黑色素瘤特异性单克隆抗体HB8760可变区基因的克隆和序列测定

黑色素瘤特异性单克隆抗体HB8760可变区基因的克隆和序列测定
王字玲　邓健蓓　韩　骅　陈梅红　苏成芝
(第四军医大学生物化学与分子生物学教研室　西安710033)
摘　要　目的:克隆黑色素瘤特异性单克隆抗体HB8760可变区基因.方法:从培养的可分泌人黑色素瘤特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞HB8760提取总RNA,反转录成c DNA,用合成的一对寡核苷酸引物从中扩增了抗体可变区基因,并克隆入pU C19,挑选出阳性克隆后进行了核苷酸序列分析.结果:所克隆基因分别长360bp和330bp,编码120个和110个氨基酸,含三个CDR区和四个FR区,并含有维持抗体结构所必需的两个半胱氨酸.计算机分析与已发表的小鼠抗体可变区基因有较高同源性.结论:所克隆基因可编码小鼠抗体可变区.
关键词　黑色素瘤　单克隆抗体　基因　克隆　核苷酸序列
中图号　Q78
Am p lificati on,clon ing and sequencing of the variab le regi on genes of a hum an m elanom a sp ecific m onoclonal an tibody
W ang Z iling,D eng J ianbei,H an H ua,Chen M eihong,S u Cheng z h i
D ep artm en t of B i ochem istry and M o lecu lar B i o logy,Fou rth M ilitary M edical U n iversity, X i’an710033
Abstract　Objective:C lon ing of the variab le regi on genes of a hum an m elanom a specific monoclonal an ti-body.M ethods:To tal RNA w as iso lated from a cu ltu red hyb ridom a cell line HB8760w h ich secretes hum an m elanom a specific monoclonal an tibody,and fo llow ed by reverse tran scri p ti on in to c DNA.T hen PCR w as u sed to amp lify the i m m unoglobu lin variab le regi on genes of the an tibody.T he PCR p roduct w as cloned in to pU C19p las m id and sequenced.Results:T he cloned genes con sist of360bp and330bp respectively and en2 code120and110am ino acids.T here are th ree CDR s,fou r FR s and the charicteristic cystein residues w ith in the genes.T he genes are homo logues to the mou se Ig genes pub lished in E M BL gene bank1995.Conclu2 sion s:T he data indicate that the cloned genes encode the variab le regi on of the mou se an tibody.
Keywords　m elanom a　an tibody　gene　nucleo tide sequence
单克隆抗体技术是生物技术发展的一个里程碑.单克隆抗体在生物学基础研究和疾病的诊断、治疗和预防等方面显示出重要的作用和应用前景. L evy等[1]建立了一株人黑色素瘤特异性单克隆抗体XMMM E2001(商品名HB8760).该抗体可特异结合携有黑色素瘤相关抗原的肿瘤细胞,而不与对照的成淋巴细胞系或缺乏黑色素瘤相关抗原的瘤细胞结合[1],这对黑色素瘤的诊断及治疗有重要意义.但由于该抗体为鼠源性,在临床应用中存在诸多问题,而基因工程抗体则有免疫原性低,不被细胞受体结合,在体内成象定位检查时本底低,图象清晰,能进入实体瘤周围微循环,在治疗实体
王字玲,女,29岁,博士生瘤时比完整抗体分子效能高等优点[2],我们从HB8760中克隆了这一抗体的轻、重链可变区基因,并测定了其核苷酸序列,为其进一步应用打下基础.
1　材料和方法
1.1　材料
1.1.1　细胞系　小鼠杂交瘤细胞系HB8760为本校免疫学教研室保存并培养,该细胞可分泌抗人黑色素瘤特异性小鼠IgG2a.
1.1.2　克隆载体及菌种　为本室保存.所用试剂除特殊提到外均为德国Boeh ringer M annhei m公司和华美公司产品.
1.2　方法
1.2.1　RNA的提取　按文献[5]进行.将从107细胞所提取的胞浆总RNA溶解于50Λl水中,紫外定量.
1.2.2　反转录　取10Λg胞浆总RNA在20Λl 体积中用美国P rom ega公司反转录试剂盒进行.反应液于-20℃保存.
