流加发酵与高密度培养
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⼤肠杆菌发酵经验总结⼤肠杆菌发酵经验总结⾸先,补料速率与⽐⽣长速率直接影响着⼄酸的⽣成速率和积累量(主要是补料速率与⽐⽣长速率影响发酵液中的残糖量,进⽽影响),所以适当的控制补料速率和⽐⽣长速率,对于控制⼄酸的量有很好的效果。
其次,必须要保证充⾜的溶氧,并严格控制pH值,⽽且补酸碱的速率尽量缓和,不能太快;温度对于蛋⽩的表达也有很重要的影响,较低的发酵温度下所⽣产出的蛋⽩⼤多是有活性的,⽽较⾼的发酵温度下产⽣的蛋⽩⼤多⼀包涵体形式存在。
第三,选取合理的诱导时间⾮常重要,⼀般的诱导时间选在指数⽣长后期,⽽且诱导时的⽐⽣长速率最好能控制在0.2之内,选在此时诱导,1.将菌体的快速⽣长期与蛋⽩合成期分开,使这两个阶段互不影响,有利于蛋⽩的⾼表达;2.已经得到了⼤量的菌体,⽽且菌体的⽣物量基本接近稳定,不论是从动⼒学⾓度,还是能耗,物料成本⽅⾯,都⽐较合理。
第四,补料过程中的碳氮⽐也很重要。
若氮源过⾼,会使菌体⽣长过于旺盛,pH偏⾼,不利于代谢产物的积累,氮源不⾜,则菌体繁殖量少从⽽影响产量;碳源过多,则容易刑场较低的pH,抑制菌体⽣长,碳源不⾜,则容易引起菌体的衰⽼和⾃溶。
另外,碳氮⽐不当还会引起菌体按⽐例的吸收营养物质,从⽽直接影响菌体的⽣长和产物的合成。
根据⾃⼰的经验,⼀般情况下,对于⼀个稳定的发酵⼯艺下,如果总是在固定的发酵时间段出现溶菌现象,⽽且能排除噬菌体和染菌的可能性后,那就可能是因为碳氮⽐不合理造成的。
可以适当调整碳氮⽐。
⼤家讨论得较多的是关于代谢副产物⼄酸对⼤肠杆菌发酵的影响,针对我们论坛所发的帖,我先总结以下⼏点,并作出相应解决措施。
⼀、代谢副产物-⼄酸⼄酸是⼤肠杆菌发酵过程中的代谢副产物,在多⼤的浓度下产⽣抑制作⽤各种说法不⼀,⼀般认为在好⽓性条件下,5~10g/L 的⼄酸浓度就能对滞后期、最⼤⽐⽣长速率、菌体浓度以及最后蛋⽩收率等都产⽣可观测到的抑制作⽤。
当⼄酸浓度⼤于10或20g/L 时,细胞将会停⽌⽣长,当培养液中⼄酸浓度⼤于12g/L 后外源蛋⽩的表达完全被抑制。
1、工业菌种改良的方法有哪些?(1)解除或绕过代谢途径中的限速步骤:通过增加特定基因的拷贝数或增加相应基因的表达能力来提高限速酶的含量;在代谢途径中引伸出新的代谢步骤,由此提供一个旁路代谢途径。
(2)增加前体物的浓度。
(3)改变代谢途径,减少无用副产品的生成以及提高菌种对高浓度的有潜在毒性的底物、前体或产品的耐受力。
(4)抑制或消除产品分解酶。
(5)改进菌种外泌产品的能力。
(6)消除代谢产品的反馈抑制。
如诱导代谢产品的结构类似物抗性。
2、基因克隆的最后一步是从转化细菌菌落中筛选出含有阳性重组子的菌落,并鉴定重组子的正确性,有哪些方法,其原理是什么?一、抗药性标志的筛选:如果克隆载体带有某种抗药性标志基因如ampr 或tetrr ,转化后只有含这种抗药基因的转化子细菌才能在含该抗菌素的平板上幸存并形成菌落,这样就可将转化菌与非转化菌区别开来。
如果重组DNA时将外源基因插入标志基因内,该标志基因失活,通过有无抗菌素培养基对比培养,还可区分单纯载体或重组载体(含外源基因)的转化菌落。
二、β-半乳糖苷酶系统筛选:很多载体都携带一段细菌的lacZ基因,它编码β-半乳糖苷酶N-端的146个氨基酸,称为α-肽,它表达β-半乳糖苷酶的C-端肽链。
当宿主的细胞的β-半乳糖苷酶基因发生删除突变,缺失N-端的一段氨基酸序列,使酶失活,但在α-肽存在时可以互补使酶恢复活性。
