蛋白的酵母双杂交操作手册大全

酵母双杂交操作手册 by shenao Y2H所需材料:PJ69-4A PJ69-4α or AH109 Y187pGBKT7 DNA-BD Vector (bait)pGADT7 AD Vector (prey)pGBKT7-53 Control VectorpGBKT7-Lam Control VectorpGADT7-T Control VectorpCL1 Control Vector3' DNA-BD & AD Sequencing PrimersHerring testes carrier DNAYeast extract，Dextrose(glucose); SD base; DO Supplement; Peptone，with DMF) TE buffer DMSO PEG/LiAc (10X) TE/LiAc buffer (10X) X-a-gal(Yeast Phenotypes–––Ade, His, Leu, Requires adenine (Ade), histidine (His), leucine (Leu), or tryptophan (Trp) in the–or Trp medium to grow; is auxotrophic for at least one of these specific nutrients.Expresses the ADE2 reporter gene; i.e., does not require Ade in the medium to +Ade grow.+His Expresses the HIS3 reporter gene; i.e., does not require His in the medium to grow.+LacZ Expresses the lacZ reporter gene; i.e., is positive for b-galactosidase activity.+Mel1 Expresses the MEL1 reporter gene; i.e., is positive for a-galactosidase activity. MiscellaneousAde2p Protein encoded by the yeast ADE2 gene.3-AT 3-amino-1,2,4-triazole; a competitive inhibitor of the His3 protein.CHX CycloheximideDropout (supplement or solution); a mixture of specific amino acids and nucleosidesDO used to supplement SD base to make SD medium; DO solutions are missing one ormore of the nutrients required by untransformed yeast to grow on SD medium.His3p Protein encoded by the yeast HIS3gene.Minimal Synthetic Dropout medium; comprised of a nitrogen base, a carbon source SD medium (glucose or galactose), and a DO supplement.YPH Yeast Protocols HandbookSD/–Ade SD/–Met SD/–His SD/–Ura YPDA YPD/CHX SD/–Leu SD/–Trp StrainPJ69-4A – + – + + –––––– + + ––– PJ69-4α1SD/–Ade SD/–Met SD/–His SD/–Ura YPDA YPD/CHX SD/–Leu SD/–Trp StrainAH109 – + – + + –––––– + + ––– Y187Yeast selection Bacterial selection Fusion EpitopeCloning vectorspGBKT7 DNA/bait c-Myc TRP1 kanamycinpGADT7 AD/library HA LEU2 ampicillin Control vectorspCL1 GAL4 LEU2 ampicillinpGADT7-T AD/T-antigen HA LEU2 ampicillin pGBKT7-53 DNA-BD/p53 c-Myc TRP1 kanamycin pGBKT7-Lam DNA-BD/lamin C c-Myc TRP1 kanamycin .缩写:Ade腺嘌呤(adenine) His组氨酸(histidine) Leu亮氨酸(leucine) Trp色氨酸(tryptophan)培养基成分及配制方法:YPD & SD Base from CLONTECH already contains a carbonsource(Dextrose(glucose))YPD: 20g/L Peptone, 10g/L Yeast extract, 2% Dextrose(20g/L), 20 g/L Agar (for plates only) 加入上述药品，加水至1L，调节PH值到6.5。

各种SD培养基：1)SD/-ade（腺嘌呤）/-leu（亮氨酸）/-trp（色氨酸）/-his （组氨酸）(1000 ml)（？“四缺”）酵母氮源（YNB）：6.7g ;-ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.60g （购买来就配好的） ;葡萄糖20g (即2%)2)SD/-leu/-trp/-his (1000 ml)酵母氮源（YNB）：6.7g ;-leu/-trp/-his DO supplement 0.62g ; （购买来就配好的）葡萄糖 20g. (即2%)3)SD/-leu/-trp (1000 ml) （？“二缺”）酵母氮源（YNB）：6.7g ;-ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.64g （购买来就配好的）;葡萄糖 20g (即2%)4)SD/-leu (1000 ml)酵母氮源（YNB）：6.7g ;-leu DO supplement 0.69g ; （购买来就配好的）葡萄糖 20g (即2%)5)SD/-trp (1000 ml)酵母氮源（YNB）：6.7g ;-ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.74g ; （购买来就配好的）葡萄糖 20g (即2%)注意：YNB有两种，一种含有硫酸胺，另外一种不含硫酸胺。

