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蛋白的酵母双杂交实验——以钓饵蛋白筛选cDNA 文库研究蛋白相互作用第一部分 系统简介1. 实验原理蛋白的酵母双杂交实验是以酵母的遗传分析为基础，研究反式作用因子之间的相互作用 对真核基因转录调控影响的实验。
很早就已知道，转录活化蛋白可以和DNA 上特异的序列结合而启动相应基因的转录反应。
这种DNA 结合与转录激活的功能是由转录活化蛋白上两个相互独立的结构域即DNA 结合结构域(Binding Domain, BD)和转录活化结构域(Activation Domain, AD)分别来完成的，并且这两个结构域对于基因的转录活化都是必须的。
目前酵母双杂交实验采用的系统有LexA 系统和Gal4系统两种。
在LexA 系统中，DNA 结合结构域由一个完整的原核蛋白LexA 构成，转录活化结构域则由一个88个氨基酸的酸性的大肠杆菌多肽B42构成，它在酵母中可以活化基因的转录; 在Gal4系统中，BD 和AD 分别由Gal4蛋白上不同的两个结构域(1-147aa 与768-881aa)构成。
cDNA 文库或DNA 与文库蛋白或要验证的蛋白相结合。
一般情况下，单独的BD 可以与GAL4上游活化序列（GAL UAS ）结合但不能引起转录，单独的AD 则不能与GAL UAS 结合，只有当BD 与AD 分别表达的融合蛋白由于相互作用而导致两者在空间上相互靠近时，BD 与AD 才能与GAL UAS 结合并且引起报道基因的转录。
在BD 与AD 要导入的酵母菌AH109中，通过基因工程的方法在GAL4 UASs 和启动子的下游构建了3个报道基因——ADE2，HIS3，MEL1（或LacZ ），因此可以通过营养缺陷筛选和酵母菌表型的改变来筛选或验证两个蛋白之间是否存在相互作用。
GAL4系统的原理如图所示：图一：酵母双杂交系统工作原理Kan r Amp r pGBKT7-bait pACT2-cDNA2．系统特点同以往研究蛋白质—蛋白质之间相互作用的实验手段相比，双杂交系统具有其独特优势。
酵母双杂（Yeast two-hybrid）实验操作手册和注意事项一. 酵母双杂的原理1989年，Song和Field建立了第一个基于酵母的细胞内检测蛋白间相互作用的遗传系统。
很多真核生物的位点特异转录激活因子通常具有两个可分割开的结构域，即DNA特异结合域（DNA-binding domain，BD）与转录激活域（Transcriptional activation domain ，AD）。
这两个结构域各具功能，互不影响。
但一个完整的激活特定基因表达的激活因子必须同时含有这两个结构域,否则无法完成激活功能。
不同来源激活因子的BD区与AD结合后则特异地激活被BD结合的基因表达。
基于这个原理，可将两个待测蛋白分别与这两个结构域建成融合蛋白，并共表达于同一个酵母细胞内。
如果两个待测蛋白间能发生相互作用，就会通过待测蛋白的桥梁作用使AD与BD形成一个完整的转录激活因子并激活相应的报告基因表达。
通过对报告基因表型的测定可以很容易地知道待测蛋白分子间是否发生了相互作用。
酵母双杂交系统由三个部分组成：(1)与BD融合的蛋白表达载体，被表达的蛋白称诱饵蛋白(bait)。
(2)与AD融合的蛋白表达载体，被其表达的蛋白称靶蛋白(prey)。
(3)带有一个或多个报告基因的宿主菌株。
常用的报告基因有HIS3，URA3，LacZ和ADE2等。
而菌株则具有相应的缺陷型。
双杂交质粒上分别带有不同的抗性基因和营养标记基因。
这些有利于实验后期杂交质粒的鉴定与分离。
根据目前通用的系统中BD来源的不同主要分为GAL4系统和LexA系统。
后者因其BD来源于原核生物，在真核生物内缺少同源性，因此可以减少假阳性的出现。