携带pUC质粒载体的大大肠杆菌在异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(isopropylthio-β-D-半乳糖苷,ITPG)的诱导下发生α-互补,可使呈色底物5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷被分解产生蓝色。
而重组子由于基因插入使α-肽基因失活,不能形成α-互补,在含X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)的平板上,含阳性重组子的细菌为无色菌落或噬菌斑。
三、菌落快速裂解鉴定法:从平板上直接挑选菌落裂解后,直接电泳检测载体质粒大小,判断有无插入片段存在,该法适于插入片段较大的重组子初筛。
微生物的高密度培养定义一[1]高密度培养指应用一定的培养技术和装置提高菌体的发酵密度,使菌体密度较普通培养有显著的提高,最终提高特定产物的比生产率。
单位:细胞干重/升(DCW/L)。
凡是细胞密度比较高,以至接近其理论值的培养均可称为高密度培养,,一般认为其上限值为150~200g (DWC/L),下限值为20~30g(DCW/L)。
定义二[2]细胞高密度培养(high cell density culture,HC-DC)是指在人工条件下模拟体内生长环境,使细胞在细胞生物反应器中高密度生长,使液体培养中的细胞密度超过常规培养10倍以上,最终达到提高特定代谢产物的比生产率(单位体积单位时间内产物的产量) 的目的,用于发酵生产生物制品的技术。
用途[1]各种微生物(乳酸杆菌、芽孢杆菌、大肠杆菌等)的生产中,改进发酵工艺,提升其现代化发酵进程,增加单位体积培养液中菌体的数量,提高生产效率,加速微生物制剂的商品化进程。
发展状况[2]细胞高密度培养不仅是生产高质量的浓缩型细胞和代谢产物的重要环节,是工程菌和非工程菌能否以低成本实现规模生产的关键性因素,也是细胞和代谢产物工业化生产过程中必需达到的重要目标与方向。
随着市场需求的日益扩大,高密度培养技术广泛地应用于各种细胞( 植物、动物、微生物) 的生产中,它不仅可以改进发酵工艺,提升其现代化发酵进程,而且对于增加单位体积培养液中菌体数量,提高生产率,加速微生物制剂的商品化进程,更好地满足市场需求,具有重要而深远的意义。
但是目前细胞高密度培养仍然是我国生物制品难以攻下的课题,只有对细胞高密度培养关键技术进行不断的研究、改进,科学系统地运用,才能对我国传统的生物制品生产技术进行升级和科技创新。
谷胱甘肽(GSH)的生产[3]谷胱甘肽(GSH)是一种重要的生化药物,具有独特的抗氧化、抗衰老特性,近年来作为食品添加剂,其需求渐增。
迄今国内尚未有工业化生产GSH的报道,为了打破进口品的垄断地位,迫切需要加大开发GSH的力度。
1、何谓流加发酵?答:所谓流加发酵,即补料分批发酵(Fed-batch fermentation),有时又称半连续培养或半连续发酵,是指在分批发酵过程中间歇或连续地补加新鲜培养基的发酵方法2、写出Monod 方程,并写出其成立的条件和各参数的意义。
答: 条件:温度和pH 恒定时(1)菌体生长为均衡型非结构生长;(2)培养基中只有一种底物是生长限制性底物;(3)菌体产率系数恒定参数意义:μmax 称为最大比生长速率(h-1),Ks 称为半饱和常数(g/L),S 为限制性底物浓度。
3、细胞高密度培养过程存在的问题有哪些?其相应解决措施有哪些?答:问题:1.产物或代谢副产物的积累对生长的抑制2.氧的限制3.HCDC 中培养基粘度不断增加,引起混合不充分4.CO2和热量的高释放率解决措施1.控制比生长速率在产生乙酸的临界值以下选择合适的培养基2提高通气速率和搅拌速度富氧空气和纯氧在加压环境下培养 SK S s +=max μμ3有必要研究发酵罐中的搅拌模型,找到改善搅拌的方法。