我们这用的是含硫酸铵的。

（买来就加进去了的）。

如果不含硫酸铵，那么要在终浓度0.17%的YNB中再加入0.5%的硫酸铵，即最终在1000 ml溶液中加入总量为6.7g的YNB与硫酸铵。

实际配制的方法是：1.配制40%的葡萄糖贮存液（贮存在4℃），过滤除菌，待高压灭菌的溶液温度降至55℃以下时，再将50ml葡萄糖贮存液加入。

（李博士经验这一步不高压，过滤即可使用）2.酵母氮源6.7g，加DO supplement 在920ml水中溶解，调PH至5.8（李博士的经验大约加10M NaOH 200ul即可），之后补水至950 ml。

酵母双杂交试验流程4月4日划线配培养基 TE/LIAC PEG/LIAC配置培养基（YPD YPDA）取酵母细胞划线30°生长3天。

需要用品：三角瓶灭菌封口膜酵母提取物蛋白胨注：以下所有涉及菌的操作均需在超净台中完成。

4月6号星期三（1）选择2-3mm的单克隆（枪头吸取）放入3-5ml的YPDA液体培养基，30°摇菌200rpm，8h 7号下午开始，过夜培养，次日若菌液浓度达到标准，可先置于4度冰箱保存。

需要用品：200ul灭菌枪头、50ml三角瓶、YPDA液体培养基、摇床。

4月7号星期四（2）吸取2.5-10ul酵母培养液，加入25ml YPDA液体培养基，摇菌16-20h直到OD值0.15-0.3。

下午4点开始 8号 8点结束Tips：由于第一次活化的菌夜浓度不一，此处建议设置梯度，分别取2.5、5、10 ul酵母培养液，加入25ml YPDA液体培养基（转化5个以下质粒的话，25ml菌量就够后续使用）。

4月8号星期五（3）将菌液转移至灭菌的50ml离心管中，用天平配平后，室温下700g离心5分钟。

（4）弃掉上清，加入50ml新鲜的YPDA液体重悬菌体（由于离心转速较低，沉淀易悬起来，故倒掉上清液时要小心操作）。

（5）30°震荡培养，直到OD值达到0.4-0.5 （3-5h）。

8号8点开始下午一点结束进行以下操作之前，配置好TE/LiAc溶液，并准备好冰浴。

（6）将上述菌液转移至一个灭菌的50ml离心管中，用天平配平后，室温下700g离心5分钟。

（7）弃掉上清，用30ml无菌水重悬菌体（小心操作）。

（8）再次用天平配平后，室温下700g离心5分钟，弃去上清，加入1.5ml 1.1xTE/LIAC重悬菌体。

（9）将上述溶液转移到灭菌的1.5ml EP管中，高速离心15s。

（10）弃去上清，加入600ul 1.1x TE/LIAC，感受态细胞制备完成，置于冰上待用。

酵母双杂（Yeast two-hybrid）实验操作手册和注意事项一. 酵母双杂的原理1989年，Song和Field建立了第一个基于酵母的细胞内检测蛋白间相互作用的遗传系统。

很多真核生物的位点特异转录激活因子通常具有两个可分割开的结构域，即DNA特异结合域（DNA-binding domain，BD）与转录激活域（Transcriptional activation domain ，AD）。