二.所用的载体及相关信息1. pGBKT7载体的图谱和相关信息The pGBKT7 vector expresses proteins fused to amino acids 1–147 of the GAL4 DNA binding domain (DNA-BD). In yeast, fusion proteins are expressed at high levels from the constitutive ADH1promoter (PADH1); transcription is terminated by the T7 and ADH1 transcription termination signals(TT7 & ADH1). pGBKT7 also contains the T7 promoter, a c-Myc epitope tag, and a MCS. pGBKT7replicates autonomously in both E. coli and S. cerevisiae from the pUC and 2 m ori, respectively. Thevector carries the Kan r for selection in E. coli and the TRP1 nutritional marker for selection in yeast.Yeast strains containing pGBKT7 exhibit a higher transformation efficiency than strains carrying other DNA-BD domain vectors (1).b. pGADT7载体的图谱和相关信息pGADT7-T encodes a fusion of the SV40 large T-antigen (a.a. 86–708) and the GAL4 AD (a.a. 768–881). The SV40 large T DNA (GenBank LocusSV4CG) was derived from a plasmid referenced in Li & Fields (1993) and was cloned into pGADT7 using the EcoR I and Xho I sites. pGADT7-T has not been sequenced.三．实验主要流程A.需要准备的药品和设备1.两种酵母菌种(AH109,Y187)2.酵母培养所需的药品: Yeast nitrogen base without amino acidsAgar (for plates only)sterile 10×Dropout Solution单缺-T,-L(clontech公司)二缺-T/-L (clontech公司)四缺-T/-L/-Ade/-His(clontech公司)3.酵母转化所需的药品: 10×TE buffer10×LiAc40%PEGcarrier DNA4.酵母显色所需要的药品: x- -GAL5.其他仪器设备: 30℃恒温培养箱30℃摇床.水浴锅分光光度计B．DNA-BD和DN-AD fusion protein 载体的分别构建。
细菌双杂交实验步骤细菌双杂交实验是一种广泛应用于分析蛋白质相互作用的实验技术。
本实验旨在通过转化酵母菌，实现在蛋白层面上对目标蛋白的功能以及相互作用关系进行研究。
实验步骤：1. 预处理酵母菌：在含有1M sorbitol的磷酸盐缓冲液中将收获的酵母菌进行洗涤，去除培养基中的残留盐分。
之后将酵母菌放置在含有1M sorbitol的缓冲液中，30℃培养至OD600约0.8。
2. 质粒构建：将目标蛋白特异性DNA序列在质粒载体pBTM116中进行克隆，经过PCR 技术检验正常与否。
对于另一种质粒载体pTRG进行同样方式克隆另一种特异性DNA序列。
3. 转化酵母菌：在含有PEG/LiAc缓冲液的条件下将构建好的pBTM116和pTRG质粒转入酵母菌。
将转染过程的混合液置于30℃下孵育并进行热冷冲击处理。
4. 筛选阳性菌落：在缓冲盐丙氨酸担载基质体系内进行SD-GAL-HIS筛选，筛选过程中需控制pBTM116和pTRG构建物的基因簇数据库，以筛去阴性菌落。
5. 二连体验证：通过筛选得到的阳性菌落进行β-加酶和α-酶的检测，检测合成报告基因GAL1-ADE2和GAL1-HIS3是否被启动表达。
判断菌落是否发生了特异性蛋白的相互作用，形成了蛋白二连体。
6. 鉴定蛋白质相互作用：对于筛选得到的阳性菌落进行回溯筛选比对，鉴定哪些实验组应该被排除或者继续保留。
鉴定相互作用的方式可以通过质谱检测，或者利用重建蛋白ELISA技术进行。
7. 数据分析：将筛选过程中所得到的阳性菌落编号，从而得出蛋白质相互作用的列表。
