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改良法体外分离培养炎症来源的人牙周膜干细胞刘焱; 陈青宇; 赵晓霞; 高翔; 高俊武; 王靖宇【期刊名称】《《医学理论与实践》》【年(卷),期】2019(032)023【总页数】4页(P3764-3767)【关键词】炎症; 人牙周膜干细胞; 改良法; 体外培养【作者】刘焱; 陈青宇; 赵晓霞; 高翔; 高俊武; 王靖宇【作者单位】内蒙古自治区包头医学院口腔学院内蒙古包头市 014060; 内蒙古自治区包头医学院第一附属医院; 内蒙古自治区呼和浩特市第一医院【正文语种】中文【中图分类】R787牙周炎发病率高，是成人失牙最主要的原因。
能否有效控制感染并争取病损部位最大限度地组织再生和重建是控制牙周炎病程进展的重要评价指标。
随着组织工程材料和技术的日新月异及生物信号分子研究的快速进步，牙周组织再生进入了蓬勃发展的时代[1]。
存在于牙周韧带组织的人牙周膜干细胞(human periodontal ligament stem cells，hPDLSCs)增殖能力旺盛且具有多向分化潜能，经诱导可形成牙骨质/牙周膜样结构[2]。
hPDLSCs被认为是牙周组织工程中最理想的种子细胞，已成为牙周组织的再生、种植体周围缺损的修复以及正畸牙齿微环境改建过程中重要的细胞学基础[3]。
hPDLSCs主要来源于健康的乳牙及年轻恒牙，然而成年人中约80%罹患慢性牙周炎，其中20%为重度牙周炎。
对于这些患者，能否从炎症状态下的牙周韧带中成功分离得到自体健康的hPDLSCs；长期慢性炎症对hPDLSCs的细胞表型、增殖能力及干细胞生物学特性有无改变[4-6]都影响着i-hPDLSCs的临床应用。
常规方法分离和纯化i-hPDLSCs的成功率较低。
本实验采用改良酶消化组织块盖玻片培养法结合有限稀释克隆法分离和筛选i-hPDLSCs，获得单细胞克隆i-hPDLSCs，并在扩增后鉴定其生物学特性，以期为组织工程牙周再生治疗的种子细胞的筛选与培养提供理论基础和实验依据。
炎症状态下牙周膜干细胞生物学行为的变化孔祥伟;陈博;程义成;刘向辉【期刊名称】《口腔生物医学》【年(卷),期】2018(009)003【摘要】目的:探讨慢性牙周炎症状态下牙周膜干细胞(PDLSCs)生物学行为的变化.方法:通过有限稀释法从正常和炎症牙周组织中分离、培养牙周膜干细胞,流式细胞仪鉴定细胞表型;细胞周期检测、MTT分析和克隆形成率检测细胞增殖能力;成骨、成脂诱导检测细胞分化能力.结果:在炎症感染的牙周组织中同样含有牙周膜干细胞,两种PDLSCs的细胞表面分子表达基本一致.流式细胞仪检测两种PDLSCs均表达间充质干细胞的表面标志物,且表达一致;与来自健康牙周组织的PDLSCs相比,来自牙周炎症组织的PDLSCs增殖能力增强,但成骨、成脂分化能力减弱.结论:在慢性炎症微环境的作用下,PDLSCs的生物学行为发生改变,增殖能力增强,而分化能力减弱.【总页数】5页(P143-147)【作者】孔祥伟;陈博;程义成;刘向辉【作者单位】南京中医药大学附属八一医院口腔科,江苏南京210002;南京中医药大学附属八一医院口腔科,江苏南京210002;南京中医药大学附属八一医院口腔科,江苏南京210002;南京中医药大学附属八一医院口腔科,江苏南京210002【正文语种】中文【中图分类】R780.2【相关文献】1.二甲双胍对炎症状态下人视网膜血管内皮细胞生物学行为的保护作用及其机制[J], 韩静;闫小龙;Xiaoxi Qiao;;;;2.二甲双胍对炎症状态下人视网膜血管内皮细胞生物学行为的保护作用及其机制[J], 韩静;闫小龙;Xiaoxi Qiao3.糖原合成酶激酶3β对炎症状态下牙周膜干细胞成骨分化能力的影响 [J], 刘娜;蒋贵新;张博;顾斌;刘洪臣4.炎症微环境下人牙周膜干细胞的生物学特性 [J], 袁萍;李淑慧;赵璐;于莉;周春梅;吴佩玲;5.miR-17在炎症状态下的人牙周膜干细胞成骨分化中的调控作用 [J], 刘亚丽;刘文佳;胡成虎因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
有限稀释法分离纯化人牙周膜干细胞的实验研究目的体外分离培养人牙周膜干细胞（periodontal ligament stem cells，PDLSCs）并进行鉴定。
方法采用有限稀释法分离和纯化PDLSCs并通过克隆形成及多向分化实验，鉴定所得细胞的增殖和分化能力。
结果分离纯化所得细胞均为长梭形或者不规则形，克隆细胞呈旋涡状集落生长趋势，体外诱导条件下可向成骨细胞、脂肪细胞分化，具有干细胞增殖和多向分化的特性。
