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HB-infusion TM 无缝克隆试剂盒使用说明（基于Gibson Assembly 原理，原理附后）一、产品简介HB-infusion TM 无缝克隆试剂盒是一种新型、快速并且高效的Gibson Assembly DNA 定向克隆技术，可以在任意载体的任意位置一次插入多个目的基因片段。
HB-infusion TM 无缝克隆试剂盒操作极其简单，仅需在载体的克隆位点进行线性化，并在插入片段PCR 引物的5’端引入与载体克隆位点两端完全一致的15~25 bp 同源序列（图1，图3）。
将上述线性化的克隆载体和带有同源序列的PCR 片段按合适比例混合，并加入HB-infusion TM Master mix，通过反应体系中DNA 外切酶、DNA 聚合酶以及连接酶的在50℃反应20 min 即可快速完成定向克隆，阳性率几近100%。
图1. HB-infusion TM 快速克隆试剂盒原理示意图。
1. 线性化目的载体（左上）；2. PCR 获取目的片段。
设计的引物５’需要和线性化载体末端有15~25 bp 的重叠（图中蓝色和黄色片段，细节可参考图3）；3. 按照一定比例把二者混合在HB-infusion TM 的2预混液内，50 C 反应20 min 后直接转化E.coli 即可。
二、HB-infusionTM 试剂盒的优点1. 相比于传统的同源重组的无缝克隆方法进行，HB-infusion TM 试剂盒更高效，操作更简单，只需要一次反应即可完成定向克隆；2. 对酶切位点无要求，可以把目的片段插入到任意载体的任意位点；3. 连接片段之间不会引入任何其他序列；4. 可以同时克隆多个片段。
三、产品包装产品组成使用次数体积2 x HB-infusion TM Master mix 20 tests 200 lPositive linearized pUC vector （250 ng） 5 tests 25 lPositive control insert (500 ng) 5 tests 25 l储存条件-20 ℃四、使用说明汉恒生物建议2-3 个片段连接时，DNA 片段的使用总量为0.02~0.5 pmols，4~6 片段连接时加入的DNA 总量为0.2~1.0 pmols。
PCR产物不经过酶切，直接快速，定向克隆入任何载体的方法默认分类2010-08-13 23:15:45 阅读260 评论0 字号：大中小订阅上海捷瑞生物工程有限公司提供的EZfusion PCR定向克隆同源重组试剂盒，专门为把PCR 产物快速，定向，有效的克隆到任何目标载体而设计。
有效的避免了在克隆过程中遇到的合适内切酶的选择，磷酸化，补平，加A，使用中间载体等等一系列复杂步骤。
无需连接酶，只需要把目标载体线性化(平末端，粘性末端都可以)，PCR产物无需任何酶促处理，直接和目标载体混合，20-30分钟一站式解决所有问题。
技术原理：根据酶切后线性化载体的两端序列，分别在目的基因两端设计15 base与载体末端同源的序列，PCR扩增的产物两端就会分别带有15 bp与线性化载体两端相同的序列。
PCR 产物和线性化载体与EZfusion Enzyme酶充分混匀，22 ℃温浴30 min后，按传统方法转化E. coli competent cells，就可以高效、定向地将PCR产物克隆到目标载体上。
如下图：适用范围：1、PCR cloning into any vector2、Long PCR DNA (up to 12 kb) cloning3、Gene transfer from one vector to another4、High-throughput (HTP) PCR cloning5、In vitro joining of DNA fragments优点：1适用于各种自备载体、插入片断、或者酶切位点，只要线性化载体就行（单酶切、双酶切均可），不用酶切PCR产物，不用补平或加A处理，不用去磷酸化载体，不用连接；2. 适用于各种PCR酶（常规Taq、各种高保真酶均可）的扩增产物；3. 混合温育30分钟即可转化，节约时间和精力；4. 精确定向克隆，即使载体单酶切也可以定向，表达产物没有多余的氨基酸；5. 重组效率高、转化率高，可用于高通量操作，批量克隆, 重复性高、可靠性好；6. 根据实验需要选择适合的表达载体，选择最佳酶切位点，酶切载体后得到线性化载体（单酶切或者双酶切均可），得到PCR产物和线性化载体后，加入EZfusion Enzyme酶，混合，22°C保温30分钟后转化，就可以高效、精确、定向将PCR产物克隆到目标载体上。
无缝克隆与基因融合基因融合技术是基因功能研究的关键工具。
准确拼接的杂合分子，没有任何无关的序列，使我们可以对分子进行精确的研究。