针对每一对蛋白质进行表达定量，进而分析蛋白连接网络，了解蛋白质间相互作用的关系。
细菌双杂交实验是一种可行的分析蛋白质相互作用的技术手段，它为分析生物分子交互作用提供了一种新的途径。
通过细菌双杂交实验，科学家们能够对目标蛋白质的功能以及相互作用关系进行深入研究，有助于我们更好的理解生命科学中蛋白质的功能及其复杂的交互关系。
（酵母菌储存在-70℃中，引物和质粒DNA储存在-20℃中）概念：1. 次序转化:指的是先将一种质粒转化进酵母中（常是DNA-BD/bait plasmid），在选择培养基中选择出阳性克隆，之后再将另外一个质粒（AD fusion library）转化进去。
优点：就是比共转化使用更少的质粒DNA，也就是节约质粒DNA。
2. 共同转化：将两种质粒一起转化进酵母中。
优点：比次序转化更容易操作。
pGBKT7----的选择物是：kanamycin（卡那霉素）pGADT7----的选择物是：ampicillin (氨苄西林)各种SD培养基：1)SD/-ade（腺嘌呤）/-leu（亮氨酸）/-trp（色氨酸）/-his （组氨酸）(1000 ml)（“四缺”）酵母氮源（YNB）： ;-ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.60g （购买来就配好的） ;葡萄糖20g (即2%)2)SD/-leu/-trp/-his (1000 ml)酵母氮源（YNB）： ;-leu/-trp/-his DO supplement 0.62g ; （购买来就配好的）葡萄糖 20g. (即2%)3)SD/-leu/-trp (1000 ml) （“二缺”）酵母氮源（YNB）： ;-ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.64g （购买来就配好的）;葡萄糖 20g (即2%)4)SD/-leu (1000 ml)酵母氮源（YNB）： ;-leu DO supplement 0.69g ; （购买来就配好的）葡萄糖 20g (即2%)5)SD/-trp (1000 ml)酵母氮源（YNB）： ;-ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.74g ; （购买来就配好的）葡萄糖 20g (即2%)注意：YNB有两种，一种含有硫酸胺，另外一种不含硫酸胺。
酵母双杂交操作手册 by shenao Y2H所需材料:PJ69-4A PJ69-4α or AH109 Y187pGBKT7 DNA-BD Vector (bait)pGADT7 AD Vector (prey)pGBKT7-53 Control VectorpGBKT7-Lam Control VectorpGADT7-T Control VectorpCL1 Control Vector3' DNA-BD & AD Sequencing PrimersHerring testes carrier DNAYeast extract，Dextrose(glucose); SD base; DO Supplement; Peptone，with DMF) TE buffer DMSO PEG/LiAc (10X) TE/LiAc buffer (10X) X-a-gal(Yeast Phenotypes–––Ade, His, Leu, Requires adenine (Ade), histidine (His), leucine (Leu), or tryptophan (Trp) in the–or Trp medium to grow; is auxotrophic for at least one of these specific nutrients.Expresses the ADE2 reporter gene; i.e., does not require Ade in the medium to +Ade grow.+His Expresses the HIS3 reporter gene; i.e., does not require His in the medium to grow.