结论有限稀释法分离纯化的PDLSCs具有间充质干细胞的表型及增殖和多向分化的生物学特性。
Abstract：Objective To isolate and culture the human periodontal ligament stem cells（PDLSCs）in vitro and to identify them.Methods PDLSCs were isolated and purified by limiting dilution method.The proliferation and differentiation ability of the obtained cells were identified by clonal formation and multidirectional differentiation experiments.Results The purified cells were fusiform or irregular in shape，cell clone was spiral colony growth trend under induction to osteoblasts，adipocytes，with characteristics of proliferation and multi cell differentiation.Conclusion PDLSCs isolated and purified by limited dilution method have the phenotype of mesenchymal stem cells and the biological characteristics of proliferation and multi-directional differentiation.Key words：Finite dilution method；Human periodontal ligament stem cells；Clonal formation；Induction differentiation牙周病是一种慢性炎症骨吸收疾病，是造成成年人牙齿丧失最主要的原因[1-2]。
人牙周膜细胞不同分离培养方法的比较研究刘娟;孟波;赵华;赵红宇;谢宝仪【期刊名称】《广东牙病防治》【年(卷),期】2011(19)12【摘要】目的探讨组织块法、酶解组织块法和酶消化法体外分离培养人牙周膜细胞的优缺点.方法分别应用组织块法、酶解组织块法及酶消化法进行人牙周膜细胞分离培养,鉴定细胞来源,利用倒置显微镜观察细胞生长状况.结果应用组织块法从24块人牙周膜组织中成功分离培养出人牙周膜细胞,成功率96％( 24/25),细胞生长状态良好；应用酶解组织块法成功率80％(16/20)；应用酶消化法成功率75％(12/16).结论组织块法原代培养人牙周膜细胞方法简单且成功率较高.%Objective To explore an effective culture technique for human periodontal ligament cells (PDLC) by comparing the effects of tissue explaining, enzymatic digestion, and the combination of both. Methods The tissues of periodontal ligament isolated from 25 human permanent teeth were cultured using tissue explanting; The tissues of periodontal ligament isolated from 20 human permanent teeth were cultured by enzyme digestion; The tissues of periodontal ligament isolated from 16 human permanent teeth were cultured using the combination of tissue explanting and enzymatic digestion. Cell growth and morphology were observed under an inverted microscope. Results The successful rate of tissue explanting (96% ) was higher than others (80% and 75% ) and the cell grew well. Conclusion Tissue explanting for primary culture of humanperiodontal ligament cells is relatively simple and has a higher successful rate, so it can be regarded as an effective method for PDLC culture.