ClonExpress MultiS多片段一步克隆定向克隆无缝克隆快速克隆试剂盒说明书
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HB-infusion TM 无缝克隆试剂盒使用说明(基于Gibson Assembly 原理,原理附后)一、产品简介HB-infusion TM 无缝克隆试剂盒是一种新型、快速并且高效的Gibson Assembly DNA 定向克隆技术,可以在任意载体的任意位置一次插入多个目的基因片段。
HB-infusion TM 无缝克隆试剂盒操作极其简单,仅需在载体的克隆位点进行线性化,并在插入片段PCR 引物的5’端引入与载体克隆位点两端完全一致的15~25 bp 同源序列(图1,图3)。
将上述线性化的克隆载体和带有同源序列的PCR 片段按合适比例混合,并加入HB-infusion TM Master mix,通过反应体系中DNA 外切酶、DNA 聚合酶以及连接酶的在50℃反应20 min 即可快速完成定向克隆,阳性率几近100%。
图1. HB-infusion TM 快速克隆试剂盒原理示意图。
1. 线性化目的载体(左上);2. PCR 获取目的片段。
设计的引物5’需要和线性化载体末端有15~25 bp 的重叠(图中蓝色和黄色片段,细节可参考图3);3. 按照一定比例把二者混合在HB-infusion TM 的2预混液内,50 C 反应20 min 后直接转化E.coli 即可。
二、HB-infusionTM 试剂盒的优点1. 相比于传统的同源重组的无缝克隆方法进行,HB-infusion TM 试剂盒更高效,操作更简单,只需要一次反应即可完成定向克隆;2. 对酶切位点无要求,可以把目的片段插入到任意载体的任意位点;3. 连接片段之间不会引入任何其他序列;4. 可以同时克隆多个片段。
三、产品包装产品组成使用次数体积2 x HB-infusion TM Master mix 20 tests 200 lPositive linearized pUC vector (250 ng) 5 tests 25 lPositive control insert (500 ng) 5 tests 25 l储存条件-20 ℃四、使用说明汉恒生物建议2-3 个片段连接时,DNA 片段的使用总量为0.02~0.5 pmols,4~6 片段连接时加入的DNA 总量为0.2~1.0 pmols。
PCR产物不经过酶切,直接快速,定向克隆入任何载体的方法默认分类2010-08-13 23:15:45 阅读260 评论0 字号:大中小订阅上海捷瑞生物工程有限公司提供的EZfusion PCR定向克隆同源重组试剂盒,专门为把PCR 产物快速,定向,有效的克隆到任何目标载体而设计。
有效的避免了在克隆过程中遇到的合适内切酶的选择,磷酸化,补平,加A,使用中间载体等等一系列复杂步骤。
无需连接酶,只需要把目标载体线性化(平末端,粘性末端都可以),PCR产物无需任何酶促处理,直接和目标载体混合,20-30分钟一站式解决所有问题。
技术原理:根据酶切后线性化载体的两端序列,分别在目的基因两端设计15 base与载体末端同源的序列,PCR扩增的产物两端就会分别带有15 bp与线性化载体两端相同的序列。
PCR 产物和线性化载体与EZfusion Enzyme酶充分混匀,22 ℃温浴30 min后,按传统方法转化E. coli competent cells,就可以高效、定向地将PCR产物克隆到目标载体上。
如下图:适用范围:1、PCR cloning into any vector2、Long PCR DNA (up to 12 kb) cloning3、Gene transfer from one vector to another4、High-throughput (HTP) PCR cloning5、In vitro joining of DNA fragments优点:1适用于各种自备载体、插入片断、或者酶切位点,只要线性化载体就行(单酶切、双酶切均可),不用酶切PCR产物,不用补平或加A处理,不用去磷酸化载体,不用连接;2. 适用于各种PCR酶(常规Taq、各种高保真酶均可)的扩增产物;3. 混合温育30分钟即可转化,节约时间和精力;4. 精确定向克隆,即使载体单酶切也可以定向,表达产物没有多余的氨基酸;5. 重组效率高、转化率高,可用于高通量操作,批量克隆, 重复性高、可靠性好;6. 根据实验需要选择适合的表达载体,选择最佳酶切位点,酶切载体后得到线性化载体(单酶切或者双酶切均可),得到PCR产物和线性化载体后,加入EZfusion Enzyme酶,混合,22°C保温30分钟后转化,就可以高效、精确、定向将PCR产物克隆到目标载体上。
