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分子实验中核算DNA提取常见问题及分析一、基因组DNA提取常见问题分析1．样品材料老化或反复冻融导致DNA含量下降：应选择新鲜的材料样品，如新鲜血液、新鲜菌液、刚离体的动物组织或细嫩的植物组织等，不能即时处理的样品应立即放入液氮或-70C低温保存，以免DNA 降解。
2．样品破壁或裂解不完全，DNA未充分释放：动、植物材料应在液氮中充分研磨匀浆，G +细菌、酵母等破壁较困难的样品应用溶菌酶、Lyticase酶或机械方式协助破壁。
3．样品量过多导致细胞裂解不充分：加样量过多使裂解液和样品混合不均匀，细胞裂解不充分。
不同来源样品的加样量不同。
4．DNA吸附不充分：如在上吸附柱前未加无水乙醇，或用低浓度乙醇代替无水乙醇，则导致DNA 不能充分沉淀，与硅胶膜吸附不彻底，因此应在样品裂解后加适量无水乙醇，再上吸附柱使DNA与硅胶膜充分吸附。
5．DNA洗脱不适当：洗脱缓冲液pH值过低会阻碍DNA从硅胶膜上洗脱下来，应确保洗脱液pH 值在7.0-8.5之间。
洗脱体积过少，若小于30ul,不易完全浸透硅胶膜，使DNA不能全部洗脱下来，因此洗脱缓冲液应大于30ul。
同时如洗脱体积过大，超过200ul,则所得的DNA浓度会降低，但DNA总量不会减少。
洗脱时可将洗脱缓冲液在65-70℃水浴预热，加入洗脱液后在室温静置2-5分钟，可提高洗脱效率,加大DNA产量。
二、提取的基因组DNA有降解，如何解决?1．选取的材料不新鲜或反复冻融，采集材料后未及时处理或未低温保存：陈旧血液，老化菌液等不新鲜的材料中，细胞凋亡导致DNA降解，或低温保存的样品反复冻融导致细胞破裂，内源核酸酶降解DNA，因此应选择新鲜的材料样品，不能及时处理则低温保存，运输过程中亦应使用干冰。
2．未能有效抑制内源核酸酶作用：某些DNase含量较丰富的动、植物组织样品应在液氮中研磨或匀浆，研磨过程中应随时补充液氮，并在样品未完全解冻前即加入含有抑制核酸酶作用的鳌合剂的裂解液。
高产高效DNA提取手段常见问题原因诊断策略定位法DNA提取是分子生物学研究中常用的重要实验步骤，其目的是从细胞或组织样本中提取出高质量的DNA。
然而，在DNA提取的过程中，常常会遇到一些问题导致低产或低效的情况。
本文将针对高产高效DNA提取手段常见问题进行原因诊断和策略定位，帮助科研人员解决相关的实验难题。
1. 低DNA产量的问题：低DNA产量可能是由以下几个方面的原因导致的：1.1 样本因素：- 细胞或组织样本中DNA含量本身较低；- 样本存储不当，导致DNA降解；- 样本含有DNA酶或其他污染物。
1.2 提取步骤因素：- 细胞或组织裂解效果不理想；- DNA粘附在某些物质上无法充分溶解；- 溶解缓冲液中的离子浓度或pH值不适宜；- DNA提取试剂的质量不过关。
针对低DNA产量的原因，可以采取以下策略定位和改进措施：- 重新评估样本的储存条件和处理方式，确保样本质量良好；- 优化细胞或组织的裂解过程，可尝试使用化学物质、酶或高温等方法增强裂解效果；- 使用高纯度的蛋白酶K等去除DNA酶或其他污染物；- 确保溶解缓冲液具有合适的离子浓度和pH值，可根据实际情况进行调整；- 选择质量可靠的DNA提取试剂盒，确保试剂的活性和纯度。
2. 低DNA提取效率的问题：低DNA提取效率可能是由以下几个方面的原因导致的：2.1 样本因素：- 样本中DNA含量较低；- 样本中存在DNA降解酶。
2.2 提取步骤因素：- DNA在某些步骤中流失或粘附在器具壁上；- 某些试剂的浓度不适宜。
为了提高DNA提取效率，可以采取以下策略定位和改进措施：- 使用高质量的样本，确保样本中已有DNA的充足量；- 添加DNase酶抑制剂或其他方法抑制DNA降解酶的活性；- 定期更换或清洗使用的器具，防止DNA的流失或粘附；- 审查并校正提取试剂的浓度，确保试剂与样本反应的适宜性。
3. 其他常见问题与策略定位：除了低产量和低效率的问题外，还有其他常见的DNA提取相关实验问题，例如：3.1 DNA质量下降：- 样本的存储时间过长，导致DNA降解；- 提取试剂的质量不过关。
