DNA提取和常见问题分析及对策

分子实验中核算DNA提取常见问题及分析一、基因组DNA提取常见问题分析1．样品材料老化或反复冻融导致DNA含量下降：应选择新鲜的材料样品，如新鲜血液、新鲜菌液、刚离体的动物组织或细嫩的植物组织等，不能即时处理的样品应立即放入液氮或-70C低温保存，以免DNA 降解。

2．样品破壁或裂解不完全，DNA未充分释放：动、植物材料应在液氮中充分研磨匀浆，G +细菌、酵母等破壁较困难的样品应用溶菌酶、Lyticase酶或机械方式协助破壁。

3．样品量过多导致细胞裂解不充分：加样量过多使裂解液和样品混合不均匀，细胞裂解不充分。

不同来源样品的加样量不同。

4．DNA吸附不充分：如在上吸附柱前未加无水乙醇，或用低浓度乙醇代替无水乙醇，则导致DNA 不能充分沉淀，与硅胶膜吸附不彻底，因此应在样品裂解后加适量无水乙醇，再上吸附柱使DNA与硅胶膜充分吸附。

5．DNA洗脱不适当：洗脱缓冲液pH值过低会阻碍DNA从硅胶膜上洗脱下来，应确保洗脱液pH 值在7.0-8.5之间。

洗脱体积过少，若小于30ul,不易完全浸透硅胶膜，使DNA不能全部洗脱下来，因此洗脱缓冲液应大于30ul。

同时如洗脱体积过大，超过200ul,则所得的DNA浓度会降低，但DNA总量不会减少。

洗脱时可将洗脱缓冲液在65-70℃水浴预热，加入洗脱液后在室温静置2-5分钟，可提高洗脱效率,加大DNA产量。

二、提取的基因组DNA有降解，如何解决?1．选取的材料不新鲜或反复冻融，采集材料后未及时处理或未低温保存：陈旧血液，老化菌液等不新鲜的材料中，细胞凋亡导致DNA降解，或低温保存的样品反复冻融导致细胞破裂，内源核酸酶降解DNA，因此应选择新鲜的材料样品，不能及时处理则低温保存，运输过程中亦应使用干冰。

2．未能有效抑制内源核酸酶作用：某些DNase含量较丰富的动、植物组织样品应在液氮中研磨或匀浆，研磨过程中应随时补充液氮，并在样品未完全解冻前即加入含有抑制核酸酶作用的鳌合剂的裂解液。

DNA提取中常见问题Q1: 抽提DNA 去除蛋白质时，怎样使用酚与氯仿较好?A1: 酚与氯仿是非极性分子，水是极性分子，当蛋白水溶液与酚或氯仿混合时，蛋白质分子之间的水分子就被酚或氯仿挤去，使蛋白失去水合状态而变性。

经过离心，变性蛋白质的密度比水的密度为大，因而与水相分离，沉淀在水相下面，从而与溶解在水相中的DNA分开。

而酚与氯仿有机溶剂比重更大，保留在最下层。

作为表面变性剂的酚与氯仿，在去除蛋白质的作用中，各有利弊，酚的变性作用大，但酚与水相有一定程度的互溶，大约10%-15%的水溶解在酚相中，因而损失了这部分水相中的DNA ，而氯仿的变性作用不如酚效果好，但氯仿与水不相混溶，不会带走DNA 。

所以在抽提过程中，混合使用酚与氯仿效果最好。

经酚第一次抽提后的水相中有残留的酚，由于酚与氯仿是互溶的，可用氯仿第二次变性蛋白质，此时一起将酚带走。

也可以在第二次抽提时，将酚与氯仿1:1混合使用。

Q2：为什么用酚与氯仿抽提DNA 时，还要加少量的异戊醇?A2：在抽提DNA 时，为了混合均匀，必须剧烈振荡容器数次，这时在混合液内易产生气泡，气泡会阻止相互间的充分作用。

加入异戊醇能降低分子表面张力，所以能减少抽提过程中的泡沫产生。

一般采用氯仿与异戊醇的比例为24:1。

也可采用酚、氯仿与异戊醇之比为25:24:1，同时异戊醇有助于分相，使离心后的上层水相，中层变性蛋白相以及下层有机溶剂相维持稳定。

Q3：植物基因组DNA提取时遇到多糖成分的干扰，DNA提取纯化质量一直不高，如何消除多糖的影响？A3：一般来说，SDS法提取的DNA会还有较多的多糖，使DNA成胶冻状。