本篇综述介绍了无缝融合基因和蛋白的应用，以及获得这些杂交分子的方法前言随着各种基因组测序项目的完成，人们越来越关注基因产物的功能分析。
基因融合技术在基因功能研究的许多方面具有重要的作用，包括基因和蛋白标记，报告基因的研究，结构域互换研究，突变研究和基因敲除或者插入实验。
传统的基因融合技术涉及到type II 限制酶消化和DNA连接反应（所谓的剪切/粘贴反应），曾被用来作为构建杂交基因的标准方法。
然而，这种方法常常会在接合处留下操作的序列，例如酶切位点。
这些多余的序列可以改变DNA元件的间隔，在接合处引入多余的氨基酸残基，可能对融合蛋白的结构和功能产生不需要的影响，因此影响对融合基因精确的研究。
这篇综述讨论了精确融合基因的应用之处，概括了实现无缝基因融合的方法。
无缝基因融合及其应用无缝克隆和基因融合就是将两个或者更多DNA片段精确结合在一起，在DNA片段的接合处没有任何不需要的序列。
这是获得杂交基因的理想情况。
以下强调几个例子，以表明无缝基因融合的重要性。
启动子和外显子研究基因启动子含有许多调控元件。
转录因子与它们结合并互相影响来调控转录。
启动子删除分析使我们鉴定到这些功能元件，获得关于基因调控机制的重要信息。
然而，因为不同调控元件之间的间隔常常是非常重要的，通常需要长度不变的linker来维持这些元件的间隔和螺旋面。
基因启动子的linker扫描分析需要无缝DNA融合或者序列替换技术。
分子演化方法例如外显子和DNA转移来获得具有需要生化和/或生理特征的蛋白也需要不同功能元件的无缝拼接。
在真核细胞中，通过内含子介导的RNA拼接可以构建嵌合体基因和/或蛋白。
在这些实验中RNA底物的合成和/或外显子标记核酶需要认真的设计，得到嵌合体前体基因。
只要杂合基因形成正确，无缝融合就可以通过拼接实现。
Hieff Clone TM One Step Pcr Cloning Kit一步法（快速/无缝）克隆试剂盒是一款简单、快速、高效的DNA定向克隆产品，该试剂盒可以将PCR产物定向克隆至任意载体的任意位点，可高效克隆50 bp～10 kp 片段。
将载体在克隆位点进行线性化，并在插入片段PCR引物5’端引入线性化克隆载体末端序列，使得插入片段PCR产物5’和3’最末端分别带有和线性化克隆载体两末端对应的完全一致的序列(15 bp～20 bp)。
将这种两端带有载体末端序列的PCR产物和线性化克隆载体按一定比例混合，在重组酶Exnase的催化下，仅需反应30 min即可进行转化，完成定向克隆。
克隆阳性率可达95%以上。
克隆载体酶切产物或PCR产物和插入片段PCR产物可以不进行DNA纯化直接用于重组克隆，极大的简化了实验步骤。
试剂盒中包含有重组反应所需缓冲液和重组酶Exnase，Exnase中添加了独特的重组增强因子，显著提高重组克隆效率，即便使用低效率感受态细胞 (107 cfu/μg)也可实现高效克隆 (100 cfu/ng Vector)，而且Exnase还兼容常规酶切、PCR反应体系。
一步法（快速/无缝）克隆试剂盒可用于快速克隆、高通量克隆、无缝克隆和DNA定点突变。
产品组分运输与保存方法冰袋（wet ice）运输。
产品-20 ºC保存。
实验流程实验流程概览1)线性化克隆载体制备；2)插入片段扩增引物设计；3)插入片段PCR扩增；4)进行重组反应；5)反应产物转化、涂板；6)克隆鉴定。
图一实验流程概览注：插入片段PCR扩增时，引物5’端引入线性化克隆载体末端同源序列 (图中以蓝色和橙色标记)，使得扩增产物5’和3’最末端序列分别和线性化克隆载体两末端序列完全一致。
1.制备线性化克隆载体选择合适的克隆位点，并对克隆载体进行线性化。
推荐您尽量选择无重复序列且GC含量均匀的区域进行克隆。
当载体克隆位点上下游20 bp区域内GC含量均在40%～60%范围之内时，重组效率将达到最大。
让载体构建更easy，分子克隆其实可以ze么快！每个做过分子实验的人可能都会有这样的经历：在经过N次的PCR、酶切、连接、转化之后，阳性率依旧很低，到底是哪一步出了问题？今天就给大家详解一下可以一步法快速构建同源重组载体，并且阳性率很高的方式：无缝克隆。
无缝克隆技术是一种新的、快速、简洁的克隆方法，可以在质粒的任何位点进行一个或多个目标DNA的片断的插入，而不需要任何限制性内切酶和连接酶。
突破传统的双酶切再加上连接，只需要一步重组法，即可得到高效率克隆的重组载体，大大提高了工作效率。
我们先来将传统克隆与无缝克隆做下比较：无缝克隆相较于传统克隆的方式，优势显而易见，，主要体现以下几点：1、可以不需要任何限制性内切酶、连接酶，也不需要磷酸化、末端补平等操作；2、可同时连接多个DNA片段，最多可达10个；3、不附加任何多余序列，精确定向连接；4、体系反应时间仅需20min，快速反应。
那无缝克隆到底应该怎么做呢？下面我们就来详细了解下无缝克隆其原理：在基因克隆的引物设计及目的DNA片段的扩增阶段，与常规PCR法是相同的。