这两个结构域各具功能，互不影响。

但一个完整的激活特定基因表达的激活因子必须同时含有这两个结构域,否则无法完成激活功能。

不同来源激活因子的BD区与AD结合后则特异地激活被BD结合的基因表达。

基于这个原理，可将两个待测蛋白分别与这两个结构域建成融合蛋白，并共表达于同一个酵母细胞内。

如果两个待测蛋白间能发生相互作用，就会通过待测蛋白的桥梁作用使AD与BD形成一个完整的转录激活因子并激活相应的报告基因表达。

通过对报告基因表型的测定可以很容易地知道待测蛋白分子间是否发生了相互作用。

酵母双杂交系统由三个部分组成：(1)与BD融合的蛋白表达载体，被表达的蛋白称诱饵蛋白(bait)。

(2)与AD融合的蛋白表达载体，被其表达的蛋白称靶蛋白(prey)。

(3)带有一个或多个报告基因的宿主菌株。

常用的报告基因有HIS3，URA3，LacZ和ADE2等。

而菌株则具有相应的缺陷型。

双杂交质粒上分别带有不同的抗性基因和营养标记基因。

这些有利于实验后期杂交质粒的鉴定与分离。

根据目前通用的系统中BD来源的不同主要分为GAL4系统和LexA系统。

后者因其BD来源于原核生物，在真核生物内缺少同源性，因此可以减少假阳性的出现。

二.所用的载体及相关信息1. pGBKT7载体的图谱和相关信息The pGBKT7 vector expresses proteins fused to amino acids 1–147 of the GAL4 DNA binding domain (DNA-BD). In yeast, fusion proteins are expressed at high levels from the constitutive ADH1promoter (PADH1); transcription is terminated by the T7 and ADH1 transcription termination signals(TT7 & ADH1). pGBKT7 also contains the T7 promoter, a c-Myc epitope tag, and a MCS. pGBKT7replicates autonomously in both E. coli and S. cerevisiae from the pUC and 2 m ori, respectively. Thevector carries the Kan r for selection in E. coli and the TRP1 nutritional marker for selection in yeast.Yeast strains containing pGBKT7 exhibit a higher transformation efficiency than strains carrying other DNA-BD domain vectors (1).b. pGADT7载体的图谱和相关信息pGADT7-T encodes a fusion of the SV40 large T-antigen (a.a. 86–708) and the GAL4 AD (a.a. 768–881). The SV40 large T DNA (GenBank LocusSV4CG) was derived from a plasmid referenced in Li & Fields (1993) and was cloned into pGADT7 using the EcoR I and Xho I sites. pGADT7-T has not been sequenced.三．实验主要流程A.需要准备的药品和设备1.两种酵母菌种(AH109,Y187)2.酵母培养所需的药品: Yeast nitrogen base without amino acidsAgar (for plates only)sterile 10×Dropout Solution单缺-T,-L(clontech公司)二缺-T/-L (clontech公司)四缺-T/-L/-Ade/-His(clontech公司)3.酵母转化所需的药品: 10×TE buffer10×LiAc40%PEGcarrier DNA4.酵母显色所需要的药品: x- -GAL5.其他仪器设备: 30℃恒温培养箱30℃摇床.水浴锅分光光度计B．DNA-BD和DN-AD fusion protein 载体的分别构建。

酵母双杂交实验酵母双杂交相关实验方法一、酵母总DNA提取方法（蜗牛酶法）1。

酵母质粒提取试剂bufferi0.9mol/lsorbitol0.1mol/ledtabufferii50mm/ltris20mm/ledtabufferiii10mm/l tris1mm/ledta2、操作步骤：（1）收集新鲜细菌，加入150μlbufferi、25μL蜗牛酶（30mg/ml）（2）37℃水浴1小时。

(3)10000rpm离心10min，去上清，沉淀中加入250μlbufferii。

(4)加入25μl10%sds，65℃水浴30min，每间隔5min中震荡一次。

(5)加入25μl5mol/l醋酸钾，冰浴60min。

(6)4℃12000rpm离心15min，取上清。

（7）向上清液中加入2-3倍体积的无水乙醇，充分混合，并在-20℃下静置1小时以上。

（8）取出，在4℃12000rpm下离心15分钟，丢弃上清液。

(9)加入150μlbufferiii溶解沉淀，用等体积苯酚/氯仿/异戊醇抽提。

(10)12000rpm离心15min。

（11）将上清液转移到新的离心管中，并添加6μl（10u/μl）核糖核酸酶，在37℃下放置30分钟。

（12）取上清液并添加等量的异丙醇。

（13）在4℃下静置10分钟超过1小时或过夜。

（14）在4℃下以10000 rpm离心5分钟。

(15)弃上清，并把沉淀溶于10μlbufferiii中。

二、小规模酵母转化1、酵母转化试剂：除PEG过滤灭菌外，其他转化试剂需要在与普通培养基灭菌相同的条件下进行高温高压灭菌。

(1)m醋酸锂（lithiumacetate）（2）聚乙二醇（PEG）分子量3350，浓度50%（w/V）（3）PEG/liac溶液的制备（即用）800μl50%peg100μl10×te100μl10×liac1ml总体积（4）1.1×TE/liac溶液（用于使用和制备）11ml10×TE（5）11ml10×liac（6）78mlddh202。

!!酵母双杂交操作步骤（中文翻译）（酵母菌储存在-70℃中，引物和质粒DNA储存在-20℃中）概念：1.次序转化:指的是先将一种质粒转化进酵母中（常是DNA-BD/baitplamid），在选择培养基中选择出阳性克隆，之后再将另外一个质粒（ADfuionlibrary）转化进去。