而CTAB DNA 提取纯化法可基本上除去多糖。

如果是植物材料本身含糖量比较高，可尝试以下方法：1、在DNA未溶出之前，先用一些缓冲液洗去多糖。

可用缓冲液如：100 mmol/L Tris –HCl (pH=8.0)、5 mmol/L EDTA和0.35 mol/L Sorbitol。

高产高效DNA提取手段常见问题原因诊断策略定位法DNA提取是分子生物学研究中常用的重要实验步骤，其目的是从细胞或组织样本中提取出高质量的DNA。

然而，在DNA提取的过程中，常常会遇到一些问题导致低产或低效的情况。

本文将针对高产高效DNA提取手段常见问题进行原因诊断和策略定位，帮助科研人员解决相关的实验难题。

1. 低DNA产量的问题：低DNA产量可能是由以下几个方面的原因导致的：1.1 样本因素：- 细胞或组织样本中DNA含量本身较低；- 样本存储不当，导致DNA降解；- 样本含有DNA酶或其他污染物。

1.2 提取步骤因素：- 细胞或组织裂解效果不理想；- DNA粘附在某些物质上无法充分溶解；- 溶解缓冲液中的离子浓度或pH值不适宜；- DNA提取试剂的质量不过关。

针对低DNA产量的原因，可以采取以下策略定位和改进措施：- 重新评估样本的储存条件和处理方式，确保样本质量良好；- 优化细胞或组织的裂解过程，可尝试使用化学物质、酶或高温等方法增强裂解效果；- 使用高纯度的蛋白酶K等去除DNA酶或其他污染物；- 确保溶解缓冲液具有合适的离子浓度和pH值，可根据实际情况进行调整；- 选择质量可靠的DNA提取试剂盒，确保试剂的活性和纯度。

2. 低DNA提取效率的问题：低DNA提取效率可能是由以下几个方面的原因导致的：2.1 样本因素：- 样本中DNA含量较低；- 样本中存在DNA降解酶。

2.2 提取步骤因素：- DNA在某些步骤中流失或粘附在器具壁上；- 某些试剂的浓度不适宜。

为了提高DNA提取效率，可以采取以下策略定位和改进措施：- 使用高质量的样本，确保样本中已有DNA的充足量；- 添加DNase酶抑制剂或其他方法抑制DNA降解酶的活性；- 定期更换或清洗使用的器具，防止DNA的流失或粘附；- 审查并校正提取试剂的浓度，确保试剂与样本反应的适宜性。

3. 其他常见问题与策略定位：除了低产量和低效率的问题外，还有其他常见的DNA提取相关实验问题，例如：3.1 DNA质量下降：- 样本的存储时间过长，导致DNA降解；- 提取试剂的质量不过关。

分子实验中核算DNA提取常见问题及分析一、基因组DNA提取常见问题分析1．样品材料老化或反复冻融导致DNA含量下降：应选择新鲜的材料样品，如新鲜血液、新鲜菌液、刚离体的动物组织或细嫩的植物组织等，不能即时处理的样品应立即放入液氮或-70C低温保存，以免DNA 降解。

2．样品破壁或裂解不完全，DNA未充分释放：动、植物材料应在液氮中充分研磨匀浆，G +细菌、酵母等破壁较困难的样品应用溶菌酶、Lyticase酶或机械方式协助破壁。

3．样品量过多导致细胞裂解不充分：加样量过多使裂解液和样品混合不均匀，细胞裂解不充分。

不同来源样品的加样量不同。

4．DNA吸附不充分：如在上吸附柱前未加无水乙醇，或用低浓度乙醇代替无水乙醇，则导致DNA 不能充分沉淀，与硅胶膜吸附不彻底，因此应在样品裂解后加适量无水乙醇，再上吸附柱使DNA与硅胶膜充分吸附。