唯一的差异在于载体末端和引物末端应具有15-20个同源碱基，由此得到的PCR产物两端便分别带上了15-20个与载体序列同源性的碱基。
图1：无缝克隆原理图在用无缝克隆方式进行分子克隆时，主要操作步骤分为以下3点：1、线性化目的载体（图1左上）：用酶切或是PCR方式1）质粒酶切法在目标载体质粒上选取合适的位点进行单酶切或双酶切，对酶切后的载体进行割胶纯化。
2）质粒PCR法如果没有合适的酶切位点，你也可以通过PCR方法实现载体的线性化。
图2.PCR法线性化载体示意图。
在插入位点两侧设计一对方向相反的引物对载体进行扩增，通过跑胶回收获取线性化载体片段2、PCR获取目的片段。
设计的引物５’端需要和线性化载体末端有15~25bp的重叠（图中蓝色和黄色片段）；图3：目的片段同源的引物设计针对双酶切法线性化载体设计插入片段的PCR 引物，其重叠区域为15~25 bp+酶切位点，这样重组成功的质粒上会完好保留此两个酶切位点。
载体构建SOP载体构建(vectorconstruction)，为把DNA分子运送到受体细胞中去，必须寻找一种能进入细胞、在装载了外来的DNA片段后仍能照样复制的运载体。
理想的运载体是质粒(plasmid)，在基因工程中，常用人工构建的质粒作为载体。
载体构建即是构建含外源DNA的质粒。
载体构建是分子生物学研究常用的手段之一。
主要包括已有载体多克隆位点MCS的改造和已有载体启动子、增强子、筛选标记等功能元件的改造。
载体构建完成后可利用PCR原理进行测序验证。
原核重组表达常用载体构建策略有多种选择，（1）常用的酶切连接是较为广泛使用的克隆技术，主要优点是技术稳定，缺点是周期长、步骤多，任何一个环节产生的误差都会影响克隆构建的失败，如用酶切连接的策略进行载体批量构建，不同载体和不同外源基因尽可能选用相同的上下游酶切位点，需特别留意的是基因内部不能有与上述相同的酶切位点；（2）同源重组是目前流行的克隆技术。
同源重组（Homologous Recombination)是指发生在非姐妹染色单体（sister chromatid)之间或同一染色体上含有同源序列的DNA分子之间或分子之内的重新组合。
该技术可以任意载体任意基因片段快速实现多片段长片段定点定向克隆，最大的优点在于不依赖于酶切位点进行克隆，操作时间也非常短，将目的片段和线性载体按照一定比例混合后，在重组酶的作用下即可发生重组，本实验室常用37℃的温度，30min反应即可完成。
一、目的载体进行双酶切（一）实验准备1.实验材料：质检合格的目的载体。
2.试剂与耗材：buffer，ddH2O，琼脂糖（Spain，9012-36-6）、TBE缓冲液、PCR 管（国产，81245）、1.5ml离心管（国产）、枪头（国产）、Axygen AxyPrep PCR cleanup Kit(Axygen，AP-PCR-250)、限制性内切酶A、限制性内切酶B。
3.仪器与设备：PCR仪（杭州博日，TC-96/G/H（b）A）、mini离心机（其林贝尔，LX600）、电泳槽（北京君意，JY-SPCT）、凝胶成像仪（Bio-rad，GelDoc/ChemiDocuniversal hood II）、分光光度计（天根，OSE-260-01）。
使用说明书Version 22.101/产品概述 02/产品组分03/保存条件04/适用范围05/自备材料06/注意事项07/实验原理与流程概要08/实验流程08-1/线性化载体制备08-2/插入片段获得08-3/线性化载体与插入片段的使用量08-4/重组反应08-5/重组产物转化08-6/重组产物鉴定09/常见问题与解决方案.....................................................................................................02 .................................................................................................... 02.................................................................................................... 02..................................................................................................... 02.................................................................................................... 