+LacZ Expresses the lacZ reporter gene; i.e., is positive for b-galactosidase activity.+Mel1 Expresses the MEL1 reporter gene; i.e., is positive for a-galactosidase activity. MiscellaneousAde2p Protein encoded by the yeast ADE2 gene.3-AT 3-amino-1,2,4-triazole; a competitive inhibitor of the His3 protein.CHX CycloheximideDropout (supplement or solution); a mixture of specific amino acids and nucleosidesDO used to supplement SD base to make SD medium; DO solutions are missing one ormore of the nutrients required by untransformed yeast to grow on SD medium.His3p Protein encoded by the yeast HIS3gene.Minimal Synthetic Dropout medium; comprised of a nitrogen base, a carbon source SD medium (glucose or galactose), and a DO supplement.YPH Yeast Protocols HandbookSD/–Ade SD/–Met SD/–His SD/–Ura YPDA YPD/CHX SD/–Leu SD/–Trp StrainPJ69-4A – + – + + –––––– + + ––– PJ69-4α1SD/–Ade SD/–Met SD/–His SD/–Ura YPDA YPD/CHX SD/–Leu SD/–Trp StrainAH109 – + – + + –––––– + + ––– Y187Yeast selection Bacterial selection Fusion EpitopeCloning vectorspGBKT7 DNA/bait c-Myc TRP1 kanamycinpGADT7 AD/library HA LEU2 ampicillin Control vectorspCL1 GAL4 LEU2 ampicillinpGADT7-T AD/T-antigen HA LEU2 ampicillin pGBKT7-53 DNA-BD/p53 c-Myc TRP1 kanamycin pGBKT7-Lam DNA-BD/lamin C c-Myc TRP1 kanamycin .缩写:Ade腺嘌呤(adenine) His组氨酸(histidine) Leu亮氨酸(leucine) Trp色氨酸(tryptophan)培养基成分及配制方法:YPD & SD Base from CLONTECH already contains a carbonsource(Dextrose(glucose))YPD: 20g/L Peptone, 10g/L Yeast extract, 2% Dextrose(20g/L), 20 g/L Agar (for plates only) 加入上述药品，加水至1L，调节PH值到6.5。
酵母双杂交具体实验流程
酵母双杂交（Yeast Two-Hybrid，Y2H）是一种常用的蛋白质相互作用分析方法，它基于酵母细胞内存在的转录激活子结合域（Transcription Activation Domain，TAD）和DNA结合域（DNA Binding Domain，DBD），通过融合特定的蛋白质序列并在酵母细
胞中共同表达，以实现筛选并鉴定蛋白质相互作用的目的。
酵母双杂交具体实验流程如下：
1.构建启动子驱动的酵母表达载体
该载体包含两部分：AD与DB，分别携带TAD和DBD结构域。
这些结构域可以具体化作为外源蛋白的两个互补部分，这样当它们相互结
合时，激活酵母内的报告基因（RLUC或LacZ）表达，并通过信号放
