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⼤肠杆菌发酵经验总结⼤肠杆菌发酵经验总结⾸先，补料速率与⽐⽣长速率直接影响着⼄酸的⽣成速率和积累量（主要是补料速率与⽐⽣长速率影响发酵液中的残糖量，进⽽影响），所以适当的控制补料速率和⽐⽣长速率，对于控制⼄酸的量有很好的效果。
其次，必须要保证充⾜的溶氧，并严格控制pH值，⽽且补酸碱的速率尽量缓和，不能太快；温度对于蛋⽩的表达也有很重要的影响，较低的发酵温度下所⽣产出的蛋⽩⼤多是有活性的，⽽较⾼的发酵温度下产⽣的蛋⽩⼤多⼀包涵体形式存在。
第三，选取合理的诱导时间⾮常重要，⼀般的诱导时间选在指数⽣长后期，⽽且诱导时的⽐⽣长速率最好能控制在0.2之内，选在此时诱导，1.将菌体的快速⽣长期与蛋⽩合成期分开，使这两个阶段互不影响，有利于蛋⽩的⾼表达；2.已经得到了⼤量的菌体，⽽且菌体的⽣物量基本接近稳定，不论是从动⼒学⾓度，还是能耗，物料成本⽅⾯，都⽐较合理。
第四，补料过程中的碳氮⽐也很重要。
若氮源过⾼，会使菌体⽣长过于旺盛，pH偏⾼，不利于代谢产物的积累，氮源不⾜，则菌体繁殖量少从⽽影响产量；碳源过多，则容易刑场较低的pH，抑制菌体⽣长，碳源不⾜，则容易引起菌体的衰⽼和⾃溶。
另外，碳氮⽐不当还会引起菌体按⽐例的吸收营养物质，从⽽直接影响菌体的⽣长和产物的合成。
根据⾃⼰的经验，⼀般情况下，对于⼀个稳定的发酵⼯艺下，如果总是在固定的发酵时间段出现溶菌现象，⽽且能排除噬菌体和染菌的可能性后，那就可能是因为碳氮⽐不合理造成的。
可以适当调整碳氮⽐。
⼤家讨论得较多的是关于代谢副产物⼄酸对⼤肠杆菌发酵的影响，针对我们论坛所发的帖，我先总结以下⼏点，并作出相应解决措施。
⼀、代谢副产物-⼄酸⼄酸是⼤肠杆菌发酵过程中的代谢副产物，在多⼤的浓度下产⽣抑制作⽤各种说法不⼀，⼀般认为在好⽓性条件下，5～10g/L 的⼄酸浓度就能对滞后期、最⼤⽐⽣长速率、菌体浓度以及最后蛋⽩收率等都产⽣可观测到的抑制作⽤。
当⼄酸浓度⼤于10或20g/L 时，细胞将会停⽌⽣长，当培养液中⼄酸浓度⼤于12g/L 后外源蛋⽩的表达完全被抑制。
1、工业菌种改良的方法有哪些？(1)解除或绕过代谢途径中的限速步骤：通过增加特定基因的拷贝数或增加相应基因的表达能力来提高限速酶的含量；在代谢途径中引伸出新的代谢步骤，由此提供一个旁路代谢途径。
(2)增加前体物的浓度。
(3)改变代谢途径，减少无用副产品的生成以及提高菌种对高浓度的有潜在毒性的底物、前体或产品的耐受力。
(4)抑制或消除产品分解酶。
(5)改进菌种外泌产品的能力。
(6)消除代谢产品的反馈抑制。
如诱导代谢产品的结构类似物抗性。
2、基因克隆的最后一步是从转化细菌菌落中筛选出含有阳性重组子的菌落，并鉴定重组子的正确性，有哪些方法，其原理是什么？一、抗药性标志的筛选：如果克隆载体带有某种抗药性标志基因如ampr 或tetrr ，转化后只有含这种抗药基因的转化子细菌才能在含该抗菌素的平板上幸存并形成菌落，这样就可将转化菌与非转化菌区别开来。
如果重组DNA时将外源基因插入标志基因内，该标志基因失活，通过有无抗菌素培养基对比培养，还可区分单纯载体或重组载体（含外源基因）的转化菌落。
二、β－半乳糖苷酶系统筛选：很多载体都携带一段细菌的lacZ基因，它编码β－半乳糖苷酶N-端的146个氨基酸，称为α－肽，它表达β－半乳糖苷酶的C-端肽链。