生物工程知识:快速克隆技术——加速DNA序列分析和基因克隆快速克隆技术——加速DNA序列分析和基因克隆随着生物技术的不断发展,分子生物学技术成为现代生命科学研究中的重要工具之一,通过对生物分子的研究,人们可以深入了解生命体的组成和运作方式,为解决人类和社会面临的诸多问题提供依据和解决途径。
其中,DNA序列分析和基因克隆是现代生命科学研究中最为基础和重要的研究方法之一。
而为了加速DNA序列分析和基因克隆,快速克隆技术应运而生。
快速克隆技术是一类利用高效的DNA重组技术将外源DNA序列导入宿主细胞,并产生可重现、高效、无需寻找突变位点的定向克隆方法。
它不仅缩短了基因克隆的时间,而且方便了对DNA序列的修饰。
快速克隆技术的主要优势在于,可以直接对目标DNA序列进行点突变、插入、删减等修饰,从而实现对基因功能的探究,为分子生物学研究提供有力手段。
快速克隆技术主要包括克隆扩增和重组克隆两种方法。
克隆扩增是一种在PCR反应中同时进行克隆扩增和定向作用的技术,通过使用末端限制性核酸内切酶和pCR®4-TOPO®克隆载体,可以实现PCR产物的快速克隆扩增。
重组克隆则利用了DNA重组酶的高效作用,在宿主细胞内完成DNA重组反应,将目标DNA序列在不损失信息的情况下导入到载体中,从而实现快速、准确、方便的基因克隆。
在快速克隆技术的应用中,需要注意一些技术要点。
首先,对于目标DNA序列的选择需要仔细考虑,得到的DNA序列必须保持完整性,并且没有任何突变;其次,在重组克隆中,DNA重组反应必须充分进行,可以通过调节DNA浓度、DNA重组酶的用量和反应时间等因素来达到最佳反应效果;此外,对于载体的选择也非常重要,通常会选择T/A克隆载体,如pCR®4-TOPO®克隆载体,在克隆扩增反应中具有很好的适用性,而在重组克隆中,较常用的载体有pET-28a,pGEX等。
使用快速克隆技术进行基因克隆,需要进行单克隆鉴定。
clonepix工作原理-回复clonepix是一种图片克隆技术,它能够复制和粘贴图像素材以快速生成新的图像。
这种技术基于计算机图像处理和深度学习算法,通过分析和学习原始图像的特征来创建一个可以生成类似效果的模型。
本文将详细介绍clonepix的工作原理,从图像采集到生成和优化的整个流程。
首先,为了开始克隆过程,我们需要采集一张原始图像作为输入。
这张图片可以是用户自己提供的,也可以从网络上下载。
在采集过程中,我们还可以使用一些图像处理技术来优化图像质量,例如调整亮度、对比度、饱和度等。
接下来,将采集到的原始图像输入到模型中进行处理。
模型通常由深度神经网络构建,包括输入层、隐藏层和输出层。
输入层接收原始图像数据,并将其转化为适合网络处理的格式。
隐藏层是模型的核心,它由多个神经元组成,每个神经元执行一系列计算来提取图像的特征。
这些特征可以是颜色、纹理、形状等。
在克隆过程中,模型不仅学习原始图像的特征,还学习如何将这些特征应用于新的图像生成。
模型会使用反向传播算法来调整权重和偏置,以最小化生成图像与原始图像之间的差异。
这个训练过程需要大量的数据和计算资源来获得准确和高效的结果。
一旦模型训练完成,就可以开始生成新的图像。
用户可以选择以原始图像为基础,并指定要克隆的特定区域。
模型会根据用户的指示和学习到的特征,将原始图像中的特定区域与其他区域进行匹配、复制和粘贴。
这个过程涉及到图像分割、特征匹配和像素操作等多个步骤,以确保生成的图像在视觉上与原始图像一致。
除了基本的克隆功能,clonepix还提供了一些额外的工具和功能来优化生成图像的质量。
例如,用户可以调整克隆的透明度、尺寸和位置,以实现更精确的效果。
此外,clonepix还支持批量处理和自动化操作,使用户能够快速生成大量的克隆图像。
要注意的是,clonepix是一种生成性模型,它并不是一个完美的复制工具。
生成的图像可能会有一些细微的差异和瑕疵,这是由于模型的训练和图像生成过程中存在的限制所导致的。