大器Cre的介入增强了信号。
2.构建融合基因的酵母表达载体
将想要研究的两种蛋白质的氨基酸序列分别连接到AD与DB的C端，形成融合蛋白质基因，然后将融合基因与启动子驱动的表达载体转化
入双杂交酵母细胞。
3.获得蛋白质相互作用的筛选和确认
通过对酵母双杂交转化后的细胞进行筛选，并通过对表达的信号进行观察和测量，得到蛋白质相互作用的筛选结果。
4.确定筛选结果的真实性
在确定特定蛋白质相互作用是否真实的过程中，通常会进行一些补充实验。
例如，可以通过分析生化反应，并利用免疫共沉淀等方法验证筛选结果的可靠性。
总的来说，酵母双杂交是一种常用的蛋白质相互作用分析方法，它可以快速、可靠地鉴定蛋白质相互作用，从而帮助研究者更深入地探究蛋白质的功能和作用机制。
酵母双杂实验步骤2.1.1酵母双杂交2.1.1.1Gateway入门克隆设计Gateway引物时，在上游引物的5'端加上B1序列：GGGG-ACA-AGT-TT G-TAC -AAA-AAA-GCA-GGC-TNN-，下游引物的5'端加上B2序列：GGGG-ACC-ACT-TT G-T AC-AAG-AAA-GCT-GGG-TN-。
其中，5'-GGGG序列是保护碱基，防止引物的重要部分被降解，下划线加粗的部分是在整个的Gateway克隆中可以保存下来的序列，3'端的碱基N是为了保证经过入门载体构建目的载体时阅读框的正确性，一般建议为C。
通过PCR扩增获得带有att B位点的基因片段，扩增体系和条件见3.2.2.2，其中将退火温度改为65℃。
获得扩增产物后对其进行回收纯化，测定纯化后DNA 的质量和浓度后进行下一步的BP反应，反应体系如下：att B-PCR产物（≥10 ng/μL）1-7μLpDONR221 (150 ng/μL)1μLTE buffer, pH 8.0 补足8μL将上述混合物加入离心管中，加入2μL BP反应酶，加入之前需将其在涡旋仪上轻轻振荡两次，所有组分混匀离心后，25℃反应1h，加入1μL蛋白酶K后，混匀离心，37℃反应10min终止BP反应，将BP 反应产物参照3.2.2.6进行转化，由于pDONR221载体为Kan抗性，所以选用含有50μg/mL Kan抗生素的LB平板进行阳性克隆筛选，参照3.2.2.7检测阳性克隆，然后根据3.2.2.8中的方法提取重组质粒，测定质量和浓度后送至测序公司进行测序。
进行BP反应时，需注意以下几项：(1)对于BP反应来说，最高效的是采用线性的att B-PCR产物和超螺旋的att P入门载体；(2)为了提高BP反应的效率，可以将建议的25℃反应1h适当延长至4-6h，可以将效率提高2-3倍，或者延长至过夜反应，可以将效率提高5-10倍，对于长片段克隆来讲，适当的延长反应时间是非常必要的；(3)提高体系中PCR产物的量可以增加反应效率，但每10μL体系中PCR产物最好不要超过250ng。
酵母双杂操作方法酵母双杂技术是一种常用的微生物遗传工程技术，可以用来研究酵母菌的基因功能、调控网络以及重组蛋白的表达等。
下面详细介绍酵母双杂技术的操作方法。
酵母双杂技术主要涉及两个步骤：构建双杂株系和进行双杂实验。
首先我们需要构建带有杂合基因的酵母菌株系。
具体操作如下：步骤一：选择载体首先需要选择一个适合的双杂（Y2H）载体。
常用的双杂载体包括pGBT9、pGBKT7和pGADT7等。
这些载体均含有选择标记，可以在适当的培养基上进行筛选。
步骤二：选择靶蛋白然后需要选择一种靶蛋白，通常是研究对象的潜在互作伴侣蛋白。
可以根据已有的研究结果或生物信息学预测找出可能与靶蛋白相互作用的蛋白。
步骤三：克隆靶蛋白和预测交互蛋白将选定的靶蛋白在酵母菌中进行克隆，并将其与可能的交互蛋白共同表达。
通常，可以通过PCR扩增靶蛋白编码序列，并将其克隆入双杂载体中。
同时，需要通过生物信息学预测和实验证实，确定可能的交互蛋白。
步骤四：转化酵母菌接下来，将构建好的双杂载体转化到酵母菌中。
转化可以通过经典的酵母转化方法、电穿孔法或Lithium Acetate法等实现。
步骤五：筛选融合蛋白表达转化完成后，可以根据选择标记分离出正常的酵母菌种子。
接下来，需要在适当的选择培养基上进行筛选，以获取融合蛋白表达的酵母菌株。
步骤六：确认融合蛋白表达通过Western blot、免疫荧光染色或其他特异性检测方法，确认融合蛋白是否成功表达。