当宿主的细胞的β－半乳糖苷酶基因发生删除突变，缺失N－端的一段氨基酸序列，使酶失活，但在α－肽存在时可以互补使酶恢复活性。
携带pUC质粒载体的大大肠杆菌在异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（isopropylthio-β-D-半乳糖苷,ITPG）的诱导下发生α－互补，可使呈色底物5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷被分解产生蓝色。
而重组子由于基因插入使α－肽基因失活，不能形成α－互补，在含X-gal（5-溴-4-氯－3－吲哚-β-D-半乳糖苷）的平板上，含阳性重组子的细菌为无色菌落或噬菌斑。
三、菌落快速裂解鉴定法：从平板上直接挑选菌落裂解后，直接电泳检测载体质粒大小，判断有无插入片段存在，该法适于插入片段较大的重组子初筛。
微生物的高密度培养定义一[1]高密度培养指应用一定的培养技术和装置提高菌体的发酵密度，使菌体密度较普通培养有显著的提高，最终提高特定产物的比生产率。
单位：细胞干重/升（DCW/L）。
凡是细胞密度比较高，以至接近其理论值的培养均可称为高密度培养，，一般认为其上限值为150～200g （DWC/L），下限值为20～30g（DCW/L）。
定义二[2]细胞高密度培养(high cell density culture，HC-DC)是指在人工条件下模拟体内生长环境，使细胞在细胞生物反应器中高密度生长，使液体培养中的细胞密度超过常规培养10倍以上，最终达到提高特定代谢产物的比生产率(单位体积单位时间内产物的产量) 的目的，用于发酵生产生物制品的技术。
用途[1]各种微生物（乳酸杆菌、芽孢杆菌、大肠杆菌等）的生产中，改进发酵工艺，提升其现代化发酵进程，增加单位体积培养液中菌体的数量，提高生产效率，加速微生物制剂的商品化进程。
发展状况[2]细胞高密度培养不仅是生产高质量的浓缩型细胞和代谢产物的重要环节，是工程菌和非工程菌能否以低成本实现规模生产的关键性因素，也是细胞和代谢产物工业化生产过程中必需达到的重要目标与方向。
随着市场需求的日益扩大，高密度培养技术广泛地应用于各种细胞( 植物、动物、微生物) 的生产中，它不仅可以改进发酵工艺，提升其现代化发酵进程，而且对于增加单位体积培养液中菌体数量，提高生产率，加速微生物制剂的商品化进程，更好地满足市场需求，具有重要而深远的意义。
但是目前细胞高密度培养仍然是我国生物制品难以攻下的课题，只有对细胞高密度培养关键技术进行不断的研究、改进，科学系统地运用，才能对我国传统的生物制品生产技术进行升级和科技创新。
谷胱甘肽(GSH)的生产[3]谷胱甘肽(GSH)是一种重要的生化药物,具有独特的抗氧化、抗衰老特性,近年来作为食品添加剂,其需求渐增。
迄今国内尚未有工业化生产GSH的报道,为了打破进口品的垄断地位,迫切需要加大开发GSH的力度。
1、何谓流加发酵？答：所谓流加发酵，即补料分批发酵(Fed-batch fermentation)，有时又称半连续培养或半连续发酵，是指在分批发酵过程中间歇或连续地补加新鲜培养基的发酵方法2、写出Monod 方程，并写出其成立的条件和各参数的意义。