dna assembly mix无缝克隆原理DNAAssemblyMix是一种新型的基因克隆试剂,它的出现为基因克隆领域带来了革命性的变化。
这种混合物集成了多种功能,能够简化基因克隆过程,提高克隆效率,并降低错误率。
本文将详细介绍DNAAssemblyMix无缝克隆原理,帮助读者更好地理解其优势和应用。
一、无缝克隆原理DNAAssemblyMix无缝克隆原理的核心在于其独特的组装方式。
传统的基因克隆方法需要人工构建载体,操作过程繁琐,容易出错。
而DNAAssemblyMix则采用了一种自动化、智能化的组装方式,将目的基因和载体DNA预先混合,通过特定的酶反应,将两者连接起来,形成重组子。
这种方式大大简化了克隆步骤,降低了人为误差,提高了克隆效率。
二、关键技术1.酶切位点设计:DNAAssemblyMix的关键技术之一是酶切位点的合理设计。
通过对载体DNA和目的基因进行精确分析,选择合适的酶切位点,能够保证在特定条件下,目的基因能够准确无误地连接到载体上。
2.自动化组装:DNAAssemblyMix采用自动化设备进行组装,能够实现大规模生产。
这种自动化设备能够精确控制反应温度、时间等条件,确保基因克隆的准确性和稳定性。
3.质量控制:DNAAssemblyMix的生产过程中,严格控制每个环节的质量,包括原料筛选、生产环境、生产过程等。
通过严格的质量控制,确保产品的稳定性和可靠性。
三、应用领域DNAAssemblyMix无缝克隆原理的应用领域非常广泛,包括生物医药、农业、环保等领域。
在生物医药领域,DNAAssemblyMix可以用于基因治疗、药物筛选等研究;在农业领域,DNAAssemblyMix可以用于基因编辑、抗病抗逆性等方面的研究;在环保领域,DNAAssemblyMix可以用于环境监测、生物修复等方面的研究。
四、优势与前景DNAAssemblyMix的优势在于其自动化、智能化、高效、稳定等特点。
简介(INTRODUCTION)原理:Gibson assembly是一种one step, one pot的快速基因组装方法。
它只需要将基因片段和需要的三种酶混合在同一个管内在50°C下培养15-60 min就可以得到组装好的DNA。
装配原理基于DNA片段间的重叠区域,过程依赖于三种酶:DNA 外切酶(T5 exonuclease),高保真DNA聚合酶。
(Phusion polymerase)和耐热DNA连接酶(Taq DNA ligase)的共同作用。
首先,T5 核酸外切酶消化DNA片段的链方向是从5’到3’. 每个DNA片段分别形成一个单链的突出部分,由于着这两个相邻的突出片段有一部分具有同源性能够互补,所以DNA片段退火,互补的序列重新配对连接。
然后,在空缺的部分DNA聚合酶以另一条DNA 单链为模板,沿3' 方向将对应的脱氧核苷酸连接到单链上,填补缺口。
最后,连接酶将两条DNA 单链黏合起来,密封裂缝。
这样具有重叠区域的DNA片段就组装成一整条DNA分子了。
下面是组装的示意图。
材料(MATERIALS)试剂(REAGENTS)NAD,H2O ,1 M MgCl2,1 M DTT,10 mM dNTP mix,1 M Tris-HCl pH 7.5,50% PEG-8000,2.7 mg/ mL Tag ligase,0.85 μg/ mL T5_ExO,Phusion(1×)、LB培养基、抗生素(据载体而定)、LB平板(相应抗性)实验前准备(SETUP)于冰水浴中配制如下反应体系。
如果不慎将液体粘在管壁,可通过短暂离心使其沉入管底。
4x isothermal assembly bufferNAD 20 mgH2O 300 μL1 M MgCl2300 μL1 M DTT 300 μL10 mM dNTP mix 600 μL1 M Tris-HCl pH 7.5 3 mL50% PEG-8000 3 mL加水到7.5 mL,每管分500 μL存于-20°C 或-80°C冰箱,够3000个反应2× assembly mix: best combination:100 reaction 1 mL2.7 mg/ mL Tag ligase 10 μL0.85 μg/ mL T5_ExO 100 μLPhusion(1× ) 25 μL4× G.A. buffer 500 μL加水365 μL,存于-20°C冰箱,有效期1年。