优点：就是比共转化使用更少的质粒DNA，也就是节约质粒DNA。

2.共同转化：将两种质粒一起转化进酵母中。

优点：比次序转化更容易操作。

pGBKT7----的选择物是：kanamycin（卡那霉素）？pGADT7----的选择物是：ampicillin(氨苄西林)？各种SD培养基：1)SD/-ade（腺嘌呤）/-leu（亮氨酸）/-trp（色氨酸）/-hi（组氨酸）(1000ml)（？“四缺”）酵母氮源（YNB）：6.7g;-ade/-leu/-trp/-hiDOupplement0.60g（购买来就配好的）;葡萄糖20g(即2%)2)SD/-leu/-trp/-hi(1000ml)酵母氮源（YNB）：6.7g;-leu/-trp/-hiDOupplement0.62g;（购买来就配好的）葡萄糖20g.(即2%)3)SD/-leu/-trp(1000ml)（？“二缺”）酵母氮源（YNB）：6.7g;-ade/-leu/-trp/-hiDOupplement0.64g（购买来就配好的）;葡萄糖20g(即2%)4)SD/-leu(1000ml)酵母氮源（YNB）：6.7g;-leuDOupplement0.69g;（购买来就配好的）葡萄糖20g(即2%)5)SD/-trp(1000ml)酵母氮源（YNB）：6.7g;-ade/-leu/-trp/-hiDOupplement0.74g;（购买来就配好的）葡萄糖20g(即2%)注意：YNB有两种，一种含有硫酸胺，另外一种不含硫酸胺。

我们这用的是含硫酸铵的。

（买来就加进去了的）。

如果不含硫酸铵，那么要在终浓度0.17%的YNB中再加入0.5%的硫酸铵，即最终在1000ml溶液中加入总量为6.7g的YNB与硫酸铵。

（酵母菌储存在-70℃中，引物和质粒DNA储存在-20℃中）概念：1. 次序转化:指的是先将一种质粒转化进酵母中（常是DNA-BD/bait plasmid），在选择培养基中选择出阳性克隆，之后再将另外一个质粒（AD fusion library）转化进去。

优点：就是比共转化使用更少的质粒DNA，也就是节约质粒DNA。

2. 共同转化：将两种质粒一起转化进酵母中。

优点：比次序转化更容易操作。

pGBKT7----的选择物是：kanamycin（卡那霉素）pGADT7----的选择物是：ampicillin (氨苄西林)各种SD培养基：1)SD/-ade（腺嘌呤）/-leu（亮氨酸）/-trp（色氨酸）/-his （组氨酸）(1000 ml)（“四缺”）酵母氮源（YNB）： ;-ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.60g （购买来就配好的） ;葡萄糖20g (即2%)2)SD/-leu/-trp/-his (1000 ml)酵母氮源（YNB）： ;-leu/-trp/-his DO supplement 0.62g ; （购买来就配好的）葡萄糖 20g. (即2%)3)SD/-leu/-trp (1000 ml) （“二缺”）酵母氮源（YNB）： ;-ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.64g （购买来就配好的）;葡萄糖 20g (即2%)4)SD/-leu (1000 ml)酵母氮源（YNB）： ;-leu DO supplement 0.69g ; （购买来就配好的）葡萄糖 20g (即2%)5)SD/-trp (1000 ml)酵母氮源（YNB）： ;-ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.74g ; （购买来就配好的）葡萄糖 20g (即2%)注意：YNB有两种，一种含有硫酸胺，另外一种不含硫酸胺。

酵母双杂交具体实验流程
酵母双杂交（Yeast Two-Hybrid，Y2H）是一种常用的蛋白质相互作用分析方法，它基于酵母细胞内存在的转录激活子结合域（Transcription Activation Domain，TAD）和DNA结合域（DNA Binding Domain，DBD），通过融合特定的蛋白质序列并在酵母细
胞中共同表达，以实现筛选并鉴定蛋白质相互作用的目的。

酵母双杂交具体实验流程如下：
1.构建启动子驱动的酵母表达载体
该载体包含两部分：AD与DB，分别携带TAD和DBD结构域。

这些结构域可以具体化作为外源蛋白的两个互补部分，这样当它们相互结
合时，激活酵母内的报告基因（RLUC或LacZ）表达，并通过信号放
大器Cre的介入增强了信号。

2.构建融合基因的酵母表达载体
将想要研究的两种蛋白质的氨基酸序列分别连接到AD与DB的C端，形成融合蛋白质基因，然后将融合基因与启动子驱动的表达载体转化
入双杂交酵母细胞。