4通过降低细胞比生长速率而部分的解决把培养温度从37℃降到26-30℃,会降低营养吸收和生长速度,因此会减少有毒副产物和代谢产生的热量。
降低温度也能减少细胞对氧的需求。
降低重组细胞温度也有可能减少包含体形式的蛋白质的产生。
4、无反馈控制的流加策略有哪些?答:开环(无反馈)控制恒速流加——以预先决定的(恒定的)速率流加营养物质,比生长速率逐渐降低。
加速流加——以逐渐增加的速率流加营养物质。
可补偿一些比生长速率的降低。
指数流加——以指数的速率流加营养物质。
可得到恒定的比生长速率。
闭环(反馈)控制即时DO——当DO降低时补加营养物质。
即时pH——主要碳源耗尽引起pH上升时补加营养物质。
二氧化碳释放率(CER)——CER基本正比于碳源的消耗速度。
这一方法最为经常用于控制比生长速率。
细胞浓度——营养物质流加速率由细胞浓度决定。
底物浓度控制——营养物质流加速率直接由主要碳源的浓度控制5、何谓发酵产物的理论得率?可由哪些途径计算得到?答:假设发酵过程中完全没有菌体生成,则YP/S 可达理论最高值,称为理论代谢产物产率 计算途径(a )根据化学计量关系计算例如,由葡萄糖、氨和氧生成谷氨酸的化学计量方程为∶依此计算 =147/180=0.82 (b )由生物化学计量关系计算根据由底物生成目标代谢产物的代谢途径,进行代谢过程中有关NAD(P)+和ATP 等辅底物的物料衡算,结合化学计量关系可求出下式 由该反应式得 =(147×12)/(13×180)=0.75由于NADPH 和ADP 的再生过程要消耗底物,故依这种方法求得的值要小于单纯依据化学计量关系求得的结果。
(九月基因工程药品制备步骤学生姓名: 系 别: 专 业: 班 级: 指导老师:学校代码: 10128学 号:融合蛋白EGF。
E40rf4表示与纯化1.大规模摇瓶表示刮取平板上单克隆菌株, 接种于20 ml YPD液体培养基, 28~30。
C, 200~230rpm振荡培养20 h后, 将菌液转接于100 ml BMG中继续培养过夜, 使OD600达成15~18, 室温离心15009, 搜集菌体, 重悬于500ml BMMY,振荡培养24h后按最好诱导条件天天追加甲醇5ml, 使甲醇浓度保持在1%。
诱导96 h后, 离心搜集上清。
大致积培养时, 注意保持通气和温度, 培养体积不应超出摇瓶容积1/4, 瓶口用四层纱布罩好, 控制摇床转速在200—230 rpm, 温度28~30℃。
2.高密度发酵取.80℃保留菌株, 接种于20 ml BMG液体培养基, 28—30。
C, 200—230rpm 振荡培养20h后, 将菌液转接于100 ml BMG中继续培养过夜。
2L BMG置5L发酵罐内灭菌, 用NH40H调pH至6.0, 将100 ml菌液接种于BMG中, 28℃培养, 空气泵连续通氧, 保持溶氧在30%以上, 搅拌转速800 rpm左右, 约20小时甘油耗尽(表现为溶氧上升)。
流加含6 ml PTMl微量盐溶液50%甘油500ml。
待甘油流加完成而且罐内甘油耗竭, 补1%酵母提取物和2%蛋白胨以预防蛋白降解, 开始流加含12ml/LPTMl甲醇进行诱导。
经过观察溶氧改变调整甲醇流加速度, 定时取样测OD600值, 镜检监测菌体状态, 每12 h留取表示上清, 诱导3-4天下罐, 离心搜集上清。
