DNA重组-载体构建常见问题及解决方法

载体酶切不完全同源重组空载1. 概述随着生物技术的发展，基因工程领域的研究日益深入。

在基因工程中，载体酶切和同源重组是常用的技术手段。

然而，有时候在实验进行过程中，会出现载体酶切不完全导致同源重组空载的情况。

这种情况不仅影响了实验结果的准确性，还给科研工作者带来了困扰。

研究载体酶切不完全和同源重组空载的原因以及解决方法对于基因工程领域具有重要意义。

2. 载体酶切不完全的原因（1）酶活性差：一些酶在实验条件下的活性可能会受到影响，导致酶切不完全；（2）酶切位点异质性：某些酶切位点的序列可能存在变异，导致酶切不完全；（3）DNA结构：DNA序列的结构也会影响酶切的效果，一些复杂的DNA结构可能会导致酶切不完全。

3. 同源重组空载的原因（1）载体酶切不完全导致的同源重组空载；（2）实验条件的影响：如温度、pH值等因素可能会影响同源重组的效果；（3）DNA序列的特殊性：一些DNA序列的特殊性可能会导致同源重组空载。

4. 解决载体酶切不完全和同源重组空载的方法（1）优化酶切条件：调整实验条件，如酶的活性、PH值、温度等，以提高酶切的效率；（2）使用多种酶联合酶切：有时候使用多种酶联合酶切可能会提高酶切的效率；（3）DNA序列修饰：对DNA序列进行修饰，如合成修改碱基序列，以改善酶切效果；（4）优化同源重组条件：调整同源重组的条件，如温度、时间等，以提高同源重组的效率。

5. 结语载体酶切不完全和同源重组空载是基因工程领域中常见的问题，解决这些问题对于研究工作者来说具有重要意义。

通过分析载体酶切不完全和同源重组空载的原因，以及采取相应的解决方法，可以有效提高基因工程实验的成功率，促进基因工程领域的发展。

希望今后能有更多的研究能够深入探讨这些问题，为基因工程技术的进步做出贡献。

载体酶切不完全和同源重组空载是基因工程领域中常见的问题，而针对这些问题的解决方法也是多种多样的。

以下我们将进一步探讨这些问题的解决方案，并提出一些新的观点来应对这些挑战。

重组载体构建的方法和步骤全文共四篇示例，供读者参考第一篇示例：重组载体构建是基因工程领域中非常重要的一项技术，它可以用来将特定的基因插入到目标细胞中，实现基因的转移和表达。