3.获得蛋白质相互作用的筛选和确认
通过对酵母双杂交转化后的细胞进行筛选，并通过对表达的信号进行观察和测量，得到蛋白质相互作用的筛选结果。

4.确定筛选结果的真实性
在确定特定蛋白质相互作用是否真实的过程中，通常会进行一些补充实验。

例如，可以通过分析生化反应，并利用免疫共沉淀等方法验证筛选结果的可靠性。

总的来说，酵母双杂交是一种常用的蛋白质相互作用分析方法，它可以快速、可靠地鉴定蛋白质相互作用，从而帮助研究者更深入地探究蛋白质的功能和作用机制。

酵母双杂操作方法酵母双杂技术是一种常用的微生物遗传工程技术，可以用来研究酵母菌的基因功能、调控网络以及重组蛋白的表达等。

下面详细介绍酵母双杂技术的操作方法。

酵母双杂技术主要涉及两个步骤：构建双杂株系和进行双杂实验。

首先我们需要构建带有杂合基因的酵母菌株系。

具体操作如下：步骤一：选择载体首先需要选择一个适合的双杂（Y2H）载体。

常用的双杂载体包括pGBT9、pGBKT7和pGADT7等。

这些载体均含有选择标记，可以在适当的培养基上进行筛选。

步骤二：选择靶蛋白然后需要选择一种靶蛋白，通常是研究对象的潜在互作伴侣蛋白。

可以根据已有的研究结果或生物信息学预测找出可能与靶蛋白相互作用的蛋白。

步骤三：克隆靶蛋白和预测交互蛋白将选定的靶蛋白在酵母菌中进行克隆，并将其与可能的交互蛋白共同表达。

通常，可以通过PCR扩增靶蛋白编码序列，并将其克隆入双杂载体中。

同时，需要通过生物信息学预测和实验证实，确定可能的交互蛋白。

步骤四：转化酵母菌接下来，将构建好的双杂载体转化到酵母菌中。

转化可以通过经典的酵母转化方法、电穿孔法或Lithium Acetate法等实现。

步骤五：筛选融合蛋白表达转化完成后，可以根据选择标记分离出正常的酵母菌种子。

接下来，需要在适当的选择培养基上进行筛选，以获取融合蛋白表达的酵母菌株。

步骤六：确认融合蛋白表达通过Western blot、免疫荧光染色或其他特异性检测方法，确认融合蛋白是否成功表达。

这一步骤可以验证酵母菌中靶蛋白和交互蛋白的相互作用是否发生。

通过以上步骤，我们成功构建了带有杂合基因的酵母菌株系。

接下来，就可以进行双杂实验了。

步骤一：设计实验在进行双杂实验之前，需要根据研究问题制定详细的实验方案。

需要确定酵母菌是否能够在所选培养基上正常生长，并根据需要设计不同实验组和对照组。

步骤二：重组蛋白表达在实验开始之前，需要将预测的交互蛋白克隆到适合的双杂载体中。

然后，将两个杂合载体转化到酵母菌中，以实现融合蛋白的表达。

2.1.1 酵母双杂交2.1.1.1 Gateway入门克隆设计Gateway引物时，在上游引物的5'端加上B1序列：GGGG-ACA-AGT-TTG-TAC -AAA-AAA-GCA-GGC-TNN-，下游引物的5'端加上B2序列：GGGG-ACC-ACT-TTG-T AC-AAG-AAA-GCT-GGG-TN-。

其中，5'-GGGG序列是保护碱基，防止引物的重要部分被降解，下划线加粗的部分是在整个的Gateway克隆中可以保存下来的序列，3'端的碱基N是为了保证经过入门载体构建目的载体时阅读框的正确性，一般建议为C。

通过PCR扩增获得带有attB位点的基因片段，扩增体系和条件见3.2.2.2，其中将退火温度改为65℃。

获得扩增产物后对其进行回收纯化，测定纯化后DNA 的质量和浓度后进行下一步的BP反应，反应体系如下：将上述混合物加入离心管中，加入2μL BP反应酶，加入之前需将其在涡旋仪上轻轻振荡两次，所有组分混匀离心后，25℃反应1h，加入1μL蛋白酶K后，混匀离心，37℃反应10min终止BP反应，将BP反应产物参照3.2.2.6进行转化，由于pDONR221载体为Kan抗性，所以选用含有50μg/mL Kan抗生素的LB平板进行阳性克隆筛选，参照3.2.2.7检测阳性克隆，然后根据3.2.2.8中的方法提取重组质粒，测定质量和浓度后送至测序公司进行测序。

进行BP反应时，需注意以下几项：(1) 对于BP反应来说，最高效的是采用线性的attB-PCR产物和超螺旋的attP入门载体；(2) 为了提高BP反应的效率，可以将建议的25℃反应1h适当延长至4-6h，可以将效率提高2-3倍，或者延长至过夜反应，可以将效率提高5-10倍，对于长片段克隆来讲，适当的延长反应时间是非常必要的；(3) 提高体系中PCR产物的量可以增加反应效率，但每10μL体系中PCR产物最好不要超过250ng。