3.SDS.PAGE蛋白电泳(1) 采取TCA沉淀对表示上清进行浓缩方法以下: 取0.5~1.0 ml样品, 加入1/10体积100%(W/V)TCA溶液, 混匀, 冰浴长于30 min: 44C, 12, 000rpm, 离心15min; 弃上清, 加入.20 4C保留丙酮o.5~1.O rIll, 4℃, 12, 000rpm, 离心5min: 反复一次; 沉淀室温晾干, 溶于20—40 p11×蛋白上样缓冲液中。
α-L-鼠李糖苷酶(α-L-rhamnosidase ,EC 3.2.1.40)广泛存在于自然界中,如哺乳动物组织、植物、真菌、细菌等[1-4]。
该酶是一种应用广泛的糖苷水解酶,它能高效水解多种末端含有非还原性鼠李糖残基的天然化合物,如水解芦丁为异槲皮苷[3],水解淫羊藿苷C 为淫羊藿苷[5],水解柚皮苷为普鲁宁等[4]。
此外,少数α-L-鼠李糖苷酶还能以L-鼠李糖为供体,通过逆水解反应催化合成鼠李糖苷,如甘露醇鼠李糖基化、酚类化合物鼠李糖基化等[6,7]。
迄今为止,根据CAZy 数据库,α-L-鼠李糖苷酶分属于三大糖苷水解酶家族,即GH13家族、GH78家族和GH106家族[8],其中大部分属于GH78家族。
此外,α-L-鼠李糖苷酶是一种重要的酶,在食品和制药工业中有着广泛的应用。
然而,目前报道的α-L-鼠李糖苷酶普遍产量不高,到目前为止,全球还没有商品化的α-L-鼠李糖苷酶产品,这极大限制了该酶在工业上的应用。
大肠杆菌是遗传背景最清楚的菌株,其具有培养成本低、抗污染能力强、生长周期短、蛋白表达量高等优势,已经成为最常用的外源蛋白表达系统。
采用高密度发酵技术,能显著提高所培养的菌体密度,最终增加单位体积单位时间内目的产物的比生产率,缩减生产周期,提升经济效益,已经在工业中有很广泛的应用[9]。
在大肠杆菌高密度发酵中,大多采用补料分批发酵方式,以实现高密度的大肠杆菌和所需的蛋白质生产[10]。
这种补料方式一方面可以避免因某些营养成分初始浓度过高而出现底物抑制现象,另一方面又能够防止因限制性营养成分被耗尽而影响细胞的生长和产物的形成。
重组大肠杆菌高密度发酵是一个复杂的过程,需要对其生长的发酵参数进行优化,如葡萄糖进料速率、诱导温度、诱导pH 等。
葡萄糖是一种便宜且速效碳源,在大肠杆菌发酵生产中优于其他碳源。
但是,在有氧条件下,过多的葡萄糖会导致大肠杆菌代谢副产物的产生。
最常见的副产物是乙酸,它是由磷酸转乙酰酶(PTA )/乙酸激酶(ACKA )和丙酮酸氧化酶(POXB )两种途径产生的[11],主要原因是加入中央代谢系统的碳与细胞呼吸或三羧酸循环的有限能力之间不平衡[12]。
酵母培养物生产工艺(一)酵母培养物生产工艺介绍•酵母培养物是一种用于生产发酵产品的微生物培养物,具有广泛的应用领域。
•本文将介绍酵母培养物生产的工艺流程和关键步骤。
工艺流程•选择合适的酵母菌株–根据所需产品的特性,选择适合的酵母菌株。
•制备培养基–根据酵母菌的需求,配制适宜的培养基。
•菌种培养–将选定的酵母菌株接种到培养基中,进行预培养。
•移植培养–将预培养得到的酵母菌种移植到大规模培养器中进行主培养。
•发酵控制–控制培养器中的温度、pH值、氧气供应等条件,促进酵母菌的生长和代谢。
•收获培养物–在发酵结束后,通过分离、过滤等方法,获取酵母培养物。
关键步骤1.酵母菌株的选择非常重要,必须考虑到所需产品的特性和生产条件。
2.培养基的配制需要满足酵母菌的生长和代谢需求,如碳源、氮源、微量元素等。
3.培养器的选择和设计对酵母菌的培养效果至关重要,需考虑到氧气传递、温度控制等因素。
4.发酵过程中,控制发酵液的温度、pH值、氧气供应等指标,以及添加适量的培养基。
5.发酵结束后,通过适当的分离、过滤等步骤,获得纯净的酵母培养物。
结论•酵母培养物生产工艺需要综合考虑多个因素,包括酵母菌株的选择、培养基配制、发酵过程控制等。