分子实验中核算DNA提取常见问题及分析一、基因组DNA提取常见问题分析1．样品材料老化或反复冻融导致DNA含量下降：应选择新鲜的材料样品，如新鲜血液、新鲜菌液、刚离体的动物组织或细嫩的植物组织等，不能即时处理的样品应立即放入液氮或-70C低温保存，以免DNA 降解。
2．样品破壁或裂解不完全，DNA未充分释放：动、植物材料应在液氮中充分研磨匀浆，G +细菌、酵母等破壁较困难的样品应用溶菌酶、Lyticase酶或机械方式协助破壁。
3．样品量过多导致细胞裂解不充分：加样量过多使裂解液和样品混合不均匀，细胞裂解不充分。
不同来源样品的加样量不同。
4．DNA吸附不充分：如在上吸附柱前未加无水乙醇，或用低浓度乙醇代替无水乙醇，则导致DNA 不能充分沉淀，与硅胶膜吸附不彻底，因此应在样品裂解后加适量无水乙醇，再上吸附柱使DNA与硅胶膜充分吸附。
5．DNA洗脱不适当：洗脱缓冲液pH值过低会阻碍DNA从硅胶膜上洗脱下来，应确保洗脱液pH 值在7.0-8.5之间。
洗脱体积过少，若小于30ul,不易完全浸透硅胶膜，使DNA不能全部洗脱下来，因此洗脱缓冲液应大于30ul。
同时如洗脱体积过大，超过200ul,则所得的DNA浓度会降低，但DNA总量不会减少。
洗脱时可将洗脱缓冲液在65-70℃水浴预热，加入洗脱液后在室温静置2-5分钟，可提高洗脱效率,加大DNA产量。
二、提取的基因组DNA有降解，如何解决?1．选取的材料不新鲜或反复冻融，采集材料后未及时处理或未低温保存：陈旧血液，老化菌液等不新鲜的材料中，细胞凋亡导致DNA降解，或低温保存的样品反复冻融导致细胞破裂，内源核酸酶降解DNA，因此应选择新鲜的材料样品，不能及时处理则低温保存，运输过程中亦应使用干冰。
2．未能有效抑制内源核酸酶作用：某些DNase含量较丰富的动、植物组织样品应在液氮中研磨或匀浆，研磨过程中应随时补充液氮，并在样品未完全解冻前即加入含有抑制核酸酶作用的鳌合剂的裂解液。
质粒DNA提取实验常见问题解答1.加入solution.III，经10分钟离心后细菌沉淀怎么不结实，有的漂浮在液面，有的贴在离心管壁上，一摇晃即破碎脱落下来？细菌的用量太少，导致产生的沉淀主要是盐分的沉淀，因为缺少变性的细菌蛋白和细菌基因组DNA 的缠绕，沉淀就显得不结实。
解决方法：将细菌的用量增加。
2.加入soln.III，经10分钟离心后细菌沉淀怎么不结实，呈大块的水泡状，上清较少？（1）使用了过多的细菌，导致菌体未被有效裂解。
解决方法：将细菌用量减半。
（2）细菌悬浮不充分,存留小菌块,导致菌体未被有效裂解。
解决方法：注意将细菌悬浮充分。
（3）加Solution III后中和不充分。
解决方法：如果细菌用量较多，请注意多翻转几次直至中和后的沉淀呈松散的豆腐花状(也可以稍用力混合直至沉淀呈松散的豆腐花状)。
（4）Solution II出现沉淀。
解决方法：如果实验室内温度低于15℃，使用试剂盒前请注意观察Solution II中是否出现沉淀。
如果出现沉淀，请于37℃水浴溶解沉淀后再使用。
（5）Solution II 长时间暴露于空气中被CO2中和，导致菌体未能被有效裂解。
解决方法：可用经典碱裂解法抽提质粒DNA方法中的II液替代Solution II使用。
3.出现严重的RNA污染？（1）未在Solution I中事先加入RNase A1。
解决方法：补加RNase A1。
（2）加入RNase A1的Solution I长期保存于室温，导致RNase A1活性下降。
（3）细菌过量,RNase A1不能有效降解RNA。
解决方法：将细菌用量减半或增加RNase A1在Solution I中的浓度。
4.抽提的质粒DNA电泳时怎么出现切口.断裂或降解现象？（1）使用的是收集后冷冻保藏的细菌。
解决方法：使用新鲜培养的细菌。
（2）宿主菌富含核酸内切酶。
解决方法：增加一步Rinse A洗涤步骤以彻底去除残留的核酸内切酶。
基因组提取常见问题解析一、引言基因组提取是生物实验中的一项基本技术，主要用于获取生物体的DNA或RNA。
