第四节酶的固定化一、固定化酶1．含义通过物理或化学的方法，将水溶性的酶与不溶性的载体结合，使酶固定在载体上，并在一定的空间范围内进行催化反应。
2．方法(1)共价键结合法：通过化学反应将酶以共价键结合到尼龙等载体上。
(2)包埋法：将酶包埋到多孔性凝胶中的固定化方法。
(3)物理吸附法。
3．优点(1)固定化酶的活性稳定，可反复使用；(2)固定化酶能与反应液分开，制品较易纯化；(3)工业化生产可实现大批量、连续化、自动化；(4)极大地降低了生产成本。
4．缺点需要制备纯净的酶，稍有不慎，酶就会失活。
二、固定化细胞1．含义用适当的载体将合成酶的细胞固定起来。
2．优点比固定化酶更简捷，使用寿命更长。
三、木瓜蛋白酶的固定化操作技术取尼龙布浸入等体积的CaCl2溶液和甲醇溶液中10 s左右―→盐酸溶液中室温下水解45 min―→蒸馏水冲洗至中性―→室温下放入戊二醛溶液中浸泡20 min―→磷酸缓冲液(pH 为7.8)反复洗涤―→木瓜蛋白酶溶液中固定3.5 h，温度为4_℃―→用NaCl溶液洗去多余的蛋白酶。
预习完成后，请把你认为难以解决的问题记录在下面的表格中问题1问题2问题3问题4一、酶、固定化酶与固定化细胞的比较直接使用酶固定化酶固定化细胞缺点①对环境条件非常敏感，易失活②难回收，成本高，影响产品质量不利于催化一系列的酶促反应反应物不易与酶接近，尤其是大分子物质，反应效率下降优点催化效率高、耗能低、污染低①既能与反应物接触，又能与产物分离②可以反复利用成本低，操作容易、寿命长①固定化细胞使用的都是活细胞，因此应提供一定的营养物质。
②固定化细胞由于保证了细胞的完整性，因而酶的环境改变较小，酶活性受外界影响也较小。
二、固定化酶的制备及利用1．酶的固定化：(1)18.6%的CaCl2溶液和甲醇溶液处理(10 s)，冲洗、吸干。
(2)3.65 mol/L的盐酸水解(45 min)，蒸馏水冲洗至中性。
(3)在5%的戊二醛溶液中浸泡(20 min)。
(4)0.1 mol/L的磷酸缓冲液洗涤，(多次)吸干。
(5)放1 mg/mL的木瓜蛋白酶溶液中(4 ℃处理3.5 h)。
↓2．检验酶的活性：(1)用固定化酶在适宜温度下分解蛋白质(10 min)(2)用双缩脲试剂检验↓3．酶的再利用：用取出的固定化酶再分解蛋白质细胞的固定化技术请参照细胞固定化技术的相关基础知识，完成下列问题。
(1)细胞固定化技术一般采用包埋法固定化，采用该方法的原因是_________。
(2)包埋法固定化是指_________________________。
(3)与固定化酶技术相比，固定化细胞技术的优点是___________。
(4)制备固定化大肠杆菌的步骤为：①______________________________________________________________；②______________________________________________________________；③______________________________________________________________；④______________________________________________________________。
【审题导析】【精讲精析】(1)固定化细胞的方法有包埋法、化学结合法和物理吸附法，一般来说多采用包埋法固定化，因为个大的细胞难以被吸附或结合，且不易从包埋材料中漏出。
(2)包埋法固定化即将微生物细胞均匀地包埋在不溶于水的多孔性载体中。
