大家讨论得较多的是关于代谢副产物乙酸对大肠杆菌发酵的影响,针对我们论坛所发的帖,我先总结以下几点,并作出相应解决措施。
一、代谢副产物-乙酸乙酸是大肠杆菌发酵过程中的代谢副产物,在多大的浓度下产生抑制作用各种说法不一,一般认为在好气性条件下,5~10g/L 的乙酸浓度就能对滞后期、最大比生长速率、菌体浓度以及最后蛋白收率等都产生可观测到的抑制作用。
当乙酸浓度大于10或20g/L 时,细胞将会停止生长,当培养液中乙酸浓度大于12g/L 后外源蛋白的表达完全被抑制。
流加培养名词解释-概述说明以及解释1.引言1.1 概述概述流加培养作为生物学和微生物学领域的一种培养方法,是一种通过提供适当的培养基和环境条件来满足细胞或微生物生长和繁殖的需求的过程。
它是一种广泛应用于实验室和工业生产中的技术,对于研究生物学和微生物学以及制造生物制品具有重要意义。
流加培养的基本原理是通过向培养基中连续添加新的培养液来维持细胞或微生物的生长。
在流加培养中,培养液会通过一个进料管源源不断地被加入到培养基中,而废液则通过排液管定期排除。
这种持续供给新鲜培养液和同时排除废液的过程,使得培养物中的养分始终处于较高的浓度,同时也有效地去除了代谢产物和有害物质,为细胞或微生物的生长提供了一个良好的环境。
流加培养广泛应用于许多领域,包括生物技术、生物制药和科学研究等。
在生物技术领域,流加培养被用于生产重组蛋白、表达目的蛋白以及制造生物燃料等。
在生物制药领域,流加培养可以用于生产抗生素、疫苗和其他生物制剂。
在科学研究中,流加培养被用于研究细胞生长和发育、细胞代谢以及微生物的生理学等。
尽管流加培养在许多方面具有优势,但也存在一些缺点。
流加培养的设备和操作相对复杂,需要一定的技术支持和成本投入。
此外,对于某些细胞或微生物来说,流加培养可能无法提供最适宜的生长环境。
因此,在选择培养方法时,需要根据具体的需求和实际情况进行权衡和选择。
综上所述,流加培养作为一种常用的生物学和微生物学培养方法,在实验室和工业中具有广泛的应用。
通过提供连续的培养液供给和废液排除,流加培养为细胞和微生物的生长提供了一个稳定和良好的环境。
然而,在实际应用中也需要考虑到其设备复杂性和适用性。
1.2文章结构文章结构部分内容:在本文中,我将按照以下结构来组织和呈现关于流加培养的相关内容。
首先,在引言部分,我会对流加培养进行概述,介绍其基本概念和背景。
接着,我会详细阐述本文的结构,包括各个章节的内容和组织方式。
最后,我会明确阐明本文的目的和意图。
1、何谓流加发酵?答:所谓流加发酵,即补料分批发酵(Fed-batch fermentation),有时又称半连续培养或半连续发酵,是指在分批发酵过程中间歇或连续地补加新鲜培养基的发酵方法2、写出Monod 方程,并写出其成立的条件和各参数的意义。
答: 条件:温度和pH 恒定时(1)菌体生长为均衡型非结构生长;(2)培养基中只有一种底物是生长限制性底物;(3)菌体产率系数恒定参数意义:μmax 称为最大比生长速率(h-1),Ks 称为半饱和常数(g/L),S 为限制性底物浓度。
3、细胞高密度培养过程存在的问题有哪些?其相应解决措施有哪些?答:问题:1.产物或代谢副产物的积累对生长的抑制2.氧的限制3.HCDC 中培养基粘度不断增加,引起混合不充分4.CO2和热量的高释放率解决措施1.控制比生长速率在产生乙酸的临界值以下选择合适的培养基2提高通气速率和搅拌速度富氧空气和纯氧在加压环境下培养 SK S s +=max μμ3有必要研究发酵罐中的搅拌模型,找到改善搅拌的方法。
