微生物学实验-1 口腔微生物的染色观察与显微镜油镜的使用;细菌的革兰氏染色

实验一油镜的使用、革兰染色及特殊结构的观察细菌个体微小，必须借助显微镜来观察其形态结构。

但是活细菌为无色半透明状态，在普通光学显微镜下不易观察清楚，常用染色的方法使细菌着色，使之与背景形成鲜明对比，再在显微镜下观察，可清晰的看到细菌的形态、大小、排列和某些特殊结构。

观察细菌的形态与结构是进行细菌鉴别的方法之一。

目的和要求：1、熟悉显微镜油镜的使用方法。

2、学习使用显微镜油镜观察细菌的特殊结构3、学习革兰染色法实验材料：标本片、显微镜、香柏油、擦镜纸、二甲苯。

实验原理：使用油镜时，需在玻片上滴加香柏油。

这是因为油镜的放大倍数较高，而透镜很小，光线通过不同密度的介质物体（玻片→空气→透镜）时，部分光线会发生折射而散失，进入镜筒的光线少，视野较暗，物体观察不清。

如在透镜与玻片之间滴加和玻璃折射率（n=1.52）相仿的香柏油（n=1.515），则使进入油镜的光线增多，视野亮度增强，物象清晰。

实验方法及注意事项：1、用油镜时，勿将镜臂弯曲倾斜，以免油滴或菌液流淌外溢，影响观察造成污染。

2、用低倍镜对光，自然光线用平面镜（光源不宜采用直射日光，因直射日光的强度太大容易刺激眼睛），人工光源用凹面镜，同时调节集光器和光圈以获得最适亮度。

染色标本油镜检查时，应将光圈完全打开，集光器上升至载物台相平，使光亮度很强。

3、标本片放在载物台上，用标本推进器或压片夹固定。

4、低倍镜找出标本的范围，然后在待检部位上加一滴香柏油，转动镜头转换器，将油镜头置于工作位置，从侧面观察并缓慢转动粗调节器，使油镜头浸没在油滴内，当油镜头几乎接触玻片时停止转动，然后眼睛移至目镜，缓慢向上移动粗调节器（只应上升，不能下降，以免压碎标本和损坏镜头），待看到模糊物象时，再用细调节器转动至物象完全清晰为止。

5、观察完毕，取下标本片，立即用擦镜纸顺一个方向旋转擦拭镜头上的油。

若油已干，应先用二甲苯滴在擦镜纸上擦净镜头，再用另一干净擦镜纸拭去镜头上沾有的二甲苯。

实验一显微镜油镜的使用和细菌的革兰氏染色陈宝莲2010级生态学040212010002一、实验目的1 学习显微镜油镜的使用方法2 学习微生物的无菌操作技术3 学习细菌的革兰氏染色法二、实验原理1 显微镜及油镜物镜的使用原理1) 油镜头的标志油镜头上常刻有OI（oil immersion）或HI（homogeous immersion）字样，有的还刻有一圈红线或黑线标记。

在低倍物镜、高被物镜和油镜3种物镜中，油镜的放大倍数和数值孔径（numerical aperture）最大，而工作距离最短。

2 ) 显微镜的分辨率显微镜性能的优劣不单是看它的总放大倍数，更重要的是看它的分辨率的大小。

分瓣率是指显微镜能分辨出物体两点间最小距离（D）的能力。

D值愈小表明分辨率愈高。

D值与光线的波长（λ）成正比，与物镜的数值孔径（NA）成反比：D=λ/2NA从上式可看出，缩短光波长和增大数值孔径都可提高分辨率。

数值孔径指光线投射到物镜上的最大角度（称镜口角，α）的一半正弦与介质折射率（n）的乘积：NA=n×Sinα/2影响数值孔径大小的因素－是镜口角，二倍介质的折射率。

当物镜与玻片之间的介质为空气时，由于空气（n=1.0）与玻璃（n=1.52）的折射率不同，光线会发生折射，不仅使进入物镜的光线减少，降低了视野的照明度，而且会减少镜口角。

当以香柏油（n=1.515）为介质时，由于它的折射率与玻璃的相近，光线经过玻片后可直接通过香柏油进入物镜而不发生折射，不仅增加了视野的照明度，更重要的是通过增加数值孔径达到提高分辨率的目的。

2 细菌的革兰氏染色原理革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家C.Gram创立的。

作为细菌学上最常用最重要的鉴别染色法，革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G－）两大类.G－菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经番红复染后就成红色。

微生物的实验实验一油镜的使用方法与革兰氏染色实验目的:掌握油镜的使用方法与革兰氏染色的方法实验原理: 革兰染色法⑴革兰阳性菌细胞壁结构较致密，肽聚糖层厚，脂质含量少，乙醇不易透入；革兰阴性菌细胞壁结构疏松，肽聚糖层薄，脂质含量多，乙醇易透入。