02.................................................................................................... 03.................................................................................. 04.................................................................................................... 04.. (04) (04) (06) (07) (07) (07).................................................................................. 09目 录 Contents*所有商标均属于各自商标所有者的财产。
汉恒生物无缝克隆试剂盒使用说明(附原理)HB-infusion TM无缝克隆试剂盒使用说明（附原理说明）一、产品简介HB-infusion TM无缝克隆试剂盒是一种新型、快速并且高效的Gibson Assembly DNA定向克隆技术，可以在任意载体的任意位置一次插入多个目的基因片段。
HB-infusion TM无缝克隆试剂盒操作极其简单，仅需在载体的克隆位点进行线性化，并在插入片段PCR引物的5’端引入与载体克隆位点两端完全一致的15~25 bp同源序列（图1，图3）。
将上述线性化的克隆载体和带有同源序列的PCR片段按合适比例混合，并加入HB-infusion TM Master mix，通过反应体系中DNA外切酶、DNA聚合酶以及连接酶的在50℃反应20 min即可快速完成定向克隆，阳性率几近100%。
图1. HB-infusion TM快速克隆试剂盒原理示意图。
1. 线性化目的载体（左上）；2. PCR获取目的片段。
设计的引物５’需要和线性化载体末端有15~25 bp的重叠（图中蓝色和黄色片段，细节可参考图3）；3. 按照一定比例把二者混合在HB-infusion TM的2⨯预混液内，50︒C反应20 min后直接转化E.coli即可。
二、HB-infusionTM试剂盒的优点1. 相比于传统的同源重组的无缝克隆方法进行，HB-infusion TM试剂盒更高效，操作更简单，只需要一次反应即可完成定向克隆；2. 对酶切位点无要求，可以把目的片段插入到任意载体的任意位点；3. 连接片段之间不会引入任何其他序列；4. 可以同时克隆多个片段。
三、产品包装产品组成使用次数体积2 x HB-infusion TM Master mix20 tests 200 μlPositive linearized pUC vector （250 ng） 5 tests 25 μlPositive control insert (500 ng) 5 tests 25 μl储存条件-20 ℃四、使用说明汉恒生物建议2-3个片段连接时，DNA片段的使用总量为0.02~0.5 pmols，4~6片段连接时加入的DNA总量为0.2~1.0 pmols。
HiFi一步法无缝克隆试剂盒货号：T1690规格：20T/100T保存：-20℃，1年产品说明：本产品为升级版的无缝克隆连接反应试剂盒，专门为提高克隆效率及克隆准确性而设计。
其采用优化的酶组合体系，专门针对多片段无缝组装反应进行了优化，不引入额外的碱基序列，可快速高效实现1至5个插入片段的定向组装克隆，不受载体平末端/粘性末端的限制和插入片段酶切位点的影响。
高度优化的反应缓冲体系和增强的酶混合物，可显著提高片段无缝组装的效率和对杂质的耐受度，极大地提高了无缝组装的效率。
试剂盒中配备了M13Forward和Reserve通用型引物，可用于含有M13引物位点载体的测序和鉴定，以及检测阳性对照组的阳性率。
本产品适用于包含16-25 bp末端重叠序列的片段与载体间的快速、定向、无缝克隆。
工作原理：产品组份：组分20T50T 2×HiFi OneStep Assembly Cloning Mix100µL100µL x5Linearized Control Vector（3kb40ng/µL）5µL5µLControl Insert1（800bp20ng/µL）5µL5µLControl Insert2（1500bp40ng/µL）5µL5µLM13Forward Primer（10µM）20µL100µLM13Reserve Primer（10µM）20µL100µL使用方法：1.线性化载体的制备选择合适的克隆位点：尽量选择无重复序列且GC含量适中的区域进行克隆。
载体的克隆位点上下游20bp区域内GC含量在40-60%之间时组装效率最大。
1）酶切制备线性化载体：单酶切或双酶切所得线性载体，平末端或粘末端，酶切胶回收线性化载体。