载体构建SOP载体构建(vectorconstruction),为把DNA分子运送到受体细胞中去,必须寻找一种能进入细胞、在装载了外来的DNA片段后仍能照样复制的运载体。
理想的运载体是质粒(plasmid),在基因工程中,常用人工构建的质粒作为载体。
载体构建即是构建含外源DNA的质粒。
载体构建是分子生物学研究常用的手段之一。
主要包括已有载体多克隆位点MCS的改造和已有载体启动子、增强子、筛选标记等功能元件的改造。
载体构建完成后可利用PCR原理进行测序验证。
原核重组表达常用载体构建策略有多种选择,(1)常用的酶切连接是较为广泛使用的克隆技术,主要优点是技术稳定,缺点是周期长、步骤多,任何一个环节产生的误差都会影响克隆构建的失败,如用酶切连接的策略进行载体批量构建,不同载体和不同外源基因尽可能选用相同的上下游酶切位点,需特别留意的是基因内部不能有与上述相同的酶切位点;(2)同源重组是目前流行的克隆技术。
同源重组(Homologous Recombination)是指发生在非姐妹染色单体(sister chromatid)之间或同一染色体上含有同源序列的DNA分子之间或分子之内的重新组合。
该技术可以任意载体任意基因片段快速实现多片段长片段定点定向克隆,最大的优点在于不依赖于酶切位点进行克隆,操作时间也非常短,将目的片段和线性载体按照一定比例混合后,在重组酶的作用下即可发生重组,本实验室常用37℃的温度,30min反应即可完成。
一、目的载体进行双酶切(一)实验准备1.实验材料:质检合格的目的载体。
2.试剂与耗材:buffer,ddH2O,琼脂糖(Spain,9012-36-6)、TBE缓冲液、PCR 管(国产,81245)、1.5ml离心管(国产)、枪头(国产)、Axygen AxyPrep PCR cleanup Kit(Axygen,AP-PCR-250)、限制性内切酶A、限制性内切酶B。
3.仪器与设备:PCR仪(杭州博日,TC-96/G/H(b)A)、mini离心机(其林贝尔,LX600)、电泳槽(北京君意,JY-SPCT)、凝胶成像仪(Bio-rad,GelDoc/ChemiDocuniversal hood II)、分光光度计(天根,OSE-260-01)。
无缝克隆的基本原理1. 介绍无缝克隆(seamless cloning)是一种图像处理技术,用于将源图像的一部分无缝地叠加到目标图像中,使其看起来像是原本就存在的一部分。
这种技术常用于图像修复、风格迁移、图像合成等应用中,能够产生非常逼真的效果。
无缝克隆的基本原理是通过计算图像的梯度信息来实现的。
梯度表示图像的颜色强度变化率,是图像中最容易引起人眼注意的信息之一。
通过控制源图像和目标图像的梯度一致性,在源图像和目标图像的边界处产生平滑的过渡,从而使得两者的拼接看起来无缝连接。
2. 梯度计算在进行无缝克隆之前,首先需要计算源图像和目标图像的梯度信息。
通常使用梯度算子(如Sobel算子)来对图像进行卷积运算,以获取梯度信息。
梯度算子会计算每个像素点周围像素的颜色强度差异,从而得到一个梯度向量。
梯度向量的大小和方向可以通过计算各个方向上的梯度值来表示。
3. 选取源和目标区域在进行无缝克隆之前,需要在目标图像中选取一个目标区域,并在源图像中选取一个对应的源区域。
目标区域是我们希望将源区域无缝叠加到的位置,源区域是我们希望复制到目标图像中的区域。
4. Alpha混合Alpha混合是无缝克隆的核心步骤,用于将源区域与目标区域进行融合。
Alpha通道代表对应像素的透明度,取值范围为0到1,其中0表示完全透明,1表示完全不透明。
通过调整Alpha通道的值,可以实现像素的透明与不透明之间的过渡。
在进行Alpha混合时,需要根据源区域和目标区域的梯度信息来调整Alpha通道的值。
具体方法是将目标区域中每个像素的Alpha通道取值与源区域中对应像素的Alpha通道取值进行加权平均。
权重的计算根据源像素与目标像素之间的梯度差异来决定,梯度差异越小,权重越大,反之权重越小。
5. 感兴趣区域(ROI)感兴趣区域是指图像中特定部分的区域,通常是在进行图像处理时所关注的区域。
在无缝克隆中,感兴趣区域是指目标区域和源区域的边界。