酵母双杂交（筛库）pGBK-gene 转化酵母1.酵母细胞（AH109）划线，YPDA平板，30°C烘箱培养18-20小时。

2.挑取单细胞菌落，在YPDA培养基中，30°C摇床培养18-20小时至菌液饱和。

3.次日，取饱和的酵母培养液5ml转接至100mlYPDA培养基中，30°C摇床培养2h，测定OD600，直至OD600达到0.5左右。

4.（超净台下工作，下同）将上述菌液分装在2只50ml离心管（灭菌）中，室温下3000rpm离心5min。

5.弃上清，重悬于20ml无菌水中，3000rpm离心5min。

6.弃上清，重悬于10ml 1×TE/LiAc溶液中，3000rpm离心5min。

7.弃上清，重悬于500μl 1×TE/LiAc溶液中，室温温育10min。

8.取eppendorf管，每管加100μl酵母细胞、5μl鲑鱼精DNA（10mg/ml，用之前沸水煮2-3min，立即放冰上）、15μl DNA（pGBK连接的基因）。

9.加入280μl PEG/LiAc 溶液，30°C放置45min（可摇）。

10.42°C热激10min，立即放冰上2min。

11.室温下6000-8000rpm离心20~30s，去上清。

12.重悬于500μl无菌水中，取100-200μl涂在SD-trp板上，30°C烘箱培养48-72h。

酵母大规模转化AD文库1.挑取上述SD-trp板上的pGBK连的基因转化子，YPDA培养基中培养至饱和。

2.将上述转化子转接至200mlYPDA培养基中，30°C培养至OD600 0.5-0.6左右。

3.离心收集菌体，20ml无菌水洗涤，3000rpm离心5min。

4.去上清，重悬于20ml 1×TE/LiAc溶液中，3000rpm离心5min。

5.去上清，合并菌体于一管，1ml TE/LiAc溶液悬浮菌体。

请详述酵母双杂交的基本原理和具体操作步骤。

酵母双杂交是一种常用的实验技术，用于研究蛋白质相互作用和基因功能。

酵母双杂交的基本原理是利用酵母细胞中的转录激活因子来检测两个蛋白质相互作用。

该技术基于转录激活因子在酵母细胞中诱导报告基因表达的原理。

核心思想是将需要检测
相互作用的两个蛋白质分别与两个互补的转录激活因子结合，从而使这两个转录激活因子
相互结合并激活报告基因的表达。

具体操作步骤如下：
1. 构建酵母双杂交载体：
- 选择一个载体，将一种转录激活因子的DNA序列插入该载体中的启动子和报告基因
之间，构建转录激活因子的融合蛋白。

- 在另一个载体上将另一种转录激活因子的DNA序列插入该载体中的启动子和报告基
因之间。

2. 转化酵母细胞：
- 将上述构建好的双杂交载体分别转化进酵母细胞中。

这一步骤常用的方法有直接转化、化学转化或电击转化。

- 在转化后，将酵母细胞培养至适当的条件，以使其能够自我复制并表达融合蛋白。

3. 鉴定蛋白相互作用：
- 将转化后得到的酵母细胞分别进行孵育和培养。

- 如果两个融合蛋白能够相互结合，其结合后的转录激活因子能激活报告基因的表达，则酵母细胞会在选择性培养基上生长，形成菌落。

- 将生成的菌落进行筛选和鉴定，确定其是否存在转录激活作用。

常用的方法有β-
半乳糖苷酶报告基因检测、荧光素酶报告基因检测等。

通过上述酵母双杂交的基本原理和具体操作步骤，可以很方便地研究蛋白质相互作用
和基因功能。

蛋白的酵母双杂交操作手册大全蛋白的酵母双杂交实验——以钓饵蛋白筛选cDNA 文库研究蛋白相互作用第一部分系统简介1. 实验原理蛋白的酵母双杂交实验是以酵母的遗传分析为基础，研究反式作用因子之间的相互作用对真核基因转录调控影响的实验。

很早就已知道，转录活化蛋白可以和DNA 上特异的序列结合而启动相应基因的转录反应。

这种DNA 结合与转录激活的功能是由转录活化蛋白上两个相互独立的结构域即DNA 结合结构域(Binding Domain, BD)和转录活化结构域(Activation Domain, AD)分别来完成的，并且这两个结构域对于基因的转录活化都是必须的。

目前酵母双杂交实验采用的系统有LexA 系统和Gal4系统两种。

在LexA 系统中，DNA 结合结构域由一个完整的原核蛋白LexA 构成，转录活化结构域则由一个88个氨基酸的酸性的大肠杆菌多肽B42构成，它在酵母中可以活化基因的转录; 在Gal4系统中，BD 和AD 分别由Gal4蛋白上不同的两个结构域(1-147aa 与768-881aa)构成。