4通过降低细胞比生长速率而部分的解决把培养温度从37℃降到26-30℃,会降低营养吸收和生长速度,因此会减少有毒副产物和代谢产生的热量。
降低温度也能减少细胞对氧的需求。
降低重组细胞温度也有可能减少包含体形式的蛋白质的产生。
4、无反馈控制的流加策略有哪些?答:开环(无反馈)控制恒速流加——以预先决定的(恒定的)速率流加营养物质,比生长速率逐渐降低。
加速流加——以逐渐增加的速率流加营养物质。
可补偿一些比生长速率的降低。
指数流加——以指数的速率流加营养物质。
可得到恒定的比生长速率。
闭环(反馈)控制即时DO——当DO降低时补加营养物质。
即时pH——主要碳源耗尽引起pH上升时补加营养物质。
二氧化碳释放率(CER)——CER基本正比于碳源的消耗速度。
这一方法最为经常用于控制比生长速率。
细胞浓度——营养物质流加速率由细胞浓度决定。
底物浓度控制——营养物质流加速率直接由主要碳源的浓度控制5、何谓发酵产物的理论得率?可由哪些途径计算得到?答:假设发酵过程中完全没有菌体生成,则YP/S 可达理论最高值,称为理论代谢产物产率 计算途径(a )根据化学计量关系计算例如,由葡萄糖、氨和氧生成谷氨酸的化学计量方程为∶依此计算 =147/180=0.82 (b )由生物化学计量关系计算根据由底物生成目标代谢产物的代谢途径,进行代谢过程中有关NAD(P)+和ATP 等辅底物的物料衡算,结合化学计量关系可求出下式 由该反应式得 =(147×12)/(13×180)=0.75由于NADPH 和ADP 的再生过程要消耗底物,故依这种方法求得的值要小于单纯依据化学计量关系求得的结果。
生物技术制药课后习题by××Yuan、生物技术制药分为哪些类型生物技术制药分为四大类应用重DN技括基因工程技术、蛋白质工程技制造的基因重组多肽蛋白质类治疗剂基因药物,如基因治疗剂,基因疫苗,反义药物和核酶来自动物、植物和微生物的天然生物药合成与部分合成的生物药、生物技术制药具有什么特征)分子结构复)具有种属特异)治疗针对性强,疗效)稳定性)基因稳定)免疫原)体内的半衰期)受体效)多效1)检验的特殊、生物技术制药中有哪些应用应用主要有基因工程制药:包括基因工程药物品种的开发,基因工程疫苗,基因工程抗体基因诊断与基因治疗,应用基因工程技术建立新药的筛选模型,应用基因工程技术改良种,产生新的微生物药物,基因工程技术在改进药物生产工艺中的应用,利用转基因动物生产蛋白质类药细胞工程制药:包括单克隆抗体,动物细胞培养,植物细胞培养生产次生代酶工程制发酵工程制、基因工程药物制造的主要程序有哪些基因工程药物制造的主要步骤有目的基因的克隆,构DN重组体,构造工程菌,目的基因的表达,外源基因表达物的分离纯化产品的检、影响目的的基因在大肠杆菌中表达的因素有哪些)外源基因的计)外源基因的表达效率1.a、启动子的强弱b、核糖体的结合位点c、SD序列和起始密码的间距d、密码子组成)表达产物的稳定)细胞的代谢付)工程菌的培养条、质粒不稳定分为哪两类,如何解决质粒不稳定性质粒不稳定分为分裂分为分裂不稳定和结构不稳定。
质粒的分裂不稳定是指工程菌裂时出现一定比例不含质粒的子代菌的现象;质粒的结构不稳定DN从质粒上丢失碱基重排,缺失所致工程菌性能的改变提高质粒稳定性的方法如下选择合适的宿主细选择合适的载选择压分阶段控制培控制培养条固定、影响基因工程菌发酵的因素有哪些?如何控制发酵的各种参数影响因素培养接种温溶解诱导时机的影诱导表达程P、什么是高密度发酵?影响高密度发酵的因素有哪些?