【总页数】4页(P631-634)【作者】刘娟;孟波;赵华;赵红宇;谢宝仪【作者单位】广东省口腔医院南方医科大学附属口腔医院,广东广州,510280;广东省口腔医院南方医科大学附属口腔医院,广东广州,510280;广东省口腔医院南方医科大学附属口腔医院,广东广州,510280;广东省口腔医院南方医科大学附属口腔医院,广东广州,510280;广东省口腔医院南方医科大学附属口腔医院,广东广州,510280【正文语种】中文【中图分类】R781.4【相关文献】1.分离肝细胞纯化培养方法的比较研究 [J], 刘俊;王英杰;王宇明;刘国栋;谭朝霞;刘鸿凌;于乐成2.人骨髓间充质干细胞体外分离培养方法的比较研究 [J], 丁伟荣;吴晓牧;饶燕飞;杨志刚;柳喆;张水生3.四种气管上皮细胞分离培养方法的比较研究 [J], 邓三明;汪健;连耀国;倪云峰;卢强;杨晔;李小飞4.细毛羊毛囊干细胞分离培养方法比较研究 [J], 郭婷婷;张世栋;牛春娥;郭健;孙晓萍;冯瑞林;刘建斌;岳耀敬;杨博辉5.外环境中甲型副伤寒沙门菌分离培养方法的比较研究 [J], 郑官增;裘丹红;陈忠妙;王敬;王满琴;郑伟;何浙生因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
万方数据甄蕾，等．人牙周膜干细胞的初步鉴定及体外成骨诱导ＺＨＥＮＬｅｉ．ｅｔａＬＨｕ眦ｎＰｅｒｉｏｄｏｎｔａｌＬｉｇａｍｅｎｔＳｔｅｍＣｅｌｌｓＤｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｉｎｔｏＯｓｔｅｏｂｌａｓｔｓ／ｎｖ／ｔｒｏ・３１９・ＲＮＡ提取试剂盒、一步法ＲＴ．ＰＣＲ试剂盒（Ｔｉａｎｇｅｎ公司。
北京）。
１．２方法１．２．１牙周膜细胞原代培养收集临床１２一１８岁因正畸需要而拔除的牙周健康、无龋的新鲜前磨牙，ＰＢＳ洗３次，刮取根中ｌ，３牙周膜组织，采用酶解组织块法培养，每隔３ｄ换液．直至细胞从组织块周围游出。
细胞生长达８０％汇合时传代。
１．２．２有限稀释法克隆化培养纯化ＰＤＬＳＣｓ取对数生长期的第１代细胞。
以１～２个／孔的密度接种于９６孔板，常规培养７。
１４ｄ，至出现细胞克隆（细胞数≥５０为判定标准）后扩大培养。
１．２．３ＰＤＬＳＣｓ的初步鉴定分别取第２代克隆形成细胞进行爬片。
采用ＳＰ法检测波形蛋白和角蛋白的表达。
同时利用兀ＴＣ荧光标记二抗检测ＳＴＲＯ．．１和ＣＤｌ４６的表达。
１．２．４体外诱导分化取第２代对数生长期的克隆形成细胞。
按５ｘｌｌＹ个／ｍＬ接种于２４孔板中，待细胞进入对数生长期后弃去原培养液。
ＰＢＳ洗３遍，换诱导液（１０ｍｍｏｌ／ＬＢ．甘油磷酸钠、１０｛ｍｏｌ／Ｌ地塞米松、５０Ｉ．Ｌｇ／ｍＬ维生素Ｃ）培养２１ｄ。
对照组细胞常规培养。
１．２．５成骨性能的鉴定１．２．５．１茜素红Ｓ染色观察钙结节形成人ＰＤＬＳＣｓ诱导培养２１ｄ后弃去培养液，４％多聚甲醛固定３０ｍｉｎ后饱和茜素红Ｓ溶液染色１０ｍｉｎ，观察钙结节形成情况。
１．２．５．２定性的细胞ＡＬＰ活性检测人ＰＤＬＳＣｓ诱导培养２１ｄ后弃去培养液。
按ＡＬＰ检测试剂盒说明书规范操作。
光学显微镜下观察染色情况。
１－２．５．３免疫细胞化学检测ＢＳＰ、Ｉ型胶原表达人ＰＤＬＳＣｓ诱导培养２１ｄ后常规ＳＰ法检测ＢＳＰ、Ｉ型胶原蛋白表达情况。
１．２．５．４ＲＴ－ＰＣＲ检测ＡＬＰ、ＢＳＰｍＲＮＡ表达收集诱导培养２１ｄ后的人ＰＤＬＳＣｓ．。
牙周膜干细胞论文：牙周膜干细胞的培养和鉴定【中文摘要】本研究从离体牙的牙周膜上分离出牙周膜细胞群,并对其进行纯化；在此基础上,对纯化后的细胞进行鉴定。
证实该细胞为“干细胞性”细胞,为后续牙周组织工程研究提供实验基础。
方法：1.分离纯化人牙周膜干细胞收集临床因正畸或阻生拔出的无龋病、无牙周病的恒牙,取根中1/3的牙周膜,采用酶解组织块法分离到牙周膜细胞群,然后有限稀释克隆法对牙周膜细胞群进行纯化,通过MTT法分析牙周膜细胞群与纯化后的牙周膜细胞的生长情况。
2.牙周膜来源干细胞的初步鉴定采用流式细胞仪分析细胞周期和细胞表面标记物,经成骨诱导液诱导细胞,对细胞进行初步鉴定。