⑵革兰阳性菌等电点（pI 2~3）比革兰阴性菌（pI 4~5）低，在相同pH条件下，革兰阳性菌所带负电荷比革兰阴性菌多，故与带正电荷的结晶紫染料结合较牢固，不易脱色。

⑶革兰阳性菌菌体含大量核糖核酸镁盐，可与碘、结晶紫牢固结合，使已着色的细菌不被乙醇脱色；革兰阴性菌含核糖核酸镁盐很少，故易被脱色。

实验步骤: 1.涂片取洁净载玻片1张，用接种环取1～2环生理盐水放于载玻片上，用灭菌的接种环在固体培养基上挑取少许细菌与盐水混合，涂布成直径１cm左右的菌膜（可视挑取菌落的多少涂片范围相应变化）。

若采用液体培养物，可直接取1～2环菌液涂布。

接种环须经火焰灭菌方可放回原处，以免造成污染。

2.干燥涂片最好在室温中自然干燥，或将标本接种面向上，置酒精灯火焰高处慢慢烘干，切勿在火焰上烤。

3.固定干燥后的标本面向上迅速通过火焰3次，这样既可杀菌，又能将细菌固定在玻片上，以免玻片上细菌在染色过程中被水冲洗掉。

2.染色(1)初染：滴加结晶紫染液2～3滴于涂布细菌处，覆盖菌膜，1min后以细水漫过轻洗，将积水甩干。

(2)媒染：滴加卢戈碘液同上，1min后水洗，并将标本片上的积水甩净。

(3)脱色：加95%乙醇数滴于标本片上，轻轻摇晃数秒，斜持玻片使乙醇流掉，再滴加乙醇直至无紫色脱下为止（约30s，灵活掌握时间），细水冲洗，甩干。

(4)复染：滴加石炭酸复红染液，30s～1min后水洗，用吸水纸吸去积水。

3. 镜检用油镜观察，并判断细菌的染色性。

记录实验结果。

4.实验后处理擦干油镜镜头，整理、清洁显微镜，把显微镜放回原处，把标本片放入消毒缸中。

注意事项: 1.标本片涂的太薄或太厚，菌体分散布不均匀，都可影响染色结果。

实验一显微镜油镜的使用和革兰氏染色法A.显微镜油镜的使用实验目的和内容目的：复习显微镜低倍镜和高倍镜的使用技术，了解油浸系物镜的基本原理，掌握油浸系物镜的使用方法。

内容：1．学习油浸系物镜的使用方法。

2．用油镜观察大肠杆菌和金黄色葡萄球菌染色装片。

操作步骤(一)观察前的准备1．将显微镜置于平稳的实验台上，镜座距实验台边沿约为4cm。

坐正，练习用左眼观察。

2．调节光源：将低倍物镜转到工作位置，把光圈完全打开，聚光器升至与载物台相距约1mm左右。

转动反光镜采集光源，光线较强的天然光源宜用平面镜，光线较弱的天然光源或人工光源宜用凹面镜，对光至视野内均匀明亮为止。

观察染色装片时，光线宜强；观察末染色装片时，光线不宜太强。

(二)低倍镜观察染色装片首先上升镜简，将枯草芽孢杆菌染色装片置于载物台上，用标本夹夹住，将观察位置移至物镜正下方，物镜降至距装片0.5cm处，适当缩小光圈然后两眼从目镜观察，转动粗调节器使物镜逐渐上升(或使镜台下降)至发现物像时，改用细调节器调节到物像清楚为止。

移动装片，把合适的观察部位移至视野中心。

(三)高倍镜观察眼睛离开目镜从侧面观察，旋转转换器，将高倍镜转至正下方，注意避免镜头与玻片相懂。

再由目镜观察，仔细调节光圈，使光线的明亮度适宜。

用细调节器校正焦距使物镜清晰为止。

将最适宜观察部位移至视野中心，绘图。

不要移动装片位置，准备用油镜观察。

(四)油镜观察1．提起镜筒约2cm，将油镜转至正下方。

在玻片标本的镜检部位(镜头的正下方)滴一滴香柏油。

2．从侧面注视，小心慢慢降下镜筒，使油镜浸在油中至油圈不扩大为止，镜头几乎与装片接触，但不可压及装片，以免压碎玻片，损坏镜头。

3．将光线调亮，左眼从目镜观察，用粗调节器将镜筒徐徐上升(切忌反方向旋转)，当视野中有物像出现时，再用细调节器校正焦距。

如因镜头下降未到位或镜头上升太快末找到物像，必须再从侧面观察，将油镜降下，重复操作直至物像看清为止。

仔细观察并绘图。

实验一显微镜的使用、细菌形态和结构观察与革兰氏染色法一、显微镜的使用普通光学显微镜是一种精密的光学仪器。

以往最简单的显微镜仅由几块透镜组成，而当前使用的显微镜由一套透镜组成。

普通光学显微镜通常能将物体放大1500—2000倍。

（一）显微镜的构造普通光学显微镜的构造可分为两大部分：一为机械装置，一为光学系统，这两部分很好的配合，才能发挥显微镜的作用。

1、显微镜的机械装置显微镜的机械装置包括镜座、镜筒、物镜转换器、载物台、推动器、粗动螺旋、微动螺旋等部件（1）镜座镜座是显微镜的基本支架，它由底座和镜臂两部分组成。