在科学研究、医学诊断和治疗等领域中都有广泛的应用。

下面我们来详细介绍一下重组载体构建的方法和步骤。

一、选择载体首先我们需要选择一个适合的载体作为基础，常见的载体有质粒、病毒、原核生物等。

在选择载体时需要考虑载体的大小和特性，以及目标基因的大小和需要表达的水平。

同时还需要考虑载体的复制原点、抗生素抗性基因等相关元件。

二、线性化载体接下来我们需要将选择的载体进行线性化处理，以便将目标基因插入到载体中。

线性化可以通过受控的限制酶酶切处理来实现，将载体的环状DNA骨架切割成线性DNA片段。

三、插入目标基因将目标基因与线性化的载体进行连接。

目前常用的方法包括：内切酶切割连接法、PCR扩增连接法、接头连接法等。

这些方法可以有效地将目标基因插入到载体中，并确保插入的正确性和稳定性。

四、转化目标宿主将构建好的重组载体导入到目标宿主细胞中，使其稳定地存在和复制。

转化的方法多样，包括热激转化、电穿孔转化、化学法转化等。

转化效率和载体稳定性是评价转化效果的主要因素。

五、筛选重组子对转化后的细胞进行筛选，筛选出含有目标基因的重组子。

常用的筛选方法包括抗生素筛选、荧光筛选、酵素检测等。

筛选过程中需要注意筛选压力和筛选条件的优化，以提高筛选效率。

六、鉴定重组子对筛选出的重组子进行鉴定，确保其构建正确。

常用的鉴定方法包括PCR扩增、酶切鉴定、序列分析等。

通过这些方法可以验证重组子的结构和功能是否正确，确保后续实验的准确性和可靠性。

七、表达目标基因对鉴定合格的重组子进行表达。

通过选用适当的启动子和调控元件，可以实现目标基因的高效表达。

表达的方法有多种选择，包括转染法、感染法、转基因法等。

表达的效果可以通过荧光显微镜观察、酶活性测定、Western blot等方法进行检测和验证。

DNA测序常见问题分析及解决办法总结PCR类型测序模板注意事项PCR类型测序模板注意事项•总反应体积建议为50uL或100uL，扩增结束后取3ul用1%左右的琼脂糖电泳检测，应为单一的条带。

3ul样品总量不低于50ng(非常小的PCR产物可以酌情减小)，PCR产物产量过低说明PCR扩增结果不是很理想，应改进条件重新扩增。

•对于有杂带和扩增弥散的PCR产物，需经琼脂糖电泳将目的片段切下来并回收，建议将PCR 产物作克隆后进行测序。

有杂带的和扩增弥散的PCR产物即使通过琼脂糖电泳纯化，测序仍有可能出现双峰等异常结果。

•经上述检测合格的PCR产物，需经过琼脂糖电泳纯化去除未反应的引物，dNTP，引物二聚体等影响测序反应的组分。

有多种纯化方法可供选择，Promega，Qiagen和生工等公司都有相应的产品可供选择。

纯化后的PCR产物经电泳检测估计总量应不低于200ng/Kb(非常小的PCR产物可以酌情减小)。

•与质粒模板相比，PCR产物彼此间差异很大，因此，每个PCR模板应尽可能提供相应的PCR 退火温度和PCR产物的长度，以供测序时参考。

•PCR模板一般不应短于200bp，过短的PCR产物应经克隆后进行测序。

•纯化好的PCR产物应溶于双蒸水中，TE缓冲液会严重影响测序反应。

•若让公司对PCR产物进行纯化，PCR产物需满足∶总量不低于1ug/kb，片段长度不低于200bp •各种PCR测序模板均应提供相应的测序引物，并尽可能提供引物的全序列，并将引物浓度准确稀释到5pmole/ul 。

引物浓度的换算关系∶总ng数 = pmole x 分子量/1000由于PCR产物测序相对较难，为使您能拿到一个好的结果，请尽量满足上述要求。

DNA测序常见问题分析及解决办法总结测序常见问题分析序列中出现N值的常见原因：通常有以下几种情况将造成测序结果中N值较多：•PCR产物直接进行测序，在PCR产物长度以后将无反应信号，机器将产生许多N值。