(3)与固定化酶技术相比，固定化细胞技术的成本更低，操作更容易。
(4)制备固定化大肠杆菌的程序为：培养大肠杆菌―→与生理盐水和琼脂混合―→琼脂凝固后切块―→用生理盐水和蒸馏水洗净。
【答案】(1)细胞个大，不易从包埋材料中漏出(2)将微生物细胞均匀地包埋在琼脂糖凝胶等多孔性载体中(3)成本更低，操作更容易(4)①用液体培养基培养大肠杆菌②取1 mL菌液与8 mL生理盐水和体积分数为2%的琼脂16 mL搅拌均匀③琼脂凝固后切成小块④用生理盐水和蒸馏水洗净固定化细胞的优点(1)固定化细胞含有一系列的酶，可以催化一系列的反应。
(2)反应的条件较易控制。
(3)使用时间更长。
1．生产酒精时，使用固定化细胞比固定化酶更好，原因不包括( )A．固定化细胞中含有一系列酶(与生产酒精有关)B．固定化细胞比固定化酶更经济、成本更低C．固定化细胞需要提供营养物质D．固定化细胞比固定化酶对环境条件要求低【解析】固定化细胞由于有活细胞存在，含有的酶是一系列的酶，对酒精生产更有利，固定化细胞对环境条件的要求更低，生产成本更低。
但是需要一定的营养物质。
【答案】 C固定化酶的应用关于固定化酶中的酶的说法正确的是( )A．酶的种类多样，可催化一系列的酶促反应B．酶被固定在不溶于水的载体上，可反复利用C．酶作为催化剂，反应前后结构不改变，所以固定化酶可永远利用下去D．固定化酶由于被固定在载体上，所以丧失了酶的高效性和专一性特点【审题导析】【精讲精析】酶是蛋白质，会出现老化、变性失活现象；作为催化剂，反应前后酶的结构不变，具有专一性和高效性。
酶被固定化后，仍然具有这些特性，并且由于固定在载体上，可以反复利用，但不能永远利用。
【答案】 B固定化酶在工业生产中的应用(1)固定化酶活性稳定，可反复使用。
(2)固定化酶可用于工业上大规模生产。
(3)用固定化酶生产可实现大批量、连续化、自动化，极大地降低生产成本。
2．关于固定化酶和一般酶制剂应用效果的说法中，错误的是( )A．固定化酶生物活性强，可长久使用B．一般酶制剂应用后和产物混在一起，产物的纯度不高C．一般酶制剂参加反应后不能重复利用D．固定化酶可以反复利用，降低生产成本，提高产量和质量【解析】固定化酶只是将酶固定在载体上，活性不变，仍具有蛋白质的特性，可以发生老化、变性、失活等。
【答案】 A1．下图中所示的酶固定化技术中属于包埋法的一组是( )①②③④A．①②B．①③④C．①④ D．③④【解析】①为吸附法，②为化学结合法，③④为包埋法，③包埋于网格中，④包埋于微胶囊中。
【答案】 D2．下列不属于固定化酶在利用时的特点的是( )A．有利于酶与产物分离B．可以被反复利用C．能自由出入依附的载体D．一种固定化酶一般情况下不能催化一系列酶促反应【解析】固定化酶只是将酶固定在载体上，仍然具有酶的特点(如专一性)，此外固定化酶还具有易与产物分离、能反复利用等优点。
【答案】 C3．(2016·江苏高考)为了探索海藻酸钠固定化对绿球藻生长的影响，以及固定化藻对含Zn2＋污水的净化作用，科研人员用筛选到的一株绿球藻进行实验，流程及结果如下。
请回答下列问题：图1图2(1)实验中的海藻酸钠作用是________，CaCl2的作用是________。
(2)为洗去凝胶球上残余的CaCl2和其他污染物，并保持绿球藻活性，宜采用________洗涤。
图1中 1.0%海藻酸钠组培养24 h后，移动凝胶球，溶液呈绿色，原因是________________。
