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第一章基因工程
一.基本工具
(一)限制性核酸内切酶
1.分布:原核生物
2.作用:一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列,并且在特定部位
进行切割,使两个核苷酸间的磷酸二酯键断开。
3.作用结果：产生黏性末端或平末端
（二）DNA连接酶
1.分类（1）E.coliDNA连接酶来源：大肠杆菌
功能：只能连接黏性末端
（2）T4DNA连接酶来源：T4噬菌体
功能：连接黏性末端和平末端
2.作用：将DNA连接起来
（三）基因进入受体细胞的载体
1.条件（1）具有多个限制酶切割位点，供外源基因插入
（2）可自我复制或整合到染色体DNA中进行同步复制。
（3）具有标记基因，供重组DNA的鉴定和选择
2.种类：λ噬菌体的衍生物、动植物病毒、质粒
质粒：双链环状DNA分子，最常用，要人工改造
二。基本操作程序
（一）目的基因的获取
1.目的基因：编码蛋白质的基因或具有调控作用的因子
2.获取方法（1）从基因文库中获取
**基因组文库，部分基因文库
（2）利用PCR技术扩增目的基因
（3）化学方法直接人工合成：基因小，核苷酸序列已知（二）基因表达载体的构建（核心步骤）
1.目的(1)稳定存在，遗传给下一代
（2）表达和发挥作用
2.结构：启动子、目的基因、终止子、标记基因、复制原点
**启动子：RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录
**终止子：使转录在所需要的地方停止；
**标记基因：鉴别受体细胞中是否含目的基因。
（三）将目的基因导入受体细胞
1.转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内
维持稳定和表达
2.将目的基因导入植物细胞（1）农杆菌转化法（2）基因枪法
（3）花粉管通道法
3.将目的基因导入动物细胞：显微注射法
4.将目的基因导入微生物细胞：Ca+处理使细胞处于感受态
**原核细胞特点：繁殖快，单细胞，遗传物质相对较少（四）目的基因的检测与鉴定
1.分子水平的检测
（1）检测受体细胞中是否插入了目的基因:DNA分子杂交技术（2）检测目的基因是否转录出了 mRNA：DNA分子杂交技术（3）检测目的基因是否翻译成蛋白质：抗原—抗体杂交法
**检测成功会出现杂交带
2.个体生物学水平的鉴定：接种实验
三．基因工程的应用
1.动物、植物基因工程的成果
（1）植物：提高抗逆性、改良品质、生产药物；
（2）动物：品种改良、建立生物反应器、器官移植；
2.基因工程药物：细胞因子、抗体、疫苗、激素；
3.基因治疗（1）概念：
（2）方法体外基因治疗体内基因治疗
四．蛋白质工程的崛起
1.理论推测，人工合成
2.基因工程，蛋白合成（自然界没有的蛋白质）
第二章细胞工程
一.细胞工程
1.原理和方法:细胞生物学和分子生物学
2.操作水平:细胞水平或细胞器水平
3.目的:按照人们的意愿改变细胞内的遗传物质或获得细胞产品
4.分类:植物细胞工程和动物细胞工程
二.植物细胞工程的基本技术
(一)植物组织培养技术
1.原理:植物细胞具有全能性
2.条件(1)材料:离体
(2)培养基:营养激素
(3)外界条件:无菌等
3.过程:离体组织器官脱分化愈伤组织再分化胚状体植株
(二)植物体细胞杂交技术
1.概念:不同种杂种细胞植物体
2.原理：植物细胞具有全能性
3.过程(1)制备原生质体方法①酶解法
②酶:纤维素酶和果胶酶
③结果:获得原生质体
(2)诱导原生质体融合①方法:a物理法离心、振动、电激
b化学法:聚乙二醇(PEG)
②标志:杂种细胞再生出细胞壁
③结果：形成杂种细胞
（3）杂种细胞的筛选：AA BB AB AB
（4）植物组织培养：杂种细胞杂种植株
4.意义：克服远缘杂交不亲和的障碍
**生殖方式：无性生殖变异类型：染色体数目变异
（三）实际应用
1.植物繁殖的新途径
（1）微型繁殖：植物组织培养
（2）作物脱毒：茎尖组织培养
（3）人工种子：胚状体、芽+ 人工薄膜
**可加入固氮菌、抗生素、除草剂等有利于生长和提高产量2.作物新品种的培育
（1）单倍体育种
（2）突变体的利用
3.细胞产物的工产化生产
（1）细胞产物种类蛋白质、糖类、药物、香料、生物碱（2）一般为愈伤组织时期
第二课时
三．动物细胞工程
（一）动物细胞培养的过程细胞株
取材处理单个细胞培养细胞悬浮10代细胞
原代培养
1.取材：胚胎细胞或幼龄动物的组织器官
2.处理：剪碎、胰蛋白酶或胶原蛋白酶
3.培养：（1）培养基：液体培养基、合成培养基
（2）条件①无菌无毒环境（灭菌抗生素更换）
②营养:、、维生素、动物的血清、血浆
③温度PH:36.5+/-0.5 7.2~7.4
④气体环境：O2代谢所必需；CO2维持培养液PH
4.原代培养：细胞贴壁、接触抑制、冷冻保存（1~10代）
5.传代培养：①酶处理、分装；
②细胞株：10~50代，正常
③细胞系：50代以后，有癌变特点
6.应用：皮肤移植、生产蛋白质制品、有毒物质的检测、研究
四.动物细胞核移植和克隆动物
1.概念:核移植重组胚胎个体
2.原理:动物细胞核具有全能性
3.分类:胚胎细胞核移植和体细胞核移植
4.过程:见课本
5.应用与存在的问题
(1)畜牧业、保护濒危物种、医药卫生、治疗疾病、器官移植
(2)问题:成功率低健康问题食品安全问题