结果：1.有限稀释克隆纯化后的细胞呈长梭形,通过MTT检测,证明该细胞是慢增殖周期的细胞。
2.流式细胞仪检测纯化后的细胞的周期特点和细胞表面标志物,证实其符合干细胞特性。
3.诱导纯化后的细胞成骨分化,细胞出现单极化,其间有针尖大小的钙结节形成,证实纯化后的细胞具有分化潜能。
结论：1.酶解组织块法有效分离到人牙周膜细胞群,有限稀释克隆纯化获得的牙周膜干细胞保持了其生物学特性。
该细胞具有干细胞周期特点,且有成骨分化潜能。
2.培养出牙周膜干细胞,可为组织工程提供基础。
【英文摘要】:Periodontal ligament cell populations were isolated from the periodontal membrane of extracted teeth and were purified; On this basis, the purified cells wereidentified. This paper confirmed that the cells were “stem cells” cells, to provide a basis for follow-up study of periodontal tissue engineering experimental.Methods:1. Separation and purification of human periodontal ligament stem cells Collecting the permanent teeth removal, without caries and periodontal disease, was indicated in the clinical cases due to orthodontic or impacted. Take the periodontal membrane on the middle 1/3 of the root surface. We separated cells within the periodontal tissue membrane by enzymatic, purified cells by limiting dilution cloning. The growth of periodontal ligament cell populations and purified periodontal ligament cells were analyzed by MTT.2. preliminary identification of Periodontal ligament stem cells:Cell cycle and cell surface markers were detected by flow cytometry. Osteogenic medium induced cells to identified cells.Results:1. Cells purified by limiting dilution cloning appeared Spindle. The results show that the cell is a slow proliferation cycle stem cells by MTT detection.2. The cells purified were detected cell surface markers and cell cycle characteristics by flow cytometry. The result demonstration that the cells accordance with characteristics of stem cell.3. Purified cells were induced by osteogenic medium, cells were unipolar, there have been needlethe size of calcium nodules, confirmed that the purified cells possess differentiation potential.Conclusion:1. Cells which maintain their biological characteristics were effectively isolated by Enzymatic and purified by limiting dilution cloning. And the cells have characteristics of stem cell cycle and potential of Osteogenic differentiation.2. Cultured periodontal ligament stem cells provide the basis for tissue engineering.