答： 条件：温度和pH 恒定时(1)菌体生长为均衡型非结构生长；(2)培养基中只有一种底物是生长限制性底物；(3)菌体产率系数恒定参数意义：μmax 称为最大比生长速率(h-1)，Ks 称为半饱和常数(g/L),S 为限制性底物浓度。
3、细胞高密度培养过程存在的问题有哪些？其相应解决措施有哪些？答：问题：1.产物或代谢副产物的积累对生长的抑制2.氧的限制3.HCDC 中培养基粘度不断增加，引起混合不充分4.CO2和热量的高释放率解决措施1.控制比生长速率在产生乙酸的临界值以下选择合适的培养基2提高通气速率和搅拌速度富氧空气和纯氧在加压环境下培养 SK S s +=max μμ3有必要研究发酵罐中的搅拌模型，找到改善搅拌的方法。
4通过降低细胞比生长速率而部分的解决把培养温度从37℃降到26－30℃，会降低营养吸收和生长速度，因此会减少有毒副产物和代谢产生的热量。
降低温度也能减少细胞对氧的需求。
降低重组细胞温度也有可能减少包含体形式的蛋白质的产生。
4、无反馈控制的流加策略有哪些？答：开环（无反馈）控制恒速流加——以预先决定的（恒定的）速率流加营养物质，比生长速率逐渐降低。
加速流加——以逐渐增加的速率流加营养物质。
可补偿一些比生长速率的降低。
指数流加——以指数的速率流加营养物质。
可得到恒定的比生长速率。
闭环（反馈）控制即时DO——当DO降低时补加营养物质。
即时pH——主要碳源耗尽引起pH上升时补加营养物质。
二氧化碳释放率（CER）——CER基本正比于碳源的消耗速度。
这一方法最为经常用于控制比生长速率。
细胞浓度——营养物质流加速率由细胞浓度决定。
底物浓度控制——营养物质流加速率直接由主要碳源的浓度控制5、何谓发酵产物的理论得率？可由哪些途径计算得到？答：假设发酵过程中完全没有菌体生成，则YP/S 可达理论最高值，称为理论代谢产物产率 计算途径（a ）根据化学计量关系计算例如，由葡萄糖、氨和氧生成谷氨酸的化学计量方程为∶依此计算 =147/180=0.82 （b ）由生物化学计量关系计算根据由底物生成目标代谢产物的代谢途径，进行代谢过程中有关NAD(P)+和ATP 等辅底物的物料衡算，结合化学计量关系可求出下式 由该反应式得 =(147×12)/(13×180)=0.75由于NADPH 和ADP 的再生过程要消耗底物，故依这种方法求得的值要小于单纯依据化学计量关系求得的结果。
（九月基因工程药品制备步骤学生姓名: 系 别: 专 业: 班 级: 指导老师:学校代码: 10128学 号:融合蛋白EGF。
E40rf4表示与纯化1．大规模摇瓶表示刮取平板上单克隆菌株, 接种于20 ml YPD液体培养基, 28～30。
C, 200～230rpm振荡培养20 h后, 将菌液转接于100 ml BMG中继续培养过夜, 使OD600达成15～18, 室温离心15009, 搜集菌体, 重悬于500ml BMMY,振荡培养24h后按最好诱导条件天天追加甲醇5ml, 使甲醇浓度保持在1％。
诱导96 h后, 离心搜集上清。
大致积培养时, 注意保持通气和温度, 培养体积不应超出摇瓶容积1／4, 瓶口用四层纱布罩好, 控制摇床转速在200—230 rpm, 温度28～30℃。
2．高密度发酵取．80℃保留菌株, 接种于20 ml BMG液体培养基, 28—30。
C, 200—230rpm 振荡培养20h后, 将菌液转接于100 ml BMG中继续培养过夜。