在基因组提取过程中，可能会遇到各种问题，这些问题可能会影响提取的效率和纯度，进而影响后续的实验结果。
本文将对基因组提取过程中的常见问题进行解析，旨在帮助实验人员更好地进行实验操作。
二、基因组提取过程中的常见问题1.样本制备问题样本制备是基因组提取的第一步，也是最关键的一步。
在这一步中，实验人员需要将生物样本进行处理，以便后续的提取过程。
然而，样本制备过程中可能会出现一些问题，例如样本量不足、样本被污染、样本中的DNA已经被降解等。
这些问题都可能导致提取失败或者提取的基因组质量不高。
2.DNA提取方法DNA提取方法的选择和使用也是影响基因组提取质量的重要因素。
不同的生物样本需要不同的提取方法，如果选择不当或者使用不当，都可能导致提取失败或者提取的基因组质量不高。
此外，不同的提取方法也有其各自的局限性，例如耗时、耗力、提取的DNA量少等。
3.基因组损失和降解基因组损失和降解是基因组提取过程中最常见的问题之一。
在提取过程中，由于各种原因（如机械力、化学反应、酶活性等），DNA可能会被损失或者降解，这会导致提取的基因组不完整或者质量不高。
此外，DNA损失和降解还可能影响后续的实验结果，例如PCR 扩增、测序等。
4.杂质和污染物在基因组提取过程中，杂质和污染物是不可避免的。
这些杂质和污染物可能来源于生物样本本身、提取溶液、实验室环境等。
这些杂质和污染物可能会影响提取的基因组的质量和纯度，进而影响后续的实验结果。
因此，实验人员需要采取有效的措施去除这些杂质和污染物。
DNA提取常见问题问题一：DNA样品不纯，抑制后续酶解和PCR反应。
1.DNA中含有蛋白、多糖、多酚类杂质2.DNA在溶解前，有酒精残留，酒精抑制后续酶解反应3.DNA中残留有金属离子对策1.重新纯化DNA，去除蛋白、多糖、多酚等杂质（具体方法见前）2.重新沉淀DNA，让酒精充分挥发3.增加70％乙醇洗涤的次数（2-3次）问题二：DNA降解。
1.材料不新鲜或反复冻融2.未很好抑制内源核酸酶的活性3.提取过程操作过于剧烈，DNA被机械打断4.外源核酸酶污染5.反复冻融对策1.尽量取新鲜材料，低温保存材料避免反复冻融2.液氮研磨或匀浆组织后，应在解冻前加入裂解缓冲液3.在提取内源核酸酶含量丰富的材料的DNA时，可增加裂解液中螯合剂的含量4.细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔5.所有试剂用无菌水配制，耗材经高温灭菌6.将DNA分装保存于缓冲液中，避免反复冻融问题三：DNA提取量少。
1.实验材料不佳或量少2.破壁或裂解不充分3.沉淀不完全4.洗涤时DNA丢失对策1.尽量选用新鲜（幼嫩）的材料2.动植物要匀浆研磨充分；G＋菌、酵母裂解前先用生物酶或机械方式破壁3.高温裂解时，时间适当延长（对于动物细胞、细菌可增加PK的用量）4.低温沉淀，延长沉淀时间5.加辅助物，促进沉淀6.洗涤时，最好用枪头将洗涤液吸出，勿倾倒大肠杆菌基因表达系统大肠杆菌——是一种革兰氏阴性细菌，其遗传背景清楚，目标基因表达的水平高，培养周期短。
目前大多数外源基因都是以大肠杆菌为受体系统进行表达的，是目前应用最广泛的基因表达系统。
与其它表达系统相比，大肠杆菌表达系统所具有的优越性：①经过长期研究，人们已经掌握了十分丰富的有关大肠杆菌基础生物学、遗传学以及分子生物学等方面的背景知识，特别是对其基因表达调控的分子机理有了深刻的了解；②大肠杆菌已被发展成为一种安全的基因工程实验体系，拥有各类适用的寄主菌株和不同类型的载体系列；③实验已经证明，许多克隆的真核基因，例如抑制生长素基因和胰岛素基因等，都可以在大肠杆菌细胞中实现有效的、高水平的表达；④大肠杆菌培养方便、操作简单、成本低廉，易于进行工业化批量生产。
DNA提取纯化用到的常见问题集分享】DNA提取纯化用到的常见问题集Q1: 抽提DNA 去除蛋白质时，怎样使用酚与氯仿较好?A1: 酚与氯仿是非极性分子，水是极性分子，当蛋白水溶液与酚或氯仿混合时，蛋白质分子之间的水分子就被酚或氯仿挤去，使蛋白失去水合状态而变性。