【关键词】牙周膜干细胞组织工程细胞鉴定【英文关键词】Periodontal ligament stem cells Tissue Engineering Cell identification【目录】牙周膜干细胞的培养和鉴定摘要3-4ABSTRACT4-5缩略词表7-8第1章引言8-9第2章人牙周膜干细胞的分离培养和鉴定9-18第一部分分离纯化人牙周膜细胞9-13 1 材料和方法9-11 1.1 主要试剂和仪器9-10 1.2 细胞的分离和纯化10-11 2 结果11-12 2.1 细胞生长的情况11 2.2 细胞的克隆形成情况11 2.3 细胞生长曲线11-12 3 讨论12-13第二部分筛选纯化后的人牙周膜干细胞的鉴定13-18 1 材料与方法13-15 1.1 主要试剂与仪器13-14 1.2 方法14-15 2 结果15-16 2.1 流式细胞仪分析结果15 2.2 成骨分化诱导后细胞形态15-16 3 讨论16-18第3章结论与展望18-19致谢19-20参考文献20-22附图22-24攻读学位期间的研究成果24-25综述25-34参考文献32-34。
人牙周膜干细胞的分离培养及生物学特性研究目的：分离筛选人牙周膜干细胞，研究其生物学特性并进行初步鉴定。
方法：采用STRO-1为标记物以免疫磁珠分离筛选人牙周膜干细胞，观察细胞生长及克隆形成情况，流式细胞仪细胞周期、细胞表型分析，免疫细胞化学染色技术检测STRO-1、Vimentin表达，并测定细胞体外多向分化能力。
结果：免疫磁珠法可获得人牙周膜干细胞，细胞具有克隆形成能力，增殖速度低。
细胞周期分析大多数细胞处于G0/G1期,为慢周期性;细胞表型分析证实CD146、CD44高表达，CD34、CD45低表达。
STRO-1及Vimentin均为阳性染色，矿化诱导和成脂诱导证实该细胞具有多向分化能力。
结论：免疫磁珠法是有效的分离纯化牙周膜干细胞的方法。
所分离细胞具有干细胞的细胞周期、表型特点及多向分化能力。
Abstract:ObjectiveTo isolate and identify the periodontal ligament stem cells and demonstrate its bionomics. MethodsPDLSCs were isolated by immunomagnetic method. The flow cytometry and immunocytochemistry procedure were used to disclose the cell cycle and surface marker of the PDLSCs.Osteoinduction and adipoinduction were done to conform the multidirectional differentiation of PDLSCs. ResultsThe acquired cells had clonality and low proliferation. Most of the cells were in phase G0 /G1 and there were high expression of CD146 and CD44 on these cells, meanwhile, CD34 and CD45 were of low expression. The cells were Vimentin and STRO-1 positive while their multidirectional differentiation ability was confirmed in vitro. Conclusionimmunomagnetic method was an effective way to isolate and purify the PDLSCs. The acquired cells showed the characteristics of stem cells.Key words:stem cell;human periodontal ligament stem cell;immunomagnetic beads;flow cytometry;immunocytochemistry研究证实牙周膜内存在具有横向分化能力的干细胞(牙周膜干细胞)，在体外微环境作用下还可分化为成牙骨质细胞或成骨细胞[1-2]。