使用说明书Version 22.101/产品概述 02/产品组分03/保存条件04/适用范围05/自备材料06/注意事项07/实验原理与流程概要08/实验流程08-1/线性化载体制备08-2/插入片段获得08-3/线性化载体与插入片段的使用量08-4/重组反应08-5/重组产物转化08-6/重组产物鉴定09/常见问题与解决方案.....................................................................................................02 .................................................................................................... 02.................................................................................................... 02..................................................................................................... 02.................................................................................................... 02.................................................................................................... 03.................................................................................. 04.................................................................................................... 04.. (04) (04) (06) (07) (07) (07).................................................................................. 09目 录 Contents*所有商标均属于各自商标所有者的财产。
clonepix工作原理
Clonepix是一种图像克隆工具,它的工作原理可以简单概括为
以下几个步骤:
1. 图像分析,首先,Clonepix会对输入的图像进行分析,提
取出图像中的关键特征和结构信息。
这些特征可以包括边缘、纹理、颜色等。
2. 特征匹配,接下来,Clonepix会在图像中寻找与输入图像
中的特征相似的区域。
它使用的是一种叫做特征匹配的算法,通过
比较特征之间的相似度来找到最佳匹配。
3. 像素复制,一旦找到了最佳匹配的区域,Clonepix会将该
区域中的像素复制到目标图像中。
它会根据特征的位置和形状来调
整像素的位置和颜色,以确保复制的像素能够与目标图像中的其他
部分融合自然。
4. 平滑处理,为了进一步提高复制结果的质量,Clonepix还
会对复制的像素进行平滑处理。
这可以包括使用滤波器来减少噪声、调整亮度和对比度等。
总的来说,Clonepix利用图像分析和特征匹配的技术,将输入图像中的特征复制到目标图像中,从而实现图像克隆的效果。
它可以用于多种应用,如图像修复、图像合成等。
无缝克隆技术的原理文献
无缝克隆技术(Seamless Cloning)是一种先进的基因克隆技术,其原理基于同源重组。
该技术利用同源序列将外源DNA片段精确地插入到载体DNA的特定位置,实现无缝拼接。
在无缝克隆过程中,首先需要构建一个含有目标DNA片段的载体,该载体通常是一个具有同源臂的质粒或噬菌体。
同源臂是位于载体DNA两端与目标DNA片段具有相同或相似碱基序列的DNA片段,其长度通常在几十到几百碱基对之间。
然后,将目标DNA片段与载体DNA在体外进行同源重组,生成重组DNA分子。
同源重组的效率取决于同源臂的长度、互补性以及是否存在促进重组的酶。
如果同源臂的长度足够长且互补性好,同源重组的效率就会很高。
最后,将重组DNA分子导入到宿主细胞中,并在宿主细胞内进行筛选和扩增,最终获得含有目标DNA片段的无缝克隆。