1.2.3　PCR　反应及其产物克隆根据已发表的抗体可变区序列的保守性,合成了针对重链和轻链可变区的通用引物[9],PCR引物如下:
V h21(正向)GT GAA T TCA T GCA GGT GCA2 GCT GT T GGA GTCT GG,V h22(反向)A T G2 TCGA CT GA GGA GA CGGT GA CCA GGGT GCC, VL21(正向)GT GAA T TCA T GGA CA T T G2 T GA T GA CCCA GTCTCC,VL22(反向)CA2 GTCGA CT TA CGT T T GA TCTCCA GCT T GGT2 CCC.
在M J R ESEA RCH公司的PCR反应仪上进行.取10Λl PCR产物经EcoR I和SalI消化,低熔点琼脂糖凝胶回收扩增的片段,克隆入pU C19中,酶切选出含插段的克隆.
1.2.4　核苷酸序列分析　双脱氧链终止法,用美国Pharm acia公司的T7Sequencing k it进行.
2　结果
2.1　HB8760可变区基因的扩增　用通用引物扩增HB8760的c DNA分别得到一条约360bp和330bp的片段(F ig1).
图1　HB8760可变区基因的扩增
F ig1　Amp lificati on of variab le regi on genes of HB8760 V H:H eavy chain variable regi on gene;VL:L igh t chain variable regi on gene;M:M o lecular w eigh t m arker.
2.2　扩增片段的克隆　PCR产物经酶切后克隆入pU C19中,并转化JM109,得到约100个白色克隆,随机挑选8个,经酶切鉴定均含插段.
2.3　核苷酸序列测定　挑选一个含插段的阳性克隆大量提取质粒,经FPL C纯化后测序,核苷酸序列结果见F ig2.其特点为:①序列两端含PCR引物及正确的酶切位点.重、轻链分别为360bp和330bp,与PCR结果相同.②重、轻链基因分别编码120个和110个氨基酸,含三个CDR区和四个FR区,并含有维持抗体结构所必需的两个半胱氨酸.③序列经计算机分析与已发表的小鼠抗体可变区基因有较高同源性.
V H:
A T G CA G GT G CA G CT G T T G GA G TCT GGG GCA GA G CT T GT G AA G CCA GGG
GCC TCA GTC AA G T T G TCC T GC A CA GCT TCT GGC T TC AA C A T T AAA GA C
A CC TA T A T G CA C T GG GT G AA G CA G A GG CCT GAA CA G GGC CT G GA G T GG
A T T GGA A GG A T T GA T CCT GCG AA T GGT AA T A CT AAA TA T GA C CCG AA G
T TC CA G GGC AA G GCC A CT A TA A CA GCA GA C A CA TCC TCC AA C A CA GCC
TA C CT G CA G CTC A GC A GC CT G A CA TCT GA G GA C A CT GCC GTC TA T TA C
T GT GCT A GA TA C TA T A GG TA C CCT TA C TA T GCT A T G GA C TA C T GG GGC
CAA GGC A CC A CG GTC A CC GTC TCC TCA GTC GA C
VL:
A T G GA C A T T GT G A T G A CC CA G TCT CCA GCC A TC CT G TCT GT G A CT CCA
GGA GAA A CG GTC A GT CT T TCC T GT A GG GCC A GC CA G A CT A T T TA C AA G
AA C CTA CA C T GG TA T CAA CA G AAA TCA CA T CGG TCT CCA A GG CT T CTC
A TC AA G TA T GGT TCT GA T TCC A TC TCT GGG A TC CCC TCC A GG T TC A CT
GGC A GT GGA TCA GGG A CA GA T TA C A CT CTC AA T A TC AA C A GT T T G AA G
CCC GAA GA T GAA GGA A TA TA T TA C T GT CT T CAA GGT TA C A GT A CA CCT
T GG A CG T TC GGT GGA GGG A CC AA G CT G GA G A TC AAA CGT TA G
图2　HB8760轻、重链可变区基因的核苷酸序列
F ig2　N ucleo tide sequence of V H and VL gene of HB8760
3　讨论
单克隆抗体技术自问世以来,无论对生物医学基础研究还是医学临床实践都是一种极为重要的手段,尤其在肿瘤的诊断,治疗,预防等方面有广阔的应用前景.然而一般制备的单克隆抗体均为鼠源性,应用于临床会引起副作用,大大降低其诊断治疗价值.而人源性抗体的制备目前还有很大困难,因此人们除了对原有技术进行改造,还努力从基因水平上对鼠抗体进行人源化改造,减少鼠抗体蛋白的免疫原性,克服鼠单抗在人体应用的局限性.迄今为止已构建了多种基因工程抗体,如嵌合抗体[6],重构型或人源化抗体[7,10],小片段抗体[8]等.单区抗体为最小的抗体单位,虽然只具有完整抗体十分之一的抗原结合活性,但它制备方法简便,在血清中清除快,成像时背景低,而且还可作为构建有治疗意义的人mA b或Fv片段的元件.所以我们采用PCR技术从杂交瘤中克隆其可变区基因,为其进一步应用奠定基础.