人的炎症牙周膜干细胞和牙周膜干细胞的体外分离、培养与鉴定目的体外分离培养人的炎症牙周膜干细胞和正常的牙周膜干细胞，并从形态学和表面分子表达率比较两种细胞的差别，为体外分离、培养炎症牙周膜干细胞提供理论依据。
方法体外酶消化组织块法培养牙周炎患者的炎症牙周膜干细胞（iPDLSCs）和正常的人的牙周膜干细胞（PDLSCs），体式显微镜下观察细胞表面形态，流式细胞仪检测表型分子CD90、CD29、CD105、CD31、CD45、STRO-1进行干细胞鉴定。
标签：牙周膜干细胞；炎症牙周炎导致牙周支持组织破坏，是成人失牙的主要原因[1]。
牙周治疗的主要目的是控制牙周组织炎症，维护牙周组织健康，并使包括牙槽骨、牙骨质、牙周膜、牙龈在内的牙周组织达到形态和功能上的再生与重建，这也是牙周病治疗的终极目标[2-4]。
近年发展起来的组织工程技术为牙周组织再生治疗开辟了新途径，种子细胞、信号分子和支架是牙周组织工程技术的三大要素，因此合理选择种子细胞是牙周组织工程技术获得成功的关键[5-6]，目前已确认可用于牙周组织工程技术的种子细胞有胚胎干细胞、骨髓间充质干细胞、脂肪干细胞和牙周膜干细胞等[7-9]，其来源多为健康的人体组织，通常存在取材有创、来源有限等弊端，在一定程度上限制了临床治疗的可行性。
许多研究表明在牙周炎时期也存在着组织的再生，而组织的再生离不开干细胞的迁移，只有适当类型的干细胞附着于根面，增殖并分化为功能性附着结构（牙骨质-牙周膜-牙槽骨）的各种细胞组分，配合适宜的刺激因子和基质成分，才可能形成再生组织，否则可能仅产生修复[10]。
Lin 等[11]对3名重度牙周炎（Ⅲ度根分叉病变）患者需要拔除的患牙行GTR 手术，术后6周，切取其中2名患者患牙周围的再生组织，进行免疫组化检测，发现了STRO-1、CD146 和CD44 阳性的细胞，同时拔除余下1名患者的患牙，取其再生组织进行细胞体外培养并传代，用流式细胞仪分析得到STRO-1、CD146 和CD44 阳性的细胞百分比分别为78.3%、94.9%和100%，所得细胞经矿化和成脂诱导4周后可分别形成矿化结节及脂滴，但其分化能力低于PDLSCs 和BMSCs。
该实验证明了牙周炎症再生组织中应该存在具有干细胞特性的细胞。
Chen 等[6]将临床上因重度牙周炎而拔除的患牙制成组织切片，使用免疫组化染色观察发现，在牙周炎患牙的牙周组织中，STRO-1、CD146 和CD44 阳性细胞分布情况与健康牙周组织近似，而牙周膜干细胞表面的阳性标记物是STRO-1、CD146、CD90、CD29、CD105、阴性标记物是CD31 CD45，所以本实验利用STRO-1、CD146、CD90、CD29、CD105、和CD31 CD45对牙周膜干细胞和炎症牙周膜干细胞（i-PDLSCs）进行鉴定。
1 材料和方法1.1 主要试剂1.2 主要器械：眼科剪、眼科镊、刀柄、11 号刀片、平底培养皿、25cm2培养瓶、10ml离心管、平底 6 孔板（Corning，美国）、金属滤器。
1.3 主要实验仪器1.4 实验方法1.4.1 原代细胞的培养：1）炎症牙周膜干细胞的培养（iPDLSCs）：取材：选取临床上年龄在30-45 岁之间的慢性牙周炎患者，收集其因重度牙周炎需要拔除的患牙，患牙无牙根吸收、根尖周炎和根尖囊肿等牙髓和根尖周疾病，刮取其炎症牙周膜组织；漂洗组织：将获得组织用8 万U 庆大霉素浸泡3-5min，用PBS 反复漂洗 3 遍，将其剪成约2mm×2mm×2mm 大小的组织块；消化与接种：把漂洗后的组织块收集到離心管中，然后加入1-2ml胶原酶，置于含有5% CO2、37℃二氧化碳培养箱中消化，每15min 摇动离心管一次，40min后拿出，然后吹打均匀，以800rpm 离心6min，弃去上清液，加入2ml培养液（含10%胎牛血清、200U/ml 庆大霉素和100U/ml 青霉素的α-MEM，下同）再次吹打均匀，接种于6孔板中，置于二氧化碳培养箱中培养（5% CO2，37℃），每3d换液一次。
2）健康牙周膜干细胞的培养（PDLSCs）：取材：选取临床上年龄在20-35 岁之间的非牙周炎患者，收集其因正畸需要所拔牙齿或拔除的无炎症的阻生第三磨牙，刮取其根中部1/3 牙周膜；消化与接种：将获得组织用PBS 漂洗3 遍，余步骤同上。