5．DNA洗脱不适当：洗脱缓冲液pH值过低会阻碍DNA从硅胶膜上洗脱下来，应确保洗脱液pH 值在7.0-8.5之间。

洗脱体积过少，若小于30ul,不易完全浸透硅胶膜，使DNA不能全部洗脱下来，因此洗脱缓冲液应大于30ul。

同时如洗脱体积过大，超过200ul,则所得的DNA浓度会降低，但DNA总量不会减少。

洗脱时可将洗脱缓冲液在65-70℃水浴预热，加入洗脱液后在室温静置2-5分钟，可提高洗脱效率,加大DNA产量。

二、提取的基因组DNA有降解，如何解决?1．选取的材料不新鲜或反复冻融，采集材料后未及时处理或未低温保存：陈旧血液，老化菌液等不新鲜的材料中，细胞凋亡导致DNA降解，或低温保存的样品反复冻融导致细胞破裂，内源核酸酶降解DNA，因此应选择新鲜的材料样品，不能及时处理则低温保存，运输过程中亦应使用干冰。

2．未能有效抑制内源核酸酶作用：某些DNase含量较丰富的动、植物组织样品应在液氮中研磨或匀浆，研磨过程中应随时补充液氮，并在样品未完全解冻前即加入含有抑制核酸酶作用的鳌合剂的裂解液。

质粒DNA提取实验常见问题解答1.加入solution.III，经10分钟离心后细菌沉淀怎么不结实，有的漂浮在液面，有的贴在离心管壁上，一摇晃即破碎脱落下来？细菌的用量太少，导致产生的沉淀主要是盐分的沉淀，因为缺少变性的细菌蛋白和细菌基因组DNA 的缠绕，沉淀就显得不结实。