•通过合理的工艺流程和关键步骤的控制,可以获得高质量的酵母培养物,满足不同产品的需求。
•进一步研究和改进酵母培养物生产工艺,有助于提高酵母培养物的产量和品质,促进相关产业的发展。
注:本文仅为示例,实际文章中需根据具体情况展开讨论。
培养基的配制•培养基是酵母培养物生产中至关重要的组成部分。
•酵母菌对培养基中的碳源、氮源、微量元素等有不同的需求。
•碳源可以选择葡萄糖、麦芽糖等,氮源可以选择酵母粉、尿素等。
•培养基需要pH调整,一般在5.0-6.0之间为宜。
发酵过程中的控制•发酵过程中,温度、pH值、氧气供应等控制是至关重要的。
•温度通常控制在26-30摄氏度之间,适合大多数酵母菌的生长。
•pH值的控制可以通过添加酸碱调节剂实现,常常在5.0-6.0之间调整。
2、什么是高密度培养,举例论述如何利用高密度培养技术来某一产品的。
答:高密度培养有时也称高密度发酵,一般是指微生物在液体培养中细胞群体密度超过常规培养10倍以上时的生长状态或培养技术,现代高密度培养技术主要是在用基因工程菌生产多肽类药物的实践中逐渐发展起来的。
重组大肠杆菌高密度培养技术摘要:阐述了基因工程菌高密度发酵工艺的几个主要影响因素,包括重组菌构建、培养条件、生长抑制因子以及它们的控制技术。
通过高密度发酵可以提高细胞生长密度、目的蛋白的表达含量。
在高密度发酵过程中,会产生一些有害抑制代谢副产物,但通过分批补料可以降低影响。
关键词:高密度发酵; 分批补料; 生长抑制因子。
重组DNA技术和大规模培养技术的有机结合,使得原来无法大量获得的天然蛋白质能够规模生产。
目前,已经在高密度培养中成功地提高了同源和异源蛋白的产量。
分批补料培养通常被用于微生物发酵,这种方法通过在培养过程克服细胞的调节机制:苹果酸影响,催化阻遏,产生抑制,使细胞密度达到较高水平。
大肠杆菌高密度培养工艺广泛地应用于重组蛋白的生产,这主要是由于大肠杆菌的遗传学和生理学已基本被认清。
产量的高低主要取决于细胞密度、目的蛋白的表达含量。
但在培养过程也存在一些问题,如氧、基质的利用率、小分子物质、生长抑制物的积累等。
因此,减少抑制物的形成,提供良好的生长条件是必要的。
1 重组大肠杆菌构建的几个影响因素1.1宿主菌的选择不同的大肠杆菌菌株在培养条件和外源基因表达能力上存在很大差别。
现在普遍应用的大肠杆菌BL21(DE3)plysS因其带有编码T7溶菌酶的小质粒,而有效地降低杂蛋白的表达,但不影响IPTG诱导目的蛋白的表达水平,从而成为近年来最为常用的宿主菌。
表达产物的形成在大肠杆菌体内有三条路径:第一,形成稳定的天然构象,可溶且有活性,不易被降解;第二,蛋白质是可溶性的,但构象为非天然状态,易被胞内的各种蛋白酶识别降解;第三,多肽链间彼此聚集形成不可溶的包涵体,并且有蛋白酶抗性。
发酵工艺:工程菌高密度发酵工艺开发策略8项(以大肠杆菌为例)利用重组DNA技术获取的生物药物在人类文明史上具有划时代的意义。
许多价值高产量低的功能蛋白如干扰素、白细胞介素、集落刺激因子、生长激素、胰岛素、人血白蛋白、蛋白酶等都在工程菌中获得了高效率表达。
由于工程菌高密度培养能够提高单位体积的产量,在工业生产上可以提高效率降低成本。
所以,高密度培养一直都是发酵工程师们所追捧的热点。
本文就工程大肠杆菌高密度发酵工艺开发中涉及的关键控制点加以探讨。
1工程菌种稳定可靠的菌种是工业化大生产的有力保障,直接关系到生产效率和成本高低。
不同于传统诱变育种模式,在对待工程菌菌种问题上,有人认为基因工程菌种构建完成后无需经过严格单克隆筛选,既节约时间成本又大大减少了工作量,这其实是一个认识误区。