这一步骤可以验证酵母菌中靶蛋白和交互蛋白的相互作用是否发生。
通过以上步骤，我们成功构建了带有杂合基因的酵母菌株系。
接下来，就可以进行双杂实验了。
步骤一：设计实验在进行双杂实验之前，需要根据研究问题制定详细的实验方案。
需要确定酵母菌是否能够在所选培养基上正常生长，并根据需要设计不同实验组和对照组。
步骤二：重组蛋白表达在实验开始之前，需要将预测的交互蛋白克隆到适合的双杂载体中。
然后，将两个杂合载体转化到酵母菌中，以实现融合蛋白的表达。
（酵母菌储存在-70℃中，引物和质粒DNA储存在-20℃中）概念：1. 次序转化:指的是先将一种质粒转化进酵母中（常是DNA-BD/bait plasmid），在选择培养基中选择出阳性克隆，之后再将另外一个质粒（AD fusion library）转化进去。
优点：就是比共转化使用更少的质粒DNA，也就是节约质粒DNA。
2. 共同转化：将两种质粒一起转化进酵母中。
优点：比次序转化更容易操作。
pGBKT7----的选择物是：kanamycin（卡那霉素）pGADT7----的选择物是：ampicillin (氨苄西林)各种SD培养基：1)SD/-ade（腺嘌呤）/-leu（亮氨酸）/-trp（色氨酸）/-his （组氨酸）(1000 ml)（“四缺”）酵母氮源（YNB）： ;-ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.60g （购买来就配好的） ;葡萄糖20g (即2%)2)SD/-leu/-trp/-his (1000 ml)酵母氮源（YNB）： ;-leu/-trp/-his DO supplement 0.62g ; （购买来就配好的）葡萄糖 20g. (即2%)3)SD/-leu/-trp (1000 ml) （“二缺”）酵母氮源（YNB）： ;-ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.64g （购买来就配好的）;葡萄糖 20g (即2%)4)SD/-leu (1000 ml)酵母氮源（YNB）： ;-leu DO supplement 0.69g ; （购买来就配好的）葡萄糖 20g (即2%)5)SD/-trp (1000 ml)酵母氮源（YNB）： ;-ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.74g ; （购买来就配好的）葡萄糖 20g (即2%)注意：YNB有两种，一种含有硫酸胺，另外一种不含硫酸胺。
蛋白的酵母双杂交实验——以钓饵蛋白筛选cDNA 文库研究蛋白相互作用第一部分 系统简介1. 实验原理蛋白的酵母双杂交实验是以酵母的遗传分析为基础，研究反式作用因子之间的相互作用 对真核基因转录调控影响的实验。
很早就已知道，转录活化蛋白可以和DNA 上特异的序列结合而启动相应基因的转录反应。
这种DNA 个相互独立的结构域即DNA 结合结构域(Binding Domain, BD)和转录活化结构域(Activation Domain, AD)分别来完成的，并且这两个结构域对于基因的转录活化都是必须的。
目前酵母双杂交实验采用的系统有LexA 系统和Gal4LexA DNA 结合结构域由一个完整的原核蛋白LexA 构成，转录活化结构域则由一个88个氨基酸的酸性的大肠杆菌多肽B42构成，它在酵母中可以活化基因的转录; 在Gal4系统中，BD 和AD 分别由Gal4蛋白上不同的两个结构域(1-147aa 与768-881aa)构成。
cDNA 文库或DNA 与文库蛋白或要验证的蛋白相结合。
一般情况下，单独的BD 可以与GAL4上游活化序列（）结合但不能引起转录，单独的AD 则不能与GAL UAS 结合，只有当BD 与AD BD 与AD 才能与GAL UAS 结合并且引起报道基因的转录。
在BD 与AD 要导入的酵母菌AH109通过基因工程的方法在GAL4 UASs 和启动子的下游构建了3个报道基因——ADE2，HIS3，MEL1（或LacZ ），否存在相互作用。
GAL4系统的原理如图所示：图一：酵母双杂交系统工作原理Kan r Amp r pGBKT7-bait pACT2-cDNA2．系统特点同以往研究蛋白质—蛋白质之间相互作用的实验手段相比，双杂交系统具有其独特优势。