解决方法：将细菌的用量增加。

2.加入soln.III，经10分钟离心后细菌沉淀怎么不结实，呈大块的水泡状，上清较少？（1）使用了过多的细菌，导致菌体未被有效裂解。

解决方法：将细菌用量减半。

（2）细菌悬浮不充分,存留小菌块,导致菌体未被有效裂解。

解决方法：注意将细菌悬浮充分。

（3）加Solution III后中和不充分。

解决方法：如果细菌用量较多，请注意多翻转几次直至中和后的沉淀呈松散的豆腐花状(也可以稍用力混合直至沉淀呈松散的豆腐花状)。

（4）Solution II出现沉淀。

解决方法：如果实验室内温度低于15℃，使用试剂盒前请注意观察Solution II中是否出现沉淀。

如果出现沉淀，请于37℃水浴溶解沉淀后再使用。

（5）Solution II 长时间暴露于空气中被CO2中和，导致菌体未能被有效裂解。

解决方法：可用经典碱裂解法抽提质粒DNA方法中的II液替代Solution II使用。

3.出现严重的RNA污染？（1）未在Solution I中事先加入RNase A1。

解决方法：补加RNase A1。

（2）加入RNase A1的Solution I长期保存于室温，导致RNase A1活性下降。

（3）细菌过量,RNase A1不能有效降解RNA。

解决方法：将细菌用量减半或增加RNase A1在Solution I中的浓度。

4.抽提的质粒DNA电泳时怎么出现切口.断裂或降解现象？（1）使用的是收集后冷冻保藏的细菌。

解决方法：使用新鲜培养的细菌。

（2）宿主菌富含核酸内切酶。

解决方法：增加一步Rinse A洗涤步骤以彻底去除残留的核酸内切酶。

基因组提取常见问题解析一、引言基因组提取是生物实验中的一项基本技术，主要用于获取生物体的DNA或RNA。

在基因组提取过程中，可能会遇到各种问题，这些问题可能会影响提取的效率和纯度，进而影响后续的实验结果。

本文将对基因组提取过程中的常见问题进行解析，旨在帮助实验人员更好地进行实验操作。

二、基因组提取过程中的常见问题1.样本制备问题样本制备是基因组提取的第一步，也是最关键的一步。

在这一步中，实验人员需要将生物样本进行处理，以便后续的提取过程。

然而，样本制备过程中可能会出现一些问题，例如样本量不足、样本被污染、样本中的DNA已经被降解等。

这些问题都可能导致提取失败或者提取的基因组质量不高。

2.DNA提取方法DNA提取方法的选择和使用也是影响基因组提取质量的重要因素。

不同的生物样本需要不同的提取方法，如果选择不当或者使用不当，都可能导致提取失败或者提取的基因组质量不高。

此外，不同的提取方法也有其各自的局限性，例如耗时、耗力、提取的DNA量少等。

3.基因组损失和降解基因组损失和降解是基因组提取过程中最常见的问题之一。

在提取过程中，由于各种原因（如机械力、化学反应、酶活性等），DNA可能会被损失或者降解，这会导致提取的基因组不完整或者质量不高。

此外，DNA损失和降解还可能影响后续的实验结果，例如PCR 扩增、测序等。

4.杂质和污染物在基因组提取过程中，杂质和污染物是不可避免的。

这些杂质和污染物可能来源于生物样本本身、提取溶液、实验室环境等。

这些杂质和污染物可能会影响提取的基因组的质量和纯度，进而影响后续的实验结果。

因此，实验人员需要采取有效的措施去除这些杂质和污染物。

质粒的提取中常出现的问题/s/blog_539ca97e0100n6nk.html(2010-11-11 16:51:06)转载▼标签：分类：Biology质粒缓冲液洗脱液电泳杂谈1、质粒提取不成功的原因（1）裂解时间太长。