这样做出来的菌种很难连续稳定传代50次以上,给中试放大以及后续的长期稳定生产留下了隐患。
业内一般以能否稳定遗传50代作为判断工程菌种优劣的一个标准。
发酵所需的接种量不是越大越好,要适当。
接种量过小导致适应期过长,菌种易提前老化,也增加了杂菌污染的风险。
接种量过大会过早引起溶氧不足,导致发酵失控。
且营养物质消耗过快也会影响后期正常生长。
一般大肠杆菌接种量遵循逐级增大的原则,并将最后一级的放大倍数控制在10倍左右。
种子培养一定要在最佳条件下进行,培养时间不宜过长,当种子生长至最佳状态时果断移种。
如果种子做的不好,其负面影响往往在发酵中后期会有所体现。
工程菌种培养会加入抗生素,不仅是为了抑制杂菌生长,更重要的是为了给菌种形成正向的抗性筛选压力,及时淘汰质粒丢失的菌株或者衰老的菌体,保证质粒携带菌群的正常生长与表达。
2高密度发酵培养基除了必须的碳源以外,有机复合氮源在蛋白表达阶段不可或缺。
有机复合氮源可提供丰富的氨基酸、小肽、嘌呤、嘧啶、维生素、生物素以及一些生物活性物质,能减轻细胞代谢负担,促进外源蛋白表达。
如果酵母膏和蛋白胨是以流加的方式添加时,存在一种非常有趣的代谢机制:当流加培养基中只有酵母膏时,重组蛋白不稳定;而当流加培养基中只有蛋白胨时,大肠杆菌难以再利用其所产生的乙酸。
大肠杆菌高度发酵控制关键误区大肠杆菌高密度发酵过程溶氧与氧分压和传质速度有关这众所周知,除此之外影响溶氧的最大因素是发酵过程中的耗氧,这一点很容易忽略。
耗氧不仅影响菌体密度还影响蛋白表达。
发酵过程中需要监测的是耗氧,但是耗氧通常是通过溶氧去监测。
溶氧为零时并非成了厌氧发酵。
厌氧发酵是不通入氧,而溶氧为零是通入的氧等于或小于耗氧。
在大肠杆菌高密度发酵的中后期,经常会出现溶氧为零的情况,此时若选择降低补料速度等方式使溶氧恢复到一定数值,这种做法并非是提高了溶氧而是降低了耗氧,这样严重影响菌体繁殖和蛋白表达。
大肠杆菌高密度发酵中后期,随菌体密度增大,菌体代谢旺盛,耗氧急速上升,发酵过程需氧量增大,在供氧不足时很容易出现溶氧为零的现象,此时若通过降低补料速度等方式使溶氧呈现出一定的数值,使蛋白过程降低,菌体代谢过程减缓就大错特错,这种做法并没有提高发酵过程的供氧。
此时需要加大供氧而非干预耗氧。
增大供养,保持一定溶氧的策略1.提高通气量2.提高罐压,增大氧分压3.提高转速,增大传质速度4.改变通入气体中的氧的比例,如空气和纯氧以一定的比例混合在通入概述重组大肠杆菌的高密度培养的目的在于获得更高的目标蛋白单位体积产量。
但是在重组大肠杆菌的高密度培养过程中,常常遇见的是高密度低表达现象,表达效率只有摇瓶的三分之一。
实现外源蛋白在菌体高密度培养过程中高效率表达仍是工程重组菌发酵的研究热点。
添加复合氮源菌体生长至高密度时,营养成分逐步耗尽。
营养的缺乏也是限制高密度培养下实现高表达的因素。
Shimizu等发现在表达阶段,限制蛋白胨和酵母抽提物的浓度,对外源基因表达不利,补料液中加大酵母抽提物比例可以提高外源蛋白的表达量。
认为有机氮源提供丰富的氨基酸、小肽、嘌呤、嘧啶、维生素、生物素以及一些生物活性物质,减轻了细胞代谢负担,促进了外源蛋白的表达。
利用代谢工程作用消除乙酸的抑制作用乙酸对菌体生长和外源蛋白表达抑制的机理通常认为是乙酸破坏了跨膜质子梯度,而跨膜质子梯度是氧化磷酸化和其它需能跨膜运输所必需。
大肠杆菌发酵经验总结首先,补料速率与比生长速率直接影响着乙酸的生成速率和积累量(主要是补料速率与比生长速率影响发酵液中的残糖量,进而影响),所以适当的控制补料速率和比生长速率,对于控制乙酸的量有很好的效果。