2L BMG置5L发酵罐内灭菌, 用NH40H调pH至6．0, 将100 ml菌液接种于BMG中, 28℃培养, 空气泵连续通氧, 保持溶氧在30％以上, 搅拌转速800 rpm左右, 约20小时甘油耗尽(表现为溶氧上升)。
流加含6 ml PTMl微量盐溶液50％甘油500ml。
待甘油流加完成而且罐内甘油耗竭, 补1％酵母提取物和2％蛋白胨以预防蛋白降解, 开始流加含12ml／LPTMl甲醇进行诱导。
经过观察溶氧改变调整甲醇流加速度, 定时取样测OD600值, 镜检监测菌体状态, 每12 h留取表示上清, 诱导3-4天下罐, 离心搜集上清。
3．SDS．PAGE蛋白电泳(1) 采取TCA沉淀对表示上清进行浓缩方法以下: 取0．5～1．0 ml样品, 加入1／10体积100％(W／V)TCA溶液, 混匀, 冰浴长于30 min: 44C, 12, 000rpm, 离心15min; 弃上清, 加入．20 4C保留丙酮o．5～1．O rIll, 4℃, 12, 000rpm, 离心5min: 反复一次; 沉淀室温晾干, 溶于20—40 p11×蛋白上样缓冲液中。
α-L-鼠李糖苷酶（α-L-rhamnosidase ，EC 3.2.1.40）广泛存在于自然界中，如哺乳动物组织、植物、真菌、细菌等[1-4]。
该酶是一种应用广泛的糖苷水解酶，它能高效水解多种末端含有非还原性鼠李糖残基的天然化合物，如水解芦丁为异槲皮苷[3]，水解淫羊藿苷C 为淫羊藿苷[5]，水解柚皮苷为普鲁宁等[4]。
此外，少数α-L-鼠李糖苷酶还能以L-鼠李糖为供体，通过逆水解反应催化合成鼠李糖苷，如甘露醇鼠李糖基化、酚类化合物鼠李糖基化等[6，7]。
迄今为止，根据CAZy 数据库，α-L-鼠李糖苷酶分属于三大糖苷水解酶家族，即GH13家族、GH78家族和GH106家族[8]，其中大部分属于GH78家族。
此外，α-L-鼠李糖苷酶是一种重要的酶，在食品和制药工业中有着广泛的应用。
然而，目前报道的α-L-鼠李糖苷酶普遍产量不高，到目前为止，全球还没有商品化的α-L-鼠李糖苷酶产品，这极大限制了该酶在工业上的应用。
大肠杆菌是遗传背景最清楚的菌株，其具有培养成本低、抗污染能力强、生长周期短、蛋白表达量高等优势，已经成为最常用的外源蛋白表达系统。
采用高密度发酵技术，能显著提高所培养的菌体密度，最终增加单位体积单位时间内目的产物的比生产率，缩减生产周期，提升经济效益，已经在工业中有很广泛的应用[9]。
在大肠杆菌高密度发酵中，大多采用补料分批发酵方式，以实现高密度的大肠杆菌和所需的蛋白质生产[10]。
这种补料方式一方面可以避免因某些营养成分初始浓度过高而出现底物抑制现象，另一方面又能够防止因限制性营养成分被耗尽而影响细胞的生长和产物的形成。
重组大肠杆菌高密度发酵是一个复杂的过程，需要对其生长的发酵参数进行优化，如葡萄糖进料速率、诱导温度、诱导pH 等。
葡萄糖是一种便宜且速效碳源，在大肠杆菌发酵生产中优于其他碳源。
但是，在有氧条件下，过多的葡萄糖会导致大肠杆菌代谢副产物的产生。
最常见的副产物是乙酸，它是由磷酸转乙酰酶（PTA ）/乙酸激酶（ACKA ）和丙酮酸氧化酶（POXB ）两种途径产生的[11]，主要原因是加入中央代谢系统的碳与细胞呼吸或三羧酸循环的有限能力之间不平衡[12]。