首先，融合体蛋白之间的相互作用是在真核酵母细胞内进行，蛋白质有可能保持天然的折叠状态，类似其在体内生理状态下的情况，这是其他离体生化检验方法所缺乏的，因此较之后者，它所证实的蛋白质间相互作用将更接近于在体的真实水平。
其次，双杂交系统的敏感度即高，可以检测到在蛋白质之间结合常数低至1mmol/L左右的微弱作用。
许多微弱或短暂的蛋白质之间的相互作用可以借助报道基因表达过程中的多级放大效应反映出来；融合蛋白基因在强启动子的作用下，处于较高的表达水平。
第三，在筛选cDNA文库时，双杂交系统能够简捷地得到编码相互作用蛋白的基因序列，它只需构建质粒而不必准备抗体或纯化蛋白，省略了其它体外检测蛋白之间相互作用方法所必须的蛋白抽提、纯化等繁琐步骤。
需要指出的是，融合体蛋白必须转运至核内才能活化转录，因此对于胞外配体—受体作用以及需要核外修饰或受磷酸化等翻译后修饰过程介导的蛋白质间相互作用而言，该系统的应用受到一些限制。
假阳性结果常常干扰实验的准确性，除某些文库编码的蛋白质本身含有转录活化成分外，细胞内的其它无关蛋白也可能有类似作用，因此双杂3．酵母双杂交GAL4系统筛选cDNA文库实验流程4．GAL系统所用酵母菌株与载体1). GAL系统所用酵母菌株注：菌株AH109可利用所带的HIS3、ADE2、MEL1三个报道基进行筛库。
菌株Y187可利用所带的IacZ报道基因来验证两个已知蛋白间的相互作用。
菌株CG-1945BD-bait和AD-library2). GAL系统所用各种质粒第二部分实验流程构建于AD载体的cDNA文库的扩增一．培养基：LB液体培养基，121℃，15 lbf/ in2灭菌15minA． bacto-Tryptone 10.0gB． bacto-Yeast Extract 5.0gC．NaCl 5.0gD． 5N NaOH 调pH →7.0E. ddH2O →1000.0 ml* LB固体培养平板为含有1.8％琼脂（Agar）的LB培养基LB/Amp培养基为含有Amp 100 ug/ml（高压后冷却到50℃加入）的LB培养基二．实验步骤：1.自-70℃冰箱取出含有DNA2.用新鲜的LB培养液在1.5ml离心管中将上述甘油菌1:106和1:108稀释；3.取稀释菌液各10ul加入90ul LB培养液在1.5ml离心管中振荡混匀，涂布LB/Amp平板(φ90mm); 37℃倒置培养过夜或30℃培养24-36hr,计数平板上单克隆菌落数；4.确定待扩增的DNA文库滴度（cfu/ml）=克隆数×108(1:106稀释)或克隆数×1010(1:108稀释)；5.按照>2-4×104cfu/平板的浓度，涂布LB/Amp平板(φ150mm)，共100块；37℃倒置培养过夜；6.在超净台上，将所有生长菌落的平板上加适量LB培养液，将菌落刮下，转入2000mlLB/ Amp培养液中，37℃振荡培养2-4hr;7.留取适量培养菌液以50%无菌甘油稀释至25%终浓度，分装，保存于-70℃;8.其余培养菌液8000rpm×10min, 4℃，收集细菌；用质粒DNA纯化试剂盒大量抽提质粒DNA。
构建于AD载体的cDNA文库的纯化一. 试剂：质粒DNA提取缓冲液名称缓冲液配方P1 悬浮缓冲液50mM Tris-Cl,pH8.0; 10mM EDTA; 100ug/ml RNase AP2 裂解缓冲液200mM NaOH; 1%SDSKAc,pH5.5P3 中和缓冲液 3.0MQBT 平衡缓冲液750mM NaCl; 50mM MOPS,pH7.0; 15%异丙醇; 0.15％TritonX-100 QC 洗涤缓冲液 1.0M NaCl; 50mM MOPS,pH7.0; 15%异丙醇QF 洗脱缓冲液 1.25M NaCl; 50mM Tris-Cl, pH8.5; 15%异丙醇二.实验步骤：1.培养菌液离心6000 rpm×10min，4℃,每500ml的培养物的沉淀重悬于50ml P1缓冲液;2.加入50m1 P2缓冲液，倒置4-6次混匀，室温孵育5min;3.加入4℃预冷的50ml P3缓冲液，快速倒置4-6次混匀，冰浴30min (其间再倒置混匀4-6次);4.将上述混合液再倒置混匀，离心12000rpm× 30min, 4℃，保留上清；5.