经过离心，变性蛋白质的密度比水的密度为大，因而与水相分离，沉淀在水相下面，从而与溶解在水相中的DNA分开。
而酚与氯仿有机溶剂比重更大，保留在最下层。
作为表面变性剂的酚与氯仿，在去除蛋白质的作用中，各有利弊，酚的变性作用大，但酚与水相有一定程度的互溶，大约10%-15%的水溶解在酚相中，因而损失了这部分水相中的DNA ，而氯仿的变性作用不如酚效果好，但氯仿与水不相混溶，不会带走DNA 。
所以在抽提过程中，混合使用酚与氯仿效果最好。
经酚第一次抽提后的水相中有残留的酚，由于酚与氯仿是互溶的，可用氯仿第二次变性蛋白质，此时一起将酚带走。
也可以在第二次抽提时，将酚与氯仿1:1混合使用。
Q2：为什么用酚与氯仿抽提DNA 时，还要加少量的异戊醇?A2：在抽提DNA 时，为了混合均匀，必须剧烈振荡容器数次，这时在混合液内易产生气泡，气泡会阻止相互间的充分作用。
加入异戊醇能降低分子表面张力，所以能减少抽提过程中的泡沫产生。
一般采用氯仿与异戊醇的比例为24:1。
也可采用酚、氯仿与异戊醇之比为251，同时异戊醇有助于分相，使离心后的上层水相，中层变性蛋白相以及下层有机溶剂相维持稳定。
Q3：植物基因组DNA提取时遇到多糖成分的干扰，DNA提取纯化质量一直不高，如何消除多糖的影响？A3：一般来说，SDS法提取的DNA会还有较多的多糖，使DNA 成胶冻状。
而CTAB DNA提取纯化法可基本上除去多糖。
如果是植物材料本身含糖量比较高，可尝试以下方法：1、在DNA未溶出之前，先用一些缓冲液洗去多糖。
可用缓冲液如：100 mmol/L Tris –HCl (pH=8.0)、5 mmol/L EDTA和0.35 mol/L Sorbitol。
D NA提取和常见问题分析及对策主讲人：**DNA简单介绍DNA是遗传信息的载体，是最重要的生物信息分子，是分子生物学研究的主要对象。
为了进行测序、杂交和基因的表达，获得高分子量和高纯度的DNA是非常重要的前提。
D N A提取原则保证DNA结构的完整性纯化后不应存在对酶有抑制作用的物质 排除有机溶剂和金属离子的污染蛋白质、多糖、酚类等降低到最低程度排除其他核酸分子的污染D N A提取的几种方法一、染色体DNA的提取CTAB法SDS法其它D N A提取的几种方法二、非染色体DNA的提取质粒DNA的提取•碱裂解法•煮沸法线粒体、叶绿体DNA的提取•差速离心结合SDS裂解法CTAB法原理（植物DNA提取经典方法）CTAB（hexadecyltrimethylammonium bromide，十六烷基三甲基溴化铵），是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合物。
该复合物在高盐溶液中（>0.7mol/L NaCl）是可溶的，通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇或异丙醇沉淀即可使核酸分离出来。
注：CTAB溶液在低于15℃时会形成沉淀析出，因此在将其加入冰冷的植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于15℃。
CTAB法流程图植物材料裂解液异丙醇沉淀液氮研磨抽提离心洗涤DNA溶液细胞裂解上层溶液干燥溶解CTAB中各个组分的作用CTAB提取缓冲液的经典配方Tris-HCl （pH8.0）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏； EDTA螯合Mg2+离子或Mn2+离子，抑制DNase活性；NaCl 提供一个高盐环境，使DNP充分溶解，存在于液相中；CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离；β-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除。
CTAB提取缓冲液的改进配方PVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。