加入溶液P2后裂解时间不应超过5分钟。

（2）吸附时间不够（3）溶解时间不够（4）大肠杆菌老化。

建议涂布平板培养后。

重新挑选新菌落进行液体培养。

（5）质粒拷贝数低。

由于使用低拷贝数载体引起的质粒DNA提取量低，可更换具体相同功能的高拷贝数载体。

（6）菌体中无质粒。

有些质粒本身不能在某些菌种中稳定存在，经多次转接后有可能造成质粒丢失。

例如。

柯斯质粒在大肠杆菌中长期保存不稳定，因此不要频繁转接，每次接种时应接种单菌落。

另外，检查筛选用抗生素使用浓度是否正确。

碱裂解不充分。

使用过多菌体培养液，会导致菌体裂解不充分，可减少菌体用量或增加溶液P1、P2和P3的用量。

对低拷贝数质粒。

提取时，可加倍使用溶液P1、P2和P3，可能有助于增加质粒提取量和质料质量。

（7）溶液使用不当。

溶液P2、P3在温度较低时可能出现浑浊，应置于37℃保温片刻直至溶解为清亮的溶液，才能使用。

（8）吸附柱过载。

不同产品中吸附柱吸附能力不同，如果需要提取的质粒量很大，请分多次提取。

若用富集培养基，例如TB或者×YT，菌液体积必须减少；若质粒或宿主菌是非常高的拷贝数或生长率，则需调整LB培养液体积。

（9）质粒未全部溶解。

洗脱溶解质粒时，可适当加温或延长溶解时间。

（10）乙醇残留。

漂洗液洗涤后应离心尽量去除残留液体，树脂型试剂盒漂洗后应晾干树脂，再加入洗脱缓冲液。

（11）洗脱液加入位置不正确。

洗脱液应加在硅胶膜中心部位以确保洗脱液会完全覆盖硅胶膜的表面达到最大洗脱效率。

（12）洗脱液不合适。

DNA只在低盐溶液中才能被洗脱，如洗脱缓冲液EB（10 mM Tris•Cl，pH8.5）或水。

洗脱效率取决于pH值。

最大洗脱效率在pH7.0～8.5间。

DNA提取是将生物体中的DNA分子从细胞或组织中分离出来，并将其纯化成为一个可进行分析的过程。

下面是DNA提取的实验原理、所需试剂和耗材、实验仪器、准备工作、实验方法、注意事项、常见问题及解决方法。

一、实验原理DNA提取的实验原理是基于DNA分子的特性，它具有以下几个特点：1.DNA分子是细胞核中的主要遗传物质，它与蛋白质等其他物质结合成染色体。

2.DNA分子具有极性，即亲水基团和疏水基团。

在细胞中，DNA分子的疏水基团与蛋白质结合，亲水基团暴露于水中。

3.在一定浓度的氯化钠溶液中，DNA分子会从细胞中释放出来，并与蛋白质等其他物质分离。

4.通过加入一些化学试剂，如苯酚、氯仿等，可以将DNA分子进一步纯化，去除蛋白质等杂质。

二、所需试剂和耗材1.试剂：o氯化钠：用于溶解细胞中的DNA分子。

o苯酚：用于沉淀DNA分子。

o氯仿：用于去除蛋白质等杂质。

o乙醇：用于沉淀和洗涤DNA分子。

o氢氧化钠、盐酸：用于调整pH值。

2.耗材：o移液器及枪头：用于精确加样。

o离心管和盖子：用于混合和离心溶液。

o过滤器：用于过滤溶液中的杂质。

o无菌水：用于稀释和配制溶液。

o无菌塑料袋：用于保存样品。

三、实验仪器1.实验室搅拌器：用于混合溶液。

2.高速冷冻离心机：用于离心和分离DNA分子。

3.水浴锅：用于加热溶液。

4.无菌工作台或超净工作台：用于进行无菌操作。

5.分光光度计：用于测量DNA浓度和质量。

6.电泳仪和电泳槽：用于分析DNA样品。

7.显微镜：观察细胞生长状态和DNA提取过程。

四、准备工作1.仔细阅读实验步骤和注意事项，了解所需的试剂和耗材及其使用方法。

2.准备好所需的试剂和耗材，并确保它们处于保质期内。

3.检查实验室内是否具备上述实验仪器，并确保其正常运行。

4.用70%乙醇擦拭实验台面，以确保无菌环境。

5.用高压蒸汽灭菌法灭菌所有的实验器具，包括离心管、移液器等，需在适当的压力和温度下进行灭菌处理，以消除所有潜在的污染源。

浅析DNA提取步骤及注意事项DNA提取是分子生物学中的一个核心步骤，它涉及从生物样本中分离出DNA。

这个过程通常包括细胞裂解和核酸纯化两个主要阶段。

细胞裂解旨在破坏细胞膜和核膜，释放出DNA，而核酸纯化则是通过物理化学方法将DNA与其他细胞组分分离。

常用的DNA提取方法包括有机溶剂提取法、硅胶柱提取法和磁珠法。

在实际工作中，需要根据不同的样本类型和实验需求，选择不同的提取方法。

一、常见的DNA提取步骤（详细实验操作根据方法不同有所差异）1.细胞破碎：使用物理或化学方法破坏细胞膜和细胞壁，释放细胞内的DNA。

物理方法包括研磨、冻融循环等，化学方法包括使用去污剂（如SDS-十二烷基硫酸钠）和蛋白酶K。

2.去除蛋白质和其他杂质：常用的方法包括酚氯仿抽提法、盐析法和使用硅胶柱层析法。

这些方法可以去除蛋白质、RNA和其他细胞组分，从而净化DNA。

3.DNA纯化：通过乙醇沉淀或使用硅胶柱等方法进一步纯化DNA，去除残留的杂质。

4.DNA浓缩：使用乙醇沉淀法或离心浓缩等方法将提取的DNA 浓缩到适宜的体积和浓度。

5.质量检测：通过紫外光谱吸收值（OD260/OD280比值）、凝胶电泳和qPCR等方法评估DNA的纯度和浓度。

二、特殊样本的提取方法对于特定类型的样本，如植物组织和血液，可能需要特别设计的提取方法。

例如，植物DNA提取中常用CTAB(十六烷基三甲基溴化铵，Hexadecyl trimethyl ammonium Bromide)法，该方法利用CTAB与核酸形成复合物，在低盐溶液中沉淀，而在高盐溶液中解离，从而分离DNA和多糖。

血液样本中的DNA提取则可能采用非离子变性剂NP40和蛋白酶K的组合来裂解细胞和去除蛋白质。

注意事项：在进行DNA提取时，应注意避免核酸酶污染，确保样品新鲜并妥善保存，避免反复冻融，以保证DNA完整性，以及严格按照协议操作以保证结果的一致性和可重复性。

优化提取条件、样本预处理、温度控制和充分混匀或使用专用试剂盒等策略可以提高提取的效率和质量。

全血基因组DNA提取（磁珠法）的常见问题汇总（一）文章来源：洛阳吉恩特生物科技有限公司随着磁珠法核酸提取技术的不断普及，越来越多的实验室会用到磁珠进行DNA提取，在使用的初期阶段，也会遇到各种各样的问题，近期就有许多老师和我们讨论如何利用磁珠进行全血基因组DNA的提取，我们对其中的常见问题进行了总结，供各位老师参考。

1、上样量与裂解体系上样量是DNA提取的经典问题，无论用什么方法，首先要解决的就是上样量问题，不同的上样量对应不同的试剂体系，上样量过多或多少都会影响裂解的效果。

