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实验四 微生物大小的测定一、实验目的1. 熟悉目测微尺和物测微尺的使用方法, 掌握测定微生物大小的技能。
3. 巩固光学显微镜的使用方法二、实验要求1. 预习有关微生物大小测定等方面的知识；2. 遵守实验室安全制度, 听从指导教师安排； 3．认真听讲, 不懂就问；4. 完成实验报告三、实验仪器和材料目测微尺、物测微尺、光学显微镜、微生物标本片四、实验原理及方法1.目测微尺:目镜测微尺是一块圆形玻片, 在玻片中央把5mm 长度刻成50等分, 或把10 mm 长度刻成100等分。
测量时, 将其放在接目镜中的隔板上(此处正好与物镜放大的中间像重叠)来测量经显微镜放大后的细胞物象。
由于不同目镜、物镜组合的放大倍数不相同, 目镜测微尺每格实际表示的长度也不一样, 因此目镜测微尺测量微生物大小时须先用置于镜台上的镜台测微尺校正, 以求出在一定放大倍数下, 目镜测微尺每小格所代表的相对长度。
2.物测微尺中央部分刻有精确等分线的载玻片, 一般将1mm 等分成100格, 每格长0.01mm （即10µm ）。
它并不直接测细胞的大小, 而是用于校正目镜测微尺每格的相对长度。
五、实验步骤及内容1. 目测微尺的标定两对重合线间镜台测微尺格数10目镜测微尺每小格长度＝两对重合线间目镜测微尺格数把物测微尺放在载物台上使刻度朝上。
用低倍镜找到物测微尺的刻度, 移动物测微尺和目测微尺使两者的第一条线重合, 顺着刻度找出另一条重合线。
再分别求出高倍镜和油镜下目测微尺每格的长度。
2. 菌体大小的测量将物测微尺取下, 换上标本片, 选择适当的物镜测量目的物的大小, 分别找出菌体的长和宽占目测微尺的格数, 再按目测微尺1格的长度算出菌体的长度和宽度。
六、实验结果1.将目镜测微尺校正结果填入表1物镜倍数目镜测微尺格数镜台测微尺格数目镜测微尺每格代表的长度2.在高倍镜下测量枯草芽孢杆菌大., 将结果填入表2序号长/um 宽/um 菌体大小（平均值）长/um×宽/um目镜测微尺格数菌体长度目镜测微尺格数菌体宽度1 2 3 4 5七、思考题1.不改变目镜和目镜测微尺, 而改用不同倍数的物镜来测定同一细菌的大小, 目镜测微尺上所量的物镜上物体的实际长度是否相同？为什么？相似。
微生实验报告姓名：王晶晖专业年级：2011级生物技术学号：040312011032实验四酵母菌的形态观察及细胞死活的鉴别，微生物细胞大小的测定一、实验目的1．观察酵母菌的形态及出芽生殖方式，学习区分酵母菌死活细胞的实验方法；掌握酵母菌的一般形态特征及其与细菌的区别。
2．了解目镜测微尺和镜台测微尺的构造及使用原理，掌握测定微生物细胞大小的方法.3．了解血球计数板的构造和使用方法,学会用血球计数板对酵母细胞进行计数。
二、实验原理美蓝是一种无毒性的染料，它的氧化型呈蓝色，还原型无色。
用美蓝对酵母的活细胞进行染色时，由于细胞的新陈代谢作用，细胞内具有较强的还原能力，能使美蓝由蓝色的氧化型变为无色的还原型。
因此，具有还原能力的酵母细胞是无色的，而死细胞或代谢作用微弱的衰老细胞则呈蓝色或淡蓝色。
微生物细胞的大小是微生物重要的形态特征之一，由于菌体微小，只能在显微镜下测量。
用于测量微主物细胞大小的工具有目镜测微尺和镜台测微尺。
目镜测微尺是一块圆形玻片，在玻片中央把5mm长度刻成50等分，或把10 mm长度刻成100等分。
测量时，将其放在接目镜中的隔板上(此处正好与物镜放大的中间物像重叠)用于测量经显微镜放大后的细胞物象。
由于不同目镜、物镜组合的放大倍数不相同，目镜测微尺每格实际表示的长度也不一样，因此目镜测微尺测量微生物大小时须先用置于镜台上的镜台测微尺校正，以求出在一定放大倍数下，目镜测微尺每小格所代表的相对长度。
镜台测微尺是中央部分刻有精确等分线的专用载玻片，一般将lmm等分为100格，每格长10μm，每格长（0.01mm），是专门用来校正目镜测微尺的。
校正时，将镜台测微尺放在载物台上，由于镜台测微尺与细胞标本是处于同一位置，都要经过物镜和目镜的两次放大成像进入视野，即镜台测微尺随着显微镜总放大倍数的放大而放大，因此从镜台测微尺上得到的读数就是细胞的真实大小，所以用镜台测微尺的已知长度在一定放大倍数下校正目镜测微尺，即可求出目镜测微尺每格所代表的实际长度，然后移去镜台测微尺，换上待测标本片，用校正好的目镜测微尺在同样放大倍数下测量微生物细胞大小。