黑色素瘤是一种常见于皮肤的恶性肿瘤,也可见于视网膜或转移至其它深部组织,而且近年来我国黑色素瘤发病呈上升趋势.我们应用一对通用引物成功地从培养的杂交瘤细胞中克隆了抗体可变区基因.序列分析表明与已发表的小鼠抗体可变区基因序列有较高的同源性[2～4],可编码正确的小鼠抗体可变区.该单链抗体基因的表达及基因工程改造正在进行中.
致　谢　金伯泉教授,张新海硕士提供及培养杂交瘤细胞.赵中良博士,高辉实验师在论文写作中给予帮助.
参考文献
1L evy LA,L ee HM,Kaw ahata R T et al.Purificati on of mono2
clonal antibodies from mouse ascites eli m inates contanm inating infecti ous mouse type C viruses and nucleic acids.C lin Exp I m2 m uno l,1984;56(1):114～120
2Po lym enisM,Sto llar BD.C ritical binding site am ino acids of an2 ti2z2DNA single chain Fv mo lecules.J I mm uno l,1994;152(14): 5318～5328
3D ennis YL,A lfred LM,M ary E et al.M o lecular basis of a mouse strain2specific anti2hep ten response.Cell,1983;33(1): 85～93
4W eaver D,M oem a H,A lbanese C et al.A ltered reperto ire of endogenous Ig gene exp ressi on in transgenic m ice containing a rearranged M u heavy chain gene.Cell,1986;45(2):247～259 5H an H,O kamo to M,Honj o T et al.R egulated exp ressi on of Ig trans2mRNA consisting of the variable regi on of transgenic chain and constant regi ons of endogenes iso types.Int I mm uno l,1991; 3(12):1197～1206
6M o rison SL,Johnson M J,Ro senberg LA et al.Ch i m eric hum an antibody mo lecules:mouse antigen2binding dom ains w ith hum an constant regi on dom ains.P roc N atl A cid Sci U SA,1984;81 (22):6851～6855
7R ichm ann L,C lark M,W aldm an H et al.R eshap ing hum an an2 tibodies fo r therapy.N ature,1988;322(6159):323～327
8W ard ES,Gusson D,Griffith s AD et al.B inding activities of a reperto ire of single Ig variable dom ains secreted from E.co li. N ature,1989;341(6242):544～546
9杨安钢,吉昌华,韩　骅et al.抗人CD8单抗ϑ轻链可变区基因的克隆和序列测定.生物化学与生物物理进展,1992;19(4): 286～288
10Couto JR,Padlan EA,B lank E W et al.H um anizati on of KC4G3,an anti2hum an carcinom a antibody.H ybridom a, 1994;13(2):215～220
11M atina E,Boersch S,Sadhana A et al.H eavy chain variable re2 gi on.J Exp M ed,1985;161(6):1272～1292
(收稿1996-05-03　修回1996-08-29)
编辑　黄良田
文　摘
抗凋零基因B cl22产物在口腔粘膜相关性淋巴瘤中的表达及意义
[高玉好,杨连甲,黄高升et a l.中华口腔医学杂志,1996;31(5):278～280]
抗凋零基因Bcl22可抑制细胞凋零,促进细胞增殖,与部分肿瘤的发生相关.作者利用免疫组织化学技术观察了26例口腔粘膜相关性淋巴瘤中Bcl22基因产物的表达,以探讨Bcl22表达与该肿瘤组织类型、免疫表型等之间的关系.结果表明,26例口腔粘膜相关性淋巴瘤中,73%的病例Bcl22产物阳性.在三种主要组织类型中,小裂细胞样淋巴瘤阳性率最高(83%),其次为浆细胞样淋巴瘤(71%)和浆细胞性淋巴瘤(51%),相互间差异有显著性(P<0.01).在可进行免疫分型的20例中,B 细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤及不可分类淋巴瘤的Bcl22产物阳性率依次分别为69%,75%和83%(P<0.01).结果提示,细胞自然凋零过程的抑制可能是部分口腔粘膜相关性淋巴瘤的发生原因之一.(王小仲)。