以GNT-B02的磁珠法全血基因组DNA提取试剂盒为例，标准上样量为200ul，上下浮动不超过100ul，搭配的裂解液用量为400ul，有些老师由于实验要求，需要大体积的上样量，这在实际操作中，就需要对磁珠法的操作流程进行改良，一般的改良思路是按比例放大裂解体系；但有些实验的上样量达到毫升以上，这种情况下，就不能再简单的放大裂解体系了，需要先用红细胞裂解液对样品进行处理，将上样体积浓缩后，再进行磁珠法操作流程的优化。

2、磁珠结团磁珠结团是经常遇到的现象，是由磁珠本身特性和磁珠所处试剂环境两方面造成的，有些磁珠不仅在全血DNA提取过程中会结团，其他的样本也同样会结团，有些老师在初次遇到这种现象的时候会感觉不适应，其实结团现象可以用来提前预判实验结果，结团往往是吸附了大量核酸，如果哪次实验没有结团，本次的实验结果或许会不太好，不过也不能一概而论，杂质太多也是引起磁珠结团的原因。

通过修改试剂配方，优化试剂配置，可以改善磁珠的结团现象，但是该工作较为复杂，需要对各种参数进行调整。

不过对于磁吸速度较慢的磁珠，结团后能明显提高磁吸速度，提高实验效率，只要磁珠在洗脱步骤能够分散，而且结果也在标准范围内，磁珠结团并不会影响整体效果。

3、得率低得率是影响下游实验的最直接因素，根据我们的经验，200ul的全血，得率一般在3ug以上，用GNT-B02的试剂盒，能稳定在5ug以上，有些老师的实验结果只有2ug左右，甚至更低，这就需要重点排查两个环节，一是裂解环节，二是洗脱环节，若是裂解环节的问题，往往会是在结合的时候磁珠不结团，或在洗涤的时候上清液颜色为深黄色或红色，这种情况下，更换全新的裂解液，并且严格按照SOP操作是较为效率的解决办法。

DNA提取纯化用到的常见问题集分享】DNA提取纯化用到的常见问题集Q1: 抽提DNA 去除蛋白质时，怎样使用酚与氯仿较好?A1: 酚与氯仿是非极性分子，水是极性分子，当蛋白水溶液与酚或氯仿混合时，蛋白质分子之间的水分子就被酚或氯仿挤去，使蛋白失去水合状态而变性。

经过离心，变性蛋白质的密度比水的密度为大，因而与水相分离，沉淀在水相下面，从而与溶解在水相中的DNA分开。

而酚与氯仿有机溶剂比重更大，保留在最下层。

作为表面变性剂的酚与氯仿，在去除蛋白质的作用中，各有利弊，酚的变性作用大，但酚与水相有一定程度的互溶，大约10%-15%的水溶解在酚相中，因而损失了这部分水相中的DNA ，而氯仿的变性作用不如酚效果好，但氯仿与水不相混溶，不会带走DNA 。

所以在抽提过程中，混合使用酚与氯仿效果最好。

经酚第一次抽提后的水相中有残留的酚，由于酚与氯仿是互溶的，可用氯仿第二次变性蛋白质，此时一起将酚带走。

也可以在第二次抽提时，将酚与氯仿1:1混合使用。

Q2：为什么用酚与氯仿抽提DNA 时，还要加少量的异戊醇?A2：在抽提DNA 时，为了混合均匀，必须剧烈振荡容器数次，这时在混合液内易产生气泡，气泡会阻止相互间的充分作用。

加入异戊醇能降低分子表面张力，所以能减少抽提过程中的泡沫产生。

一般采用氯仿与异戊醇的比例为24:1。

也可采用酚、氯仿与异戊醇之比为251，同时异戊醇有助于分相，使离心后的上层水相，中层变性蛋白相以及下层有机溶剂相维持稳定。

Q3：植物基因组DNA提取时遇到多糖成分的干扰，DNA提取纯化质量一直不高，如何消除多糖的影响？A3：一般来说，SDS法提取的DNA会还有较多的多糖，使DNA 成胶冻状。