实验四：微生物形态、菌落的观察一、实验目的1．学习在油镜下观察微生物的个体形态2．了解革兰氏染色法的原理，并熟练掌握其操作步二、实验材料1．菌种：大肠杆菌，枯草芽孢杆菌2．器材：显微镜，载玻片，染色缸等3．染色液：草酸铵结晶紫染色液，路哥氏（Lugol）碘液，95%乙醇，0.5%沙黄染色液三、实验内容和方法1.涂片将培养14 —16小时的枯草芽孢杆菌和培养24小时的大肠杆菌分别作涂片（注意涂片切不可过于浓厚），干燥、固定。
固定时通过火焰1—2次即可，不可过热，以载玻片不烫手为宜。
2.染色（1）初染加草酸铵结晶紫一滴，约一分钟，水洗。
（2）媒染滴加碘液冲去残水，并覆盖约一分钟，水洗。
（3）脱色将载玻片上的水甩净，并衬以白背景，用95%酒精滴洗至流出酒精刚刚不出现紫色时为止，约20—30分钟，立即用水冲净酒精。
（4）复染用番红液染1—2分钟，水洗。
（5）镜检干燥后，置油镜观察。
革兰氏阴性菌呈红色，革兰氏阳性菌呈紫色。
以分散开的细菌的革兰氏染色反应为准，过于密集的细菌，常常呈假阳性。
（6）同法在一载玻片上以大肠杆菌于枯草芽孢杆菌混合制片，作革兰氏染色对比。
革兰氏染色的关键在于严格掌握酒精脱色程度，如脱色过度，则阳性菌可被误染为阴性菌；而脱色不够时，阴性菌可被误染为阳性菌。
此外，菌龄也影响染色结果，如阳性菌培养时间过长，或已死亡及部分菌自行溶解了，都常呈阴性反应。
四、注意事项1．革兰氏染色成败的关键是脱色时间，如脱色过度，革兰氏阳性菌也可被脱色而被误认为是革兰氏阴性菌；如脱色时间过短，革兰氏阴性菌也会被误认为是革兰氏阳性菌。
因此必须严格把握脱色时间。
2．选用培养18—24小时菌龄的细菌为宜，若细菌太老，由于菌体死亡或自溶常使革兰氏阳性菌转呈阴性反应。
五、作业要求1．不经复染这一步，能否区别革兰氏阳性菌和阴性菌？2．当你对一株未知菌进行革兰氏染色时，怎样能确证你的染色技术操作正确，结果可靠？。
实验四（五）环境中微生物分离与培养一、实验目的1、掌握从环境（土壤、水体、活性污泥、垃圾堆肥等）中分离培养细菌的方法，获得若干种细菌纯种培养技能。
2、掌握几种接种技术。
3、了解菌种的保藏方法。
二、实验仪器和材料恒温箱、涂布器、细铁丝、接种环、酒精灯、吸耳球、棉花、记号笔；无菌培养皿（直径90毫米）、无菌移液管（1毫升和10毫升）；肉汤蛋白胨培养基、高氏１号培养基、马铃薯培养基；活性污泥或土壤10克、无菌水90毫升、9毫升无菌水（试管中）；酵母、大肠杆菌。
三、细菌纯种分离的操作方法细菌纯种分离的方法有两种：稀释平板法和平板划线法。
（一）稀释平板分离的方法1、取样用无菌锥形瓶到现场取一定数量的活性污泥或土壤，迅速带回实验室。
2、稀释水样将1瓶90毫升和5管9毫升的无菌水排列好，按10-1、10-2、10-3、10- 4、10-5、10-6依次编号。
在无菌操作条件下，将样品（10克）置于第一瓶90毫升无菌水中，用手摇10分钟，将颗粒状样品打散，即为10-1浓度的菌液。
用1毫升无菌移液管吸取1毫升10-1浓度的菌液于一管9毫微升无菌水中，同样方法，依次稀释到10-6。
每次稀释时，需用不同的无菌移液管，或将同一移液管用无菌水洗三次。
3、平板的制作取10套无菌培养皿编号，10-4、10-5、10-6各3个，另1个为空气对照。
取1支1毫升无菌移液管从浓度小的10-6菌液开始，以10-6、10-5、10-4为序分别吸取0.5毫升菌液于相应编号的培养皿内（注：每次吸取前，用移液管在菌液中吹泡使菌液充分混匀），加热熔化培养基，当培养基冷至45℃左右时，右手拿装有培养基的锥形瓶，左手拿培养皿，以中指、无名指和小指托住皿底，拇指和食指夹住皿盖，靠近火焰，将皿盖掀开，倒入培养基后将培养皿平放在桌上，顺时针和逆时针来回转动培养皿，使培养基和菌液充分混匀，冷凝后即成平板，倒置于30℃恒温箱中培养48小时，然后观察结果。
取对照无菌培养皿，打开皿盖10分钟后盖上皿盖，倒置30℃恒温箱中培养48小时后，观察结果。