1.4.2 细胞的纯化：本次试验使用有限稀释法对iPDLSCs和PDLSCs进行纯化，显微镜下观察原代细胞铺满6孔板底达80%汇合时，弃去原培养液，用PBS 冲洗2遍，然后加入胰蛋白酶2ml消化2-3min，镜下见细胞团漂浮在液体之上时加入等量的培养液终止消化，反复吹打数次后将细胞悬液转移到离心管中，以800rpm 离心6min，弃上清，加入适量培养液进行倍比稀释，调整细胞密度至10-20个/ml，以1-2 个/孔的密度接种于96孔板，每孔加入培养液100μl，次日挑选出单个细胞孔，将培养液加至200μl继续培养，每3d 换液1次，待细胞长满孔底1/3-1/2时消化并接种培养瓶，常规培养传代。
1.5 流式细胞仪表面分子鉴定：取筛选培养的人牙周膜干细胞和炎症牙周膜干细胞，弃原培养液，PBS冲洗两遍，用胰蛋白酶2ml消化1min，α-MEN中和消化，1000r/min离心6min，弃上清，用含30%胎牛血清的PBS缓冲液将牙周膜细胞制成单细胞悬液，调整细胞密度4.0x105/L，每个Eppendof管加400ul的细胞悬液，室温下分别避光加入CD45-PE、CD31-PE、CD90-PE、STRO-1-FITC、CD29-FITC、CD105-PE小鼠抗人单克隆抗体2ul，4℃冰箱避光孵育2h，用含30%胎牛血清PBS缓冲液清洗细胞两到三遍，1000r/min离心5min，将细胞重悬于含30%胎牛血清PBS中，使用同型对照单克隆抗体确定背景标记，用流式细胞仪分析荧光细胞，专用配套软件计算细胞表面抗原阳性率，单位用%表示。
2 结果2.1 原代细胞生长情况：使用酶消化组织块法原代培养iPDLSCs 和PDLSCs，接种3-7d后可以看到有细胞从组织块周围爬出，在远离组织块的地方也有数个细胞爬出，大部分细胞大小均一，为成纤维细胞样，呈长梭形，少数细胞体积较小，呈多角形或椭圆形，胞浆丰满，两种细胞形态无明显差异，PDLSCs 接种2w 左右达80%汇合，iPDLSCs 接种3w 左右达80%汇合。
（图1、2）2.2 细胞纯化情况：炎症牙周膜干细胞接种96孔板后25d左右，约20%的单细胞孔细胞形成克隆并增殖铺满孔底1/3-1/2，细胞排列密度大，细胞体积略小，呈梭形，9d左右可传代一次。
健康牙周膜干细胞接种96孔板后15d左右，约30%的单细胞孔细胞形成克隆并增殖铺满孔底1/3-1/2，细胞形态与炎症牙周膜干细胞无明显差异，7d左右可传代一次。
2.3 流式细胞仪表面分子鉴定：分离得到的PDLSCs和iPDLSCs具有干细胞的分子表型和较高的纯度（图3），即均表达间充质干细胞分子阳性（STRO-1、CD29、CD105、CD90），（CD31、CD45）为阴性，其中PDLSCs表面分子CD105的阳性表达率为26.6%（图A-1）、CD29的阳性表达率为96.1%（图A-2）、STRO-1的阳性表达率为5.4%（图A-3）、CD90的阳性表达率为85.2%（图A-4），iPDLSCs 表面分子CD105的阳性表达率为50.2%（图B-1）、CD29的阳性表达率为95.3%（图B-2）、STRO-1的阳性表达率为7.0%（图B-3）、CD90的阳性表达率为85.8%（图B-4）3 讨论牙周膜干细胞（periodontal ligament stem cell，PDLSC）是来源于牙周膜的成体干细胞，具有自我更新能力，能够被诱导形成多种组织细胞，能够维持牙周膜功能的稳定，发挥生理性细胞更新和修复组织损伤的作用[12-13]。
近年来许多学者利用PDLSC体外培养模型，在牙周组织疾病的发病机制及治疗研究等方面取得了一定进展，如何获取大量的人牙周膜干细胞，是建立体外研究模型的关键之一。
目前牙周膜细胞的分离培养主要有酶消化法和组织块法，其中组织块法被广泛采用，但是它的培养成功率较低，近年来有些研究表明利用酶消化组织块法来培养牙周膜干细胞，可以提高原代细胞培养的成功率[14]，采用该法我们成功培养出人炎症牙周膜干细胞的原代，原代培养成功率达到了50%。
为了获得更多的干细胞，我们采用传统方法对原代炎症牙周膜干细胞和健康牙周膜干细胞进行了纯化，即对炎症牙周膜干细胞和健康牙周膜干细胞进行有限稀释法，挑选单细胞克隆，继而扩大培养，克隆化生长的能力至少满足了干细胞应具有克隆形成能力这一条件，为我们的鉴定工作奠定了一定的基础，同时我们采用流式细胞技术来鉴定炎症牙周膜干细胞和健康牙周膜干细胞的表面分子，结果表明STRO-1、CD29、CD105、CD90为阳性表达，CD31、CD45为阴性表达，并且两种细胞的表面分子表达率并没有明显的不同。
4 结论用酶消化组织块培养牙周膜干细胞，能提高牙周膜干细胞的培养成功率；炎症牙周膜干细胞和健康牙周膜干细胞的细胞形态基本相同；流式细胞仪鉴定结果表明本实验培养、分离的PDLSCs和iPDLSCs具有干细胞的特性，并且两种细胞的表面分子表达率并没有明显的不同。
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