在它上面连接有载物台和镜筒，它是用来安装光学放大系统部件的基础。

（2）镜筒镜筒上接接目镜，下接转换器，形成接目镜与接物镜（装在转换器下）间的暗室。

从物镜的后缘到镜筒尾端的距离称为机械筒长。

因为物镜的放大率是对一定的镜筒长度而言的。

镜筒长度的变化，不仅放大倍率随之变化，而且成像质量也受到影响。

因此，使用显微镜时，不能任意改变镜筒长度。

国际上将显微镜的标准筒长定为160mm，此数字标在物镜的外壳上。

（3）物镜转换器物镜转换器上可安装3—4个接物镜，一般是三个接物镜（低倍、高倍、油镜）。

Nikon显微镜装有四个物镜。

转动转换器，可以按需要将其中的任何一个接物镜和镜筒接通，与镜筒上面的接目镜构成一个放大系统。

（4）载物台载物台中央有一孔，为光线通路。

在台上装有弹簧标本夹和推动器，其作用为固定或移动标本的位置，使得镜检对象恰好位于视野中心。

（5）推动器是移动标本的机械装置，它是由一横一纵两个推进齿轴的金属架构成的，好的显微镜在纵横架杆上刻有刻度标尺，构成很精密的平面座标系。

如果我们须重复观察已检查标本的某一部分，在第一次检查时，可记下纵横标尺的数值，以后按数值移动推动器，就可以找到原来标本的位置。

（6）粗动螺旋粗动螺旋是移动镜筒调节接物镜和标本间距离的机件，老式显微镜粗螺旋向前扭，镜头下降接近标本。

新近出产的显微镜（如Nikon显微镜）镜检时，右手向前扭载物台上升，让标本接近物镜，反之则下降，标本脱离物镜。

微生物显微镜的使用细菌形态的观察和细菌的革兰氏染色细菌的染色一、实验目的1、掌握细菌涂片标本的制备方法2、掌握细菌革兰染色发和抗酸染色法的原理及操作步骤，识别细菌的革兰氏染色结果3、巩固显微镜油镜的使用和保护法4、学习无菌操作技术二、实验仪器和试剂仪器：显微镜、镜油、擦镜纸、载玻片、盖玻片、接种环、酒精灯试剂：结晶紫、革氏碘染液、95%酒精、番红染液、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌液体培养液、牙垢、石炭酸复红、3％盐酸酒精、碱性美蓝染液、枯草芽孢杆菌、擦镜液三、实验原理：革兰染色法：萋－纳氏抗酸染色法：枯草芽孢杆菌的细胞壁内含有大量的脂质，它包围在肽聚糖的外面，所以枯草芽孢杆菌一般不易着色，要经过加热和延长染色时间来促使其着色。

萋－纳氏抗酸染色法是在加热条件下使枯草芽孢杆菌与石炭酸复红牢固结合成复合物，用盐酸酒精处理也不脱色。

当再加碱性美蓝复染后，枯草芽孢杆菌芽孢仍然为红色，而细菌为蓝色。

四、实验步骤：革兰染色：1、涂片左手持菌液试管,右手持接种环在火焰中灼烧，冷却后从试管中取菌液一滴,在洁净载玻片一端做一涂膜；取一牙签在牙齿上轻轻划动取少量牙垢，在该洁净载玻片的另一端做一涂膜。

2、干燥在空气中自然干燥。

3、固定用镊子夹住涂片一端，将两涂膜出分别在火焰上连续通过三次;以载玻片在手背上试感觉不烫为宜。

4、染色结紫初染：滴加数滴结晶紫染液于细菌涂片上，染色1分钟，水洗；卢戈氏碘液媒染：用卢戈氏碘液覆盖涂片1分钟，水洗；95%的乙醇脱色：滴加95%的乙醇，轻轻摇动玻片进行脱色，直至流出的乙醇无紫色时，水洗；蕃红复染：滴加蕃红染液复染2分钟以上，水洗，吸干镜检。

5、镜检载玻片上滴加一滴香柏油，放油镜下镜检;注意标本中细菌的形态、大小，排列和颜色。

萋－纳氏抗酸染色法：1、涂片、固定用接种环挑取一环枯草芽孢杆菌菌液，涂于玻片上做成薄膜，自然干燥后经火焰固定。

2、染色滴加石炭酸复红液于涂片上，用玻片夹住涂片微火加热，保持染液冒蒸汽约5分钟，切勿蒸发至干或使染液沸腾；冷后，水冲洗；以3％盐酸酒精脱色，至片上红色全部脱去为止；水冲洗后，以碱性美蓝液复染1分钟，水洗，待干，镜检。