DNA重组常见问题TaKaRa的内切酶和NEB的内切酶哪个更好一些？参考见解： TaKaRa的内切酶、NEB的内切酶两个公司的酶的品质都非常好。

NEB公司的酶的活性很高，切出两条小带可能是因为出现星活性，可以试试把酶量减半。

NEB的酶很多都是克隆的，所以纯度比较高。

应用磁性微球提取人全血基因组DNA，将提取出的DNA直接用于限制性酶切反应，应用Taq1酶，但发现酶切后产生的是smier片断，即切碎的状态。

不知原因是什么？在做这类实验时，一般是将PCR产物进行酶切，这与实验结果有联系吗？是不是直接提取出的DNA必须要做PCR扩增，才能应用酶切？参考见解：1. 为建立基因组文库时一般才用限制性内切酶酶切人基因组DNA.目的是为获得含有人全部DNA的随机片段的总和.然后再用载体和宿主细胞构建克隆.关于文库建立园内资料很多.lyz703lyz战友感兴趣的话可以自己搜索下.2. 电泳图,酶切后是一片弥散的带,是因为基因组中存在大量Taq1酶的酶切位点,由于操作属于随机酶切,所以得到的DNA也是随机的,而不是大量均一的.那么电泳后的出现这样的结果也很容易解释.3. 一般在PCR后采用酶切是由于酶切模板数目巨大且均一,在了解了被切DNA上有关限制性内切酶位点的信息后,我们就可以根据自己的目的来选择合适的内切酶进行酶切.做抑制差减杂交,需要回收细菌基因组酶切(Alu1酶)后的全部片段,要求回收后至少是6微升,浓度要有0.3微克\微升,按照抑制差减杂交说明书,采用酚仿抽提和无水乙醇沉淀法,只要酶切2微克基因组就能满足条件,可已经把酶切量扩大到10多微克了,回收还是达不到浓度(大约只有0.06微克\微升),又不敢切胶回收,怕EB对后续反应造成影响。

请教该怎么办？参考见解：回收酶切产物浓度低的原因可能是：苯酚/氯仿抽提时损失太多。

说明书上说苯酚/氯仿/异戊醇和氯仿各抽提两次，这样经过四次抽提DNA损失得非常多，解决办法是将50?l酶切产物加等体积的灭菌去离子水，然后再抽提，损失会减少很多；另外乙醇沉淀时可以延长，低温沉淀会提高得率；还有用80％乙醇洗涤沉淀弃上清时，要轻轻用移液枪吸出，防止将沉淀随上清倒出。

重组质粒构建注意事项重组质粒构建是现代生物学中常用的技术手段，其能够利用DNA重组技术将感兴趣的基因片段插入到质粒中，从而探究基因的功能、调控及其在生物体中的作用。