可采取哪些方法来实现高密度发酵高密度发酵:是指培养液中工程菌的菌体浓度50gDCW/以上,理论上的最高值200gDCW/影响因素)培养)溶氧浓P)温)代谢副产实现高密度发酵的方法改进发酵条件、培养、建立流加式培养、提高供养能构建出产乙酸能力低的工程菌宿主菌、阻断乙酸产生的主要途、对碳代进行分、限制进入糖酵解途径的碳代谢、引入血红蛋白基构建蛋白水解酶活力低的工程化宿主、分离纯化常用的色谱分离方法有哪它们的原理是什方法有离子交换色谱、疏水色谱、反相色谱、亲和色谱、凝胶过滤色谱及高压液相色谱2.(1)离子交换色谱IEC:是以离子交换剂为固定相,依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法。
微生物的高密度培养高密度培养的定义:高密度培养:是应用一定的培养技术和设备来提高菌体生物量和目标产物时空产率的发酵技术。
一般认为,细胞密度接近理论值的培养为高密度培养。
但由于菌种、菌株及目标产物差异性较大,高密度培养的最终菌体生物量无法用一个确切的值或范围界定。
Riesenbere经计算认为,理论上大肠杆菌发酵所能达到的最高菌体密度为400g/L,考虑到实际情况的种种条件限制,Markel等认为最高菌体密度为200 g/L,此时,发酵液25%充满长3μm,宽1μm的菌体,发酵液粘度很高,几乎散失流动性。
而某些极端微生物细胞密度达到数克每升也可认为是高密度培养。
高密度培养技术最早用于酵母细胞的培养提高生物量或生产单细胞蛋白及乙醇的生产。
随着基因工程技术的发展和应用,构建基因工程菌已经成为提高目标蛋白表达水平的一项基本手段。
基因工程菌过量表达目标产物还有助于简化后续的分离纯化操作,同时也便于基因工程改造。
其中大肠杆菌、酵母是最常用的重组表达宿主菌高密度培养的优势:提高最终菌体生物量和目标产物的时空产率,缩小生物反应器体积,降低设备投资缩短发酵周期,减少水电使用,降低生产成本便于下游分离纯化工艺等高密度培养主要限制因素:固态或挥发性底物在液态培养基中,溶解限制底物对细胞生长可能存在限制或抑制作用。
底物和产物的稳定性差或易挥发产物降解产物或代谢副产物的积累,对细胞生长产生限制。
呼吸作用导致C02和热量的急剧积聚氧气需求量大,培养基黏度增加副产物的积累与毒害作用。
高密度培养的培养基:高密度培养要求培养基含有细胞生长所需的所有营养成分,配比均衡,且浓度不会对细胞生长产生抑制作用。
一般采用营养成分清晰的全合成培养基,便于发酵过程的调节控制和进一步的扩大培养。
培养基必须包含细胞生长必需的碳源、氮源、无机盐及生长因子。
高密度培养的初始发酵培养基营养成分必须低于抑制浓度,并结合恰当的流加补料策略提供营养物质,使细胞生长维持在最佳状态。
发酵工艺:工程菌高密度发酵工艺开发策略8项(以大肠杆菌为例)利用重组DNA技术获取的生物药物在人类文明史上具有划时代的意义。
许多价值高产量低的功能蛋白如干扰素、白细胞介素、集落刺激因子、生长激素、胰岛素、人血白蛋白、蛋白酶等都在工程菌中获得了高效率表达。
由于工程菌高密度培养能够提高单位体积的产量,在工业生产上可以提高效率降低成本。
所以,高密度培养一直都是发酵工程师们所追捧的热点。
本文就工程大肠杆菌高密度发酵工艺开发中涉及的关键控制点加以探讨。
1工程菌种稳定可靠的菌种是工业化大生产的有力保障,直接关系到生产效率和成本高低。
不同于传统诱变育种模式,在对待工程菌菌种问题上,有人认为基因工程菌种构建完成后无需经过严格单克隆筛选,既节约时间成本又大大减少了工作量,这其实是一个认识误区。
这样做出来的菌种很难连续稳定传代50次以上,给中试放大以及后续的长期稳定生产留下了隐患。
业内一般以能否稳定遗传50代作为判断工程菌种优劣的一个标准。