上清再离心12000rpm× 15min, 4℃，留上清；6.将上清液上样于经35m1QBT缓冲液平衡的QIAGEN-tip层析柱；7.以100ml QC缓冲液洗涤层析柱2次；8.以35m1 QF缓冲液洗脱吸附于层析柱上的DNA；9.以0.7倍体积异丙醇沉淀DNA，离心12500 rpm × 30min，4℃，小心去除上清；10.以7m1 70％乙醇洗涤沉淀DNA，离心12500 rpm × 10min，4℃，小心去除上清；11.将沉淀的质粒DNA溶于5ml TE，pH8.0缓冲液，转移至新的无菌离心管中，用2.5倍体积无水乙醇；l/10体积3.0M NaAc，pH5.2，于-20℃静置过夜；12.离心12500rpm × 20min，4℃,去除上清，沉淀用70％乙醇洗涤，超净台风干；13.干燥的DNA溶于适量体积TE，定量，分装100-200ug/管(用于1次转化反应，约40ul)，保存于-20℃。
pGBKT7/bait小规模转化酵母菌AH109一.试剂：1.培养基：YPDA液体培养基，(121°C，灭菌15min)A. YPD (Clontech 公司) 15.0gB.0.2%Adenine 4.5mlC. ddH2O →300.0 mlSD/-Trp 固体培养基，(121°C，灭菌15min)A.SD Agar Base (Clontech 公司) 4.67gB.10 × DO (-Leu-Trp) (Clontech 公司) 10.0 mlC.20 × Leu 5.0 mlD.ddH2O →100.0 ml 铺5块平板2.其它贮备液：50% PEG 4000 (Sigma 公司, wt.=3,350)，用前抽滤或高压蒸汽灭菌;100% DMSO (Sigma公司);10 × TE: 0.1 M Tris-HCl (pH7.5)，10mM EDTA，高压蒸汽灭菌;10 ×用乙酸调pH7.5，高压蒸汽灭菌;10 × Dropout/ -Trp-Leu 溶液: 3.2 g DO Supplement(-Leu-Trp) 溶于500ml ddH2O中;20 × Leu: 200 mg L-Leucine (Sigma公司)溶于100ml ddH2O中;0.2%Adenine: 0.2g Adenine Hemisulfate Salt(Sigma公司)溶于100ml ddH2O中;ddH2O: 高压蒸汽灭菌;二.实验步骤：1.从YPDA平板上挑取生长1-3周、直径2-3 mm的AH109单克隆，接入1 ml YPDA液体培养基中，振荡打散菌落，然后接入50 ml YPDA液体培养基中，30°C恒温，250rpm振荡培养过夜（16-18hr），至OD600>1.52.取适量过夜菌液接种于300 ml 新鲜的YPDA液体培养基，至OD600=0.2-0.3，30°C恒温，250rpm振荡培养至OD600=0.4-0.6 (约3hr)；3.室温离心2500rpm × 5min，弃上清；加入25-50 ml ddH2O或TE 重悬洗涤酵母沉淀细胞，离心弃上清，重复洗涤一次，沉淀用1.5 ml 1×TE/LiAc感受态细胞（若仅用于转染质粒，则可置于4°C可几天内使用）；4.准备下列试剂：2×转化反应10 ×TE 10 ×LiAc 50% PEG ddH2OA. 1×TE/LiAc 1.50 ml 150 ul 150 ul / l.20 mlB. PEG/LiAc 1.20 ml 120 ul 120 ul 960ul /C. 1×TE 1.00 ml 100 ul / / 900ul5.分装待转化的质粒DNA，振荡混匀：pGBKT7-bait 0.1ugSperm DNA*(10 mg/ml) 0.1mg*Sperm DNA 新配制时水浴煮沸20分钟，立即插入冰浴，保存于-20°C6.每管加入100ul用1×TE/LiAc重悬的酵母感受态细胞，振荡混匀；7.各加入600ul PEG/LiAc，剧烈振荡（提高转化效率），30°C恒温，200rpm 振荡培养30min；8.各加入70ul DMSO，缓缓倒置混匀(不能振荡)，42°C水浴热休克15min，迅速插入冰浴冷却1-2min；9.室温离心14,000rpm × 5sec，尽量弃尽上清，0.5 ml 1×TE重悬沉淀细胞，取100ul涂布SD/ -Trp固体培养板，30°C倒置培养3天待菌落长出。