下面是重组质粒构建中需要注意的一些关键问题。

1.选择合适的质粒载体：质粒是一种能够自主复制的小型DNA分子，其可以含有多个对基因表达有重要影响的元件，如启动子、终止子、选择性标记基因等。

因此，选择合适的质粒载体对于重组质粒构建至关重要。

一般而言，常用的质粒载体有pUC19、pBR322、pBluescript等，根据实验需要选择适合的质粒载体。

2.选择合适的限制性内切酶：限制性内切酶是能够识别特定的DNA序列并具有切割作用的酶。

在重组质粒构建中，常需要利用限制性内切酶切割质粒载体和目标基因片段的DNA，从而产生互补的粘性末端，便于二者连接。

因此，选择适合的限制性内切酶对于重组质粒的构建是非常重要的。

3.设计合适的引物：引物是在PCR扩增反应中用于识别目标DNA序列的短小DNA片段。

在重组质粒构建中，利用引物扩增目标基因片段是必不可少的步骤。

因此，设计合适的引物非常重要。

引物应具有良好的特异性，能够特异性地扩增目标基因片段，并且不会与质粒载体序列发生非特异性扩增。

此外，引物还可以设计一些限制性内切酶切割位点，以便于后续的连接工作。

4.进行寡核苷酸连接反应：连接反应是指将质粒载体和目标基因片段进行连接的步骤。

常用的方法有T4 DNA连接酶的连接反应和PCR引物连接法。

在连接反应中，需要注意合适的反应条件，例如连接反应的时间、反应体系的pH值、温度等，对连接效果有重要影响。

5.转化宿主细胞：转化是指将重组质粒导入宿主细胞中。

在进行转化实验时，需要注意选择合适的宿主细胞，例如大肠杆菌（E. coli）等，以及适当的培养基、适宜的温度和容器。

此外，还需要注意进行适当的筛选压力，如在含有选择性抗生素的培养基中进行培养，筛选能够稳定带有重组质粒的转化子。

D NA提取和常见问题分析及对策主讲人：**DNA简单介绍DNA是遗传信息的载体，是最重要的生物信息分子，是分子生物学研究的主要对象。

为了进行测序、杂交和基因的表达，获得高分子量和高纯度的DNA是非常重要的前提。

D N A提取原则保证DNA结构的完整性纯化后不应存在对酶有抑制作用的物质 排除有机溶剂和金属离子的污染蛋白质、多糖、酚类等降低到最低程度排除其他核酸分子的污染D N A提取的几种方法一、染色体DNA的提取CTAB法SDS法其它D N A提取的几种方法二、非染色体DNA的提取质粒DNA的提取•碱裂解法•煮沸法线粒体、叶绿体DNA的提取•差速离心结合SDS裂解法CTAB法原理（植物DNA提取经典方法）CTAB（hexadecyltrimethylammonium bromide，十六烷基三甲基溴化铵），是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合物。

该复合物在高盐溶液中（>0.7mol/L NaCl）是可溶的，通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇或异丙醇沉淀即可使核酸分离出来。

注：CTAB溶液在低于15℃时会形成沉淀析出，因此在将其加入冰冷的植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于15℃。

CTAB法流程图植物材料裂解液异丙醇沉淀液氮研磨抽提离心洗涤DNA溶液细胞裂解上层溶液干燥溶解CTAB中各个组分的作用CTAB提取缓冲液的经典配方Tris-HCl （pH8.0）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏； EDTA螯合Mg2+离子或Mn2+离子，抑制DNase活性；NaCl 提供一个高盐环境，使DNP充分溶解，存在于液相中；CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离；β-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除。

CTAB提取缓冲液的改进配方PVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。

载体构建经验谈二做酶切要注意的问题重组质粒构建是常用的分子生物学手段，其实只是最基本的方法，一般一个星期同时构建三二个组质粒是没有问题的。

但是其中还是有些基本的技巧需要掌握。

在这里将我的心得分享于大家，这也是我本人几年来一线工作时的经验积累，以期能让大家在实验中少走弯路。

所涉及内容如下：1) 克隆基因的酶切位点问题2) 载体酶切的问题3) 连接片段浓度比的问题在阐明上述问题同时，本人尽可能举些实验中的问题案例予以说明。

一、克隆基因的酶切位点问题1、克隆位点选择的问题。

首先要对目标基因进行酶切位点扫描分析，列出其所含酶切位点清单。

然后对照质粒多克隆位点，所选择的克隆位点必须是目标基因所不含的酶切位点。

这是常识，不赘述。

2、保护碱基数目的问题。

在设计PCR引物时，引入酶切位点后，常常要加入保护碱基，这是大家所熟知的。

但是保护碱基数量多少，可能被新手所忽视。

这种忽视碰可能会大大影响后续的实验进展。

一般情况下，普通的内切酶只加入两个保护碱基，其内切反应就可以正常进行；而有一类，仅仅只加入两个保护碱基，其内切反应就不能正常进行，这是因为内切酶不能正常结合DN段上。

如NdeI就属这类，需要加入至少6个保护碱基，常用的HindIII也要三个。

下面是我提供这类酶的列表及其所需最少的保护碱基数，相信下列将有助于大这家的实验设计。

NcoI 4NdeI 6NheI 3NotI 8PmeI 6SacI 3SalI 3SmaI 3HindIII 3BstI 8SphI 4XhoI 3XbaI 3SmaI 4案例分析一：本人最初曾选用NdeI克隆位点，未注意到保护碱基数目的问题，设计PCR引物时，引入NdeI酶切位点后，只加上两个保护碱基，一个月内没有进展，始终不能成功构建重组载体。

后查文献得知症结所在，在NdeI序列后加上六个保护碱基后，迎刃而解。

大家引以为戒啊。

现在普通酶我都引入三个保护碱基。

现在碱基合成价格也不贵了，为保证酶切充分，连接顺利，不用节约那点钱，再说若一次不成功，重复实验花费时间与金钱更多，孰利孰弊，不言自明。