其次,必须要保证充足的溶氧,并严格控制pH值,而且补酸碱的速率尽量缓和,不能太快;温度对于蛋白的表达也有很重要的影响,较低的发酵温度下所生产出的蛋白大多是有活性的,而较高的发酵温度下产生的蛋白大多一包涵体形式存在。
第三,选取合理的诱导时间非常重要,一般的诱导时间选在指数生长后期,而且诱导时的比生长速率最好能控制在0.2之内,选在此时诱导,1.将菌体的快速生长期与蛋白合成期分开,使这两个阶段互不影响,有利于蛋白的高表达;2.已经得到了大量的菌体,而且菌体的生物量基本接近稳定,不论是从动力学角度,还是能耗,物料成本方面,都比较合理。
第四,补料过程中的碳氮比也很重要。
若氮源过高,会使菌体生长过于旺盛,pH偏高,不利于代谢产物的积累,氮源不足,则菌体繁殖量少从而影响产量;碳源过多,则容易刑场较低的pH,抑制菌体生长,碳源不足,则容易引起菌体的衰老和自溶。
另外,碳氮比不当还会引起菌体按比例的吸收营养物质,从而直接影响菌体的生长和产物的合成。
根据自己的经验,一般情况下,对于一个稳定的发酵工艺下,如果总是在固定的发酵时间段出现溶菌现象,而且能排除噬菌体和染菌的可能性后,那就可能是因为碳氮比不合理造成的。
可以适当调整碳氮比。
大家讨论得较多的是关于代谢副产物乙酸对大肠杆菌发酵的影响,针对我们论坛所发的帖,我先总结以下几点,并作出相应解决措施。
一、代谢副产物-乙酸乙酸是大肠杆菌发酵过程中的代谢副产物,在多大的浓度下产生抑制作用各种说法不一,一般认为在好气性条件下,5~10g/L 的乙酸浓度就能对滞后期、最大比生长速率、菌体浓度以及最后蛋白收率等都产生可观测到的抑制作用。
当乙酸浓度大于10或20g/L 时,细胞将会停止生长,当培养液中乙酸浓度大于12g/L 后外源蛋白的表达完全被抑制。
流加培养名词解释-概述说明以及解释1.引言1.1 概述概述流加培养作为生物学和微生物学领域的一种培养方法,是一种通过提供适当的培养基和环境条件来满足细胞或微生物生长和繁殖的需求的过程。
它是一种广泛应用于实验室和工业生产中的技术,对于研究生物学和微生物学以及制造生物制品具有重要意义。
流加培养的基本原理是通过向培养基中连续添加新的培养液来维持细胞或微生物的生长。
在流加培养中,培养液会通过一个进料管源源不断地被加入到培养基中,而废液则通过排液管定期排除。
这种持续供给新鲜培养液和同时排除废液的过程,使得培养物中的养分始终处于较高的浓度,同时也有效地去除了代谢产物和有害物质,为细胞或微生物的生长提供了一个良好的环境。
流加培养广泛应用于许多领域,包括生物技术、生物制药和科学研究等。
在生物技术领域,流加培养被用于生产重组蛋白、表达目的蛋白以及制造生物燃料等。
在生物制药领域,流加培养可以用于生产抗生素、疫苗和其他生物制剂。
在科学研究中,流加培养被用于研究细胞生长和发育、细胞代谢以及微生物的生理学等。
尽管流加培养在许多方面具有优势,但也存在一些缺点。
流加培养的设备和操作相对复杂,需要一定的技术支持和成本投入。
此外,对于某些细胞或微生物来说,流加培养可能无法提供最适宜的生长环境。
因此,在选择培养方法时,需要根据具体的需求和实际情况进行权衡和选择。
综上所述,流加培养作为一种常用的生物学和微生物学培养方法,在实验室和工业中具有广泛的应用。
通过提供连续的培养液供给和废液排除,流加培养为细胞和微生物的生长提供了一个稳定和良好的环境。
然而,在实际应用中也需要考虑到其设备复杂性和适用性。
1.2文章结构文章结构部分内容:在本文中,我将按照以下结构来组织和呈现关于流加培养的相关内容。
首先,在引言部分,我会对流加培养进行概述,介绍其基本概念和背景。
接着,我会详细阐述本文的结构,包括各个章节的内容和组织方式。
最后,我会明确阐明本文的目的和意图。