(3)为探索固定化藻对含Zn2＋污水的净化作用，应选用浓度为____________海藻酸钠制备凝胶球。
(4)图2中空白凝胶球组Zn2＋浓度下降的原因是________。
结合图1和图2分析，固定化藻的实验组24～48 h间Zn2＋浓度下降速度较快的主要原因是____________；72～96 h间Zn2＋浓度下降速度较慢的原因有_________________。
【解析】(1)绿球藻为单细胞生物，可用包埋法固定化，实验中海藻酸钠的作用是包埋绿球藻。
配制好的海藻酸钠溶液需要滴入CaCl2溶液中，与CaCl2反应形成凝胶球，刚形成的凝胶球应在CaCl2溶液中浸泡一段时间，有利于形成稳定的结构。
(2)将固定好的凝胶球用绿球藻的培养液(生理盐水)清洗2～3次，能够洗去凝胶球上残余的CaCl2和其他污染物，并保持绿球藻的活性。
如果包埋绿球藻用的海藻酸钠浓度过低，或形成的凝胶球孔径过大，在培养过程中会有绿球藻从包埋材料中漏出来，使溶液呈绿色。
(3)分析图绿球藻数量变化曲线可知，浓度为 2.0%的海藻酸钠对绿球藻的包埋效果最好，凝胶球中包埋的绿球藻数量最多，故应选用该浓度的海藻酸钠制备凝胶球。
(4)由Zn2＋浓度变化曲线可知，空白凝胶球组Zn2＋浓度下降的原因是凝胶对Zn2＋有一定的吸附作用。
培养初期，绿球藻生长(增殖)速度较快，导致Zn2＋浓度下降速度较快；培养后期，由于绿球藻生长(增殖)速度减慢、溶液中Zn2＋浓度较低等，Zn2＋浓度下降速度较慢。
【答案】(1)包埋绿球藻(包埋剂) 与海藻酸钠反应形成凝胶球(凝固剂) (2)培养液(生理盐水) 海藻酸钠浓度过低(凝胶球孔径过大) (3)2.0% (4)凝胶吸附Zn2＋绿球藻生长(增殖)速度快绿球藻生长(增殖)速度减慢，溶液中Zn2＋浓度较低学业达标测评(九)一、选择题1．酶在大规模产业化应用中的核心问题是固定化技术，而酶固定化所依据的基本原理在于酶具有( )A．热稳定性B．催化高效性C．催化特异性D．可反复使用性【解析】固定化酶指通过物理或化学的方法，将水溶性酶与非水溶性载体结合，既能与反应物接触又能与产物分离，与直接使用酶相比，除催化效率高、特异性强外，还可反复使用；酶的热稳定性一般都不强。
故D正确。
【答案】 D2．用固定化酵母细胞发酵葡萄糖溶液时发现无酒精产生，原因不可能是( ) A．实验瓶盖了塞子B．瓶内氧气充足，进行了有氧呼吸C．固定化酵母细胞内可能没有酵母细胞D．所谓的葡萄糖液可能是其他物质【解析】利用酵母菌进行发酵无酒精产生，因此，可以认为是酵母菌没有进行无氧呼吸，既可能是氧气充足，也可能是缺少原料，但不可能是瓶口被密封了，如果密封，酵母菌会利用葡萄糖生成酒精。
【答案】 A3．下列关于木瓜蛋白酶的固定实验，说法错误的是( )A．把尼龙布放入木瓜蛋白酶溶液前要把尼龙布上的戊二醛吸干B．尼龙布首先要用18.6%的CaCl2溶液和甲醇溶液处理至发黏C．从木瓜酶液中取出尼龙布即得到尼龙固定酶D．检验酶活性前需把固定化酶取出【解析】尼龙布取出后应先用物质的量浓度为0.5 mol/L的NaCl溶液冲洗多余的蛋白酶。
【答案】 C4．固定化细胞常用包埋法固定化，原因是( )A．包埋法固定化操作最简便B．包埋法对酶活性的影响最小C．包埋法固定化具有普遍性D．细胞体积大，难以被吸附或结合【解析】因为细胞个大，而酶分子很小，个大的细胞难以被吸附或结合，而个小的酶容易被从包埋材料中漏出。
【答案】 D5．(2016·江苏高考改编)为了使牛仔裤呈现“穿旧”效果，在工业洗衣机中用酶洗代替传统的浮石擦洗，是目前重要的生产手段(工艺流程见下图)。