发酵所需的接种量不是越大越好,要适当。
接种量过小导致适应期过长,菌种易提前老化,也增加了杂菌污染的风险。
接种量过大会过早引起溶氧不足,导致发酵失控。
且营养物质消耗过快也会影响后期正常生长。
一般大肠杆菌接种量遵循逐级增大的原则,并将最后一级的放大倍数控制在10倍左右。
种子培养一定要在最佳条件下进行,培养时间不宜过长,当种子生长至最佳状态时果断移种。
如果种子做的不好,其负面影响往往在发酵中后期会有所体现。
工程菌种培养会加入抗生素,不仅是为了抑制杂菌生长,更重要的是为了给菌种形成正向的抗性筛选压力,及时淘汰质粒丢失的菌株或者衰老的菌体,保证质粒携带菌群的正常生长与表达。
2高密度发酵培养基除了必须的碳源以外,有机复合氮源在蛋白表达阶段不可或缺。
有机复合氮源可提供丰富的氨基酸、小肽、嘌呤、嘧啶、维生素、生物素以及一些生物活性物质,能减轻细胞代谢负担,促进外源蛋白表达。
如果酵母膏和蛋白胨是以流加的方式添加时,存在一种非常有趣的代谢机制:当流加培养基中只有酵母膏时,重组蛋白不稳定;而当流加培养基中只有蛋白胨时,大肠杆菌难以再利用其所产生的乙酸。
大肠杆菌发酵经验总结大肠杆菌发酵经验总结首先,补料速率与比生长速率直接影响着乙酸的生成速率和积累量(主要是补料速率与比生长速率影响发酵液中的残糖量,进而影响),所以适当的控制补料速率和比生长速率,对于控制乙酸的量有很好的效果。
其次,必须要保证充足的溶氧,并严格控制pH值,而且补酸碱的速率尽量缓和,不能太快;温度对于蛋白的表达也有很重要的影响,较低的发酵温度下所生产出的蛋白大多是有活性的,而较高的发酵温度下产生的蛋白大多一包涵体形式存在。
第三,选取合理的诱导时间非常重要,一般的诱导时间选在指数生长后期,而且诱导时的比生长速率最好能控制在0.2之内,选在此时诱导,1.将菌体的快速生长期与蛋白合成期分开,使这两个阶段互不影响,有利于蛋白的高表达;2.已经得到了大量的菌体,而且菌体的生物量基本接近稳定,不论是从动力学角度,还是能耗,物料成本方面,都比较合理。
第四,补料过程中的碳氮比也很重要。
若氮源过高,会使菌体生长过于旺盛,pH偏高,不利于代谢产物的积累,氮源不足,则菌体繁殖量少从而影响产量;碳源过多,则容易刑场较低的pH,抑制菌体生长,碳源不足,则容易引起菌体的衰老和自溶。
另外,碳氮比不当还会引起菌体按比例的吸收营养物质,从而直接影响菌体的生长和产物的合成。
根据自己的经验,一般情况下,对于一个稳定的发酵工艺下,如果总是在固定的发酵时间段出现溶菌现象,而且能排除噬菌体和染菌的可能性后,那就可能是因为碳氮比不合理造成的。
可以适当调整碳氮比。
大家讨论得较多的是关于代谢副产物乙酸对大肠杆菌发酵的影响,现总结以下几点,并作出相应解决措施。
一、代谢副产物-乙酸乙酸是大肠杆菌发酵过程中的代谢副产物,在多大的浓度下产生抑制作用各种说法不一,一般认为在好气性条件下,5~10g/L 的乙酸浓度就能对滞后期、最大比生长速率、菌体浓度以及最后蛋白收率等都产生可观测到的抑制作用。
当乙酸浓度大于10或20g/L 时,细胞将会停止生长,当培养液中乙酸浓度大于12g/L 后外源蛋白的表达完全被抑制。
大肠杆菌发酵经验总结首先,补料速率与比生长速率直接影响着乙酸的生成速率和积累量(主要是补料速率与比生长速率影响发酵液中的残糖量,进而影响),所以适当的控制补料速率和比生长速率,对于控制乙酸的量有很好的效果。
其次,必须要保证充足的溶氧,并严格控制pH值,而且补酸碱的速率尽量缓和,不能太快;温度对于蛋白的表达也有很重要的影响,较低的发酵温度下所生产出的蛋白大多是有活性的,而较高的发酵温度下产生的蛋白大多一包涵体形式存在。