无缝克隆技术的优点在于其高效率和精确性,可以避免传统基因克隆方法中可能出现的错配和突变等问题。
此外,该技术还可以用于定点突变、基因敲除和基因敲入等基因编辑操作,因此在基因工程、基因治疗和合成生物学等领域具有广泛的应用前景。
请注意,无缝克隆技术需要精确的设计和操作,以确保同源臂的正确匹配和重组的成功。
此外,由于该技术涉及到基因操作,因此需要遵守相关的伦理和法规规定。
基因克隆的几种常用方法DNA实验 2009-11-18 12:03:11 阅读119 评论0字号:大中小订阅基因(gene)是遗传物质的最基本单位,也是所有生命活动的基础。
不论要揭示某个基因的功能,还是要改变某个基因的功能,都必须首先将所要研究的基因克隆出来。
特定基因的克隆是整个基因工程或分子生物学的起点。
本文就基因克隆的几种常用方法介绍如下。
1根据已知序列克隆基因对已知序列的基因克隆是基因克隆方法中最为简便的一种。
获取基因序列多从文献中查取,即将别人报道的基因序列直接作为自己克隆的依据。
现在国际上公开发行的杂志一般都不登载整个基因序列,而要求作者在投稿之前将文章中所涉及的基因序列在基因库中注册,拟发表的文章中仅提供该基因在基因库中的注册号(accession number),以便别人参考和查询。
目前,世界上主要的基因库有1)EMBL,为设在欧洲分子生物学实验室的基因库,其网上地址为/ebi-home.html;(2)Genbank,为设在美国国家卫生研究院(NIH)的基因库,其网上地址为/web/search/index.html;(3)Swissport和TREMBL,Swissport是一蛋白质序列库,其所含序列的准确度比较高,而TREMBL只含有从EMBL库中翻译过来的序列。
目前,以Genbank的应用最频繁。
这些基因库是相互联系的,在Genbank注册的基因序列,也可能在Swissport注册。
要克隆某个基因可首先通过Internet查询一下该基因或相关基因是否已经在基因库中注存。
查询所有基因文库都是免费的,因而极易将所感兴趣的基因从库中拿出来,根据整个基因序列设计特异的引物,通过PCR从基因组中克隆该基因,也可以通过RT-PCR克隆cDNA。
值得注意的是,由于物种和分离株之间的差异,为了保证PCR 扩增的准确性,有必要采用两步扩增法,即nested PCR。
根据蛋白质序列也可以将编码该蛋白质的基因扩增出来。
编程克隆知识点总结在本文中,我们将对编程克隆进行详细的知识点总结,包括编程克隆的定义、类型、检测方法、管理原则和未来趋势等方面,以帮助读者更全面地了解和掌握编程克隆相关知识。
一、编程克隆的定义编程克隆是指在软件开发过程中,通过复制和粘贴已有的一段代码来创建新的代码。
克隆代码通常包括两种形式:完全克隆(Exact Clones)和改变克隆(Changed Clones)。
完全克隆是指完全一样的代码片段,而改变克隆是指在完全克隆的基础上进行了一定的修改。
二、编程克隆的类型1. 语法克隆(Syntactic Clones):语法克隆是指在语法上完全一样的代码片段,但语义可能并不相同。
这种克隆类型通常出现在复制粘贴代码的情况下,往往是由于开发人员快速复制粘贴导致的。
2. 语义克隆(Semantic Clones):语义克隆是指在语义上相似但在语法上并不相同的代码片段。
这种克隆类型通常出现在复制粘贴后对代码进行一定程度的修改后的情况。
三、编程克隆的检测方法检测编程克隆是软件工程研究的重要问题,通常有以下几种方法:1. 基于文本比对的方法:该方法通过文本比对算法(如编辑距离算法、特征向量算法等)来比对代码文件,从而识别出相似的代码片段。
2. 基于语法树的方法:该方法将代码片段转换成语法树表示,然后通过比对语法树的方法来检测克隆代码。
3. 基于标记的方法:该方法通过给代码片段打上标记(如哈希值、标签等)来表示其特征,并通过比对标记的方式来检测克隆代码。
4. 基于度量的方法:该方法通过一些代码度量指标(如代码长度、分支数、循环数等)来度量代码片段的相似性,从而检测克隆代码。
以上四种方法各有优缺点,应根据实际情况选择合适的方法来进行编程克隆的检测。
四、编程克隆的管理原则1. 避免盲目克隆:开发人员在编程过程中应避免盲目克隆他人代码,应该根据实际需求进行合理的抽象和封装,提高代码的可复用性。
2. 使用克隆检测工具:开发团队可以使用一些克隆检测工具来帮助识别潜在的克隆代码,从而及时采取措施进行管理和优化。