在利用GAL4系统筛选cDNA 文库或研究蛋白间的相互作用时，DNA 结合结构域与靶蛋白即“诱饵”相结合，转录活化结构域与文库蛋白或要验证的蛋白相结合。

一般情况下，单独的BD 可以与GAL4上游活化序列（GAL UAS ）结合但不能引起转录，单独的AD 则不能与GAL UAS 结合，只有当BD 与AD 分别表达的融合蛋白由于相互作用而导致两者在空间上相互靠近时，BD 与AD 才能与GAL UAS 结合并且引起报道基因的转录。

在BD 与AD 要导入的酵母菌AH109中，通过基因工程的方法在GAL4 UASs 和启动子的下游构建了3个报道基因——ADE2，HIS3，MEL1（或LacZ ），因此可以通过营养缺陷筛选和酵母菌表型的改变来筛选或验证两个蛋白之间是否存在相互作用。

GAL4系统的原理如图所示：图一：酵母双杂交系统工作原理Kan r Amp r pGBKT7-bait pACT2-cDNA2．系统特点同以往研究蛋白质—蛋白质之间相互作用的实验手段相比，双杂交系统具有其独特优势。

各种SD培养基：1)SD/-ade（腺嘌呤）/-leu（亮氨酸）/-trp（色氨酸）/-his （组氨酸）(1000 ml)（？“四缺”）酵母氮源（YNB）：6.7g ;-ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.60g （购买来就配好的） ;葡萄糖20g (即2%)2)SD/-leu/-trp/-his (1000 ml)酵母氮源（YNB）：6.7g ;-leu/-trp/-his DO supplement 0.62g ; （购买来就配好的）葡萄糖 20g. (即2%)3)SD/-leu/-trp (1000 ml) （？“二缺”）酵母氮源（YNB）：6.7g ;-ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.64g （购买来就配好的）;葡萄糖 20g (即2%)4)SD/-leu (1000 ml)酵母氮源（YNB）：6.7g ;-leu DO supplement 0.69g ; （购买来就配好的）葡萄糖 20g (即2%)5)SD/-trp (1000 ml)酵母氮源（YNB）：6.7g ;-ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.74g ; （购买来就配好的）葡萄糖 20g (即2%)注意：YNB有两种，一种含有硫酸胺，另外一种不含硫酸胺。

我们这用的是含硫酸铵的。

（买来就加进去了的）。

如果不含硫酸铵，那么要在终浓度0.17%的YNB中再加入0.5%的硫酸铵，即最终在1000 ml溶液中加入总量为6.7g的YNB与硫酸铵。

实际配制的方法是：1.配制40%的葡萄糖贮存液（贮存在4℃），过滤除菌，待高压灭菌的溶液温度降至55℃以下时，再将50ml葡萄糖贮存液加入。

（李博士经验这一步不高压，过滤即可使用）2.酵母氮源6.7g，加DO supplement 在920ml水中溶解，调PH至5.8（李博士的经验大约加10M NaOH 200ul即可），之后补水至950 ml。

1.酵母质粒提取参考天根公司酵母小题试剂盒说明书步骤:1)柱平衡步骤:向吸附柱CPZ中(吸附柱放入收集管中)加入500ul的平衡液BL，12000rpm离心1min，弃掉收集管中废液，将吸附柱重新放回收集管中（使用当天处理的柱子）。

2)取1-5ml酵母培养物，12000rpm离心lmin，尽量吸除上清。

3)破除酵母细胞壁:向菌液中加入300ul山梨醇buffer，加入大约50U Lyticase，充分混匀，并在摇床上220 rpm，30℃处理lh。

4000rpm离心10min，弃上清，收集沉淀。

加入250ul 溶液YP1(已加RNaseA)，重悬沉淀。

4)向管中加入250ul YP2溶液，温和地上下翻转6-8次，使菌体充分混匀，室温静置5-10min。

5)向管中加入350ul YP3 溶液，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，出现白色絮状沉淀。

12000rpm离心20min。

6)小心地将上清液加入吸附柱CP2中，12000rpm离心1min，弃废液。

7)向吸附柱CP2中加入500ul缓冲液PD，12000rpm离心1min，弃废液。

8)向吸附柱CP2中加入600ul漂洗液PW(己加无水乙醇)，12000rpm离心1min，弃废液。

9)重复步骤8。

10)将吸附柱CP2放入收集管中，12000rpm离心2min，去除吸附柱中残余的漂洗液。

11)将吸附柱CP2置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加50-100ul洗脱缓冲液EB，室温放置2分钟，12000rpm离心2min，收集质粒，-20℃保存。