第三,选取合理的诱导时间非常重要,一般的诱导时间选在指数生长后期,而且诱导时的比生长速率最好能控制在0.2之内,选在此时诱导,1.将菌体的快速生长期与蛋白合成期分开,使这两个阶段互不影响,有利于蛋白的高表达;2.已经得到了大量的菌体,而且菌体的生物量基本接近稳定,不论是从动力学角度,还是能耗,物料成本方面,都比较合理。
第四,补料过程中的碳氮比也很重要。
若氮源过高,会使菌体生长过于旺盛,pH偏高,不利于代谢产物的积累,氮源不足,则菌体繁殖量少从而影响产量;碳源过多,则容易刑场较低的pH,抑制菌体生长,碳源不足,则容易引起菌体的衰老和自溶。
另外,碳氮比不当还会引起菌体按比例的吸收营养物质,从而直接影响菌体的生长和产物的合成。
根据自己的经验,一般情况下,对于一个稳定的发酵工艺下,如果总是在固定的发酵时间段出现溶菌现象,而且能排除噬菌体和染菌的可能性后,那就可能是因为碳氮比不合理造成的。
可以适当调整碳氮比。
大家讨论得较多的是关于代谢副产物乙酸对大肠杆菌发酵的影响,针对我们论坛所发的帖,我先总结以下几点,并作出相应解决措施。
一、代谢副产物-乙酸乙酸是大肠杆菌发酵过程中的代谢副产物,在多大的浓度下产生抑制作用各种说法不一,一般认为在好气性条件下,5~10g/L 的乙酸浓度就能对滞后期、最大比生长速率、菌体浓度以及最后蛋白收率等都产生可观测到的抑制作用。
当乙酸浓度大于10或20g/L 时,细胞将会停止生长,当培养液中乙酸浓度大于12g/L 后外源蛋白的表达完全被抑制。
生物工程导论知识要点一、概论1.生物工程的概念:利用工程学的方法,将生命科学和技术的研究成果应用于生产实践或达到其他社会目标二、基因工程2.现代生物技术的核心:基因工程3.基因工程的定义:基因工程就是将外源基因通过体外重组后导入受体细胞(也称宿主细胞或寄主细胞)内,使这个基因能在受体细胞内复制、转录、翻译表达的操作。
基因工程的核心内容是在分子水平上对生物的遗传特性进行有目的的改造。
4.基因工程的基本步骤包括:1.带有目的基因的DNA片段的获取2.目的基因与载体的体外重组3.重组DNA分子导入受体细胞4.含重组体的细胞群体的繁殖扩增5.重组体的筛选6.目的基因的表达5.基因工程的实施的四个基本要素(1)基因(2)载体(3)工具酶(4)受体细胞6.基因工程的类似名称:遗传工程、基因工程、基因操作、重组DNA技术、分子克隆、基因克隆7.工具酶:限制性核酸内切酶、DNA连接酶、DNA聚合酶以及DNA和RNA的一些修饰酶8.II类限制性内切酶的特点1)识别特定的核苷酸序列,其长度一般为4-8个核苷酸,且具回文序列(双轴对称性)2)具有特定的酶切位点,产生特定的酶切末端(专一性)3)没有甲基化修饰酶功能,不需要ATP和SAM作为辅助因子,一般只需要Mg2+9.DNA连接酶:用于将两段乃至数段DNA片段拼接起来的酶。
基因工程中最常用的连接酶是T4DNA连接酶。
它催化DNA 5’磷酸基与3’羟基之间形成磷酸二酯键。
除T4DNA连接酶外,还有大肠杆菌的DNA连接酶,其催化反应基本与T4DNA连接酶相同,只是催化反应需要辅助因子NAD+参与。
10.基因工程载体:用于携带目标基因并使其能在特定细胞中稳定复制的DNA分子11.载体种类:质粒载体、噬菌体载体、病毒载体按功能:克隆载体、表达载体、穿梭载体12.质粒:是能自主复制的双链环状DNA分子,它们在细菌中以独立于染色体之外的方式存在。
(一个质粒就是一个DNA分子,1~200kb)可分为天然质粒和经过人工修饰的质粒载体。