而CTAB DNA提取纯化法可基本上除去多糖。

如果是植物材料本身含糖量比较高，可尝试以下方法：1、在DNA未溶出之前，先用一些缓冲液洗去多糖。

可用缓冲液如：100 mmol/L Tris –HCl (pH=8.0)、5 mmol/L EDTA和0.35 mol/L Sorbitol。

DNA提取过程中各种试剂的作用及原理1．溶液I—溶菌液：溶菌酶：它是糖苷水解酶，能水解菌体细胞壁的主要化学成分肽聚糖中的β-1,4糖苷键，因而具有溶菌的作用。

当溶液中pH小于8时，溶菌酶作用受到抑制。

葡萄糖：增加溶液的粘度，维持渗透压，防止DNA受机械剪切力作用而降解。

EDTA：（1）螯合Mg2＋、Ca2＋等金属离子，抑制脱氧核糖核酸酶对DNA的降解作用（DNase 作用时需要一定的金属离子作辅基）;（2）EDTA的存在，有利于溶菌酶的作用，因为溶菌酶的反应要求有较低的离子强度的环境。

2．溶液II－NaOH－SDS液：NaOH：核酸在pH大于5，小于9的溶液中，是稳定的。

但当pH＞12或pH＜3时，就会引起双链之间氢键的解离而变性。

在溶液II中的NaOH浓度为0.2mo1／L，加抽提液时，该系统的pH就高达12.6，因而促使染色体DNA与质粒DNA的变性。

SDS：SDS是离子型表面活性剂。

它主要功能有：（1）溶解细胞膜上的脂质与蛋白，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜。

（2）解聚细胞中的核蛋白。

（3）SDS能与蛋白质结合成为R-O-SO3-…R＋-蛋白质的复合物，使蛋白质变性而沉淀下来。

但是SDS能抑制核糖核酸酶的作用，所以在以后的提取过程中，必须把它去除干净，防止在下一步操作中（用RNase去除RNA时）受到干扰。

3. 溶液III--3mol／L NaAc（pH4.8）溶液：NaAc的水溶液呈碱性，为了调节pH至4.8，必须加入大量的冰醋酸。

所以该溶液实际上是NaAc-HAc的缓冲液。

用pH4.8的NaAc溶液是为了把pH12.6的抽提液，调回pH至中性，使变性的质粒DNA能够复性，并能稳定存在。

而高盐的3mol／L NaAc有利于变性的大分子染色体DNA、RNA以及SDS-蛋白复合物凝聚而沉淀之。

前者是因为中和核酸上的电荷，减少相斥力而互相聚合，后者是因为钠盐与SDS－蛋白复合物作用后，能形成较小的钠盐形式复合物，使沉淀更完全。

质粒DNA提取常见问题整理一.时间控制问题裂解时间太长，加入溶液P2后裂解时间不应超过5 分钟；吸附时间不够；溶解时间不够都会导致质粒DNA提取实验失败。

二.大肠杆菌老化建议涂布平板培养后，重新挑选新菌落进行液体培养。

三.质粒拷贝数低由于使用低拷贝数载体引起的质粒DNA 提取量低，可更换具体相同功能的高拷贝数载体。

四.溶液使用不当溶液P2、P3 在温度较低时可能出现浑浊，应置于37℃保温片刻直至溶解为清亮的溶液，才能使用。

五.吸附柱过载不同产品中吸附柱吸附能力不同，如果需要提取的质粒量很大，请分多次提取。

若用富集培养基，例如TB 或者×YT 菌液体积必须减少；若质粒或宿主菌是非常高的拷贝数或生长率，则需调整LB 培养液体积。

六.质粒未全部溶解洗脱溶解质粒时，可适当加温或延长溶解时间。

七.乙醇残留漂洗液洗涤后应离心尽量去除残留液体，树脂型试剂盒漂洗后应晾干树脂，再加入洗脱缓冲液。

八.洗脱液加入位置不正确洗脱液应加在硅胶膜中心部位以确保洗脱液会完全覆盖硅胶膜的表面达到最大洗脱效率。

九.洗脱液不合适DNA 只在低盐溶液中才能被洗脱。

洗脱效率取决于pH 值。

最大洗脱效率在pH7.0～ 8.5 间。

当用水洗脱时确保其 pH 值在此范围内，如果pH 过低可能性导致洗脱量低。

洗脱时将灭菌蒸馏水或洗脱缓冲液加暖至60 ℃后使用有利于提高洗脱效率。

十.洗脱体积太小洗脱体积对来回收率有一定影响。

随着洗脱体积的增大回收率增高，但产品浓度降低。

为了得到较高的回收率可以增大洗脱体积。