提取的酵母质粒浓度低很难凝胶电泳监测，可将其转入感受态DH5a，若转化成功即可认为质粒抽提合格，送交测序。

2. 酵母质粒DNA的提取1. 挑取经过酵母选择/诱导培养基初步鉴定的酵母单菌落，接种于5.0-10.0ml SD/-Trp液体培养基，30℃恒温，250rpm振荡培养20hr。

2. 室温离心5000xg×1min，弃上清，收菌。

酵母双杂交的原理和操作过程嘿，朋友们！今天咱来唠唠酵母双杂交这个神奇的玩意儿。

你说这酵母双杂交啊，就像是一场奇妙的分子之舞。

咱先来说说原理。

想象一下，酵母细胞就像是一个大舞台，而两种蛋白质呢，就像是两位舞者。

其中一个叫“诱饵”蛋白，另一个叫“猎物”蛋白。

如果这两位舞者能在这个舞台上牵手成功，也就是相互作用，那就会引发一系列的反应，就像舞台上绽放出绚丽的烟花一样，我们就能知道它们之间有故事啦！这是不是很有意思？接下来讲讲操作过程，那可是相当细致的活儿呢。

首先得准备好我们的酵母细胞，这就好比给舞者搭建好舞台。

然后呢，把带有“诱饵”蛋白的基因和一些报告基因导入到酵母细胞中，这就像是给舞台布置好了灯光和音乐。

接着，再把可能含有“猎物”蛋白的样本也加进去。

这时候啊，就等着看它们会不会在这个舞台上相遇并共舞啦！如果真的有相互作用，报告基因就会被激活，给我们发出信号。

在这个过程中，可不能马虎哟！每一步都得小心翼翼，就像呵护珍贵的宝贝一样。

比如说，基因的导入要准确无误，不然可就看不到精彩的“舞蹈表演”啦。

而且还要注意各种条件的控制，温度啦、湿度啦，都得恰到好处，不然这场分子之舞可就跳不起来咯！你想想看，通过这样一个看似简单却又充满奥秘的实验，我们就能揭开蛋白质之间那些神秘的关系。

这就好比我们在黑暗中找到了一盏明灯，照亮了我们对生命奥秘的探索之路。

做酵母双杂交实验就像是在解谜，每一个步骤都是解开谜题的关键。

当我们最终看到结果，知道了那些蛋白质之间的故事，那种成就感，哎呀，真的是没法形容！就好像我们破解了一个超级大秘密一样。

所以啊，朋友们，不要小看了酵母双杂交这个小小的实验，它里面蕴含着大大的智慧和乐趣。

让我们一起在这个奇妙的分子世界里尽情探索吧，说不定还能发现更多让人惊叹的秘密呢！这难道不让人兴奋吗？反正我是觉得超有意思的啦！。

（酵母菌储存在-70℃中，引物和质粒DNA储存在-20℃中）概念：1. 次序转化:指的是先将一种质粒转化进酵母中（常是DNA-BD/bait plasmid），在选择培养基中选择出阳性克隆，之后再将另外一个质粒（AD fusion library）转化进去。

优点：就是比共转化使用更少的质粒DNA，也就是节约质粒DNA。

2. 共同转化：将两种质粒一起转化进酵母中。

优点：比次序转化更容易操作。

pGBKT7----的选择物是：kanamycin（卡那霉素）pGADT7----的选择物是：ampicillin (氨苄西林)各种SD培养基：1)SD/-ade（腺嘌呤）/-leu（亮氨酸）/-trp（色氨酸）/-his （组氨酸）(1000 ml)（“四缺”）酵母氮源（YNB）： ;-ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.60g （购买来就配好的） ;葡萄糖20g (即2%)2)SD/-leu/-trp/-his (1000 ml)酵母氮源（YNB）： ;-leu/-trp/-his DO supplement 0.62g ; （购买来就配好的）葡萄糖 20g. (即2%)3)SD/-leu/-trp (1000 ml) （“二缺”）酵母氮源（YNB）： ;-ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.64g （购买来就配好的）;葡萄糖 20g (即2%)4)SD/-leu (1000 ml)酵母氮源（YNB）： ;-leu DO supplement 0.69g ; （购买来就配好的）葡萄糖 20g (即2%)5)SD/-trp (1000 ml)酵母氮源（YNB）： ;-ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.74g ; （购买来就配好的）葡萄糖 20g (即2%)注意：YNB有两种，一种含有硫酸胺，另外一种不含硫酸胺。