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分子生物学复习题（含答案）一、单选题（共100题，每题1分，共100分）1、有关 SNP 位点的描述,不正确的是A、生物芯片技术可提高 SNP 位点的检测准确性B、单个 SNP 位点信息量大,具广泛的应用前景C、在整个基因组中大概有 300 万个 SNP 位点D、被称为第三代 DNA 遗传标志E、SNP 位点是单个核苷酸的变异正确答案：A2、硝酸纤维素膜最大的优点是( )A、高结合力B、非共价键结合C、本底低D、脆性大E、共价键结合正确答案：C3、关于核酸探针的种类下列不正确的是A、cDNA 探针B、寡核苷酸探针C、基因组 DNA 探针D、RNA 探针E、双链 DNA 探针正确答案：E4、目前白血病的发病机制的研究主要集中的领域不包括A、融合基因与白血病B、白血病复发的后天因素C、白血病发病的先天因素D、遗传学疾病及白血病发病的后天因素E、基因多态性与白血病正确答案：B5、下列属于抑癌基因的是( )A、c-erb-2B、mycC、sisD、p53E、ras正确答案：D6、下列有关 cDNA 探针的描述不正确的为A、利用 mRNA 通过 RT-PCR 在体外反转录可制备大量的 cDNA 探针B、cDNA 探针不包含内含子C、cDNA 探针不包含大量的高度重复序列D、由于 cDNA 探针自身所携带的 poly(dT),有可能产生非特异性杂交的问题E、cDNA 探针合成方便,成为探针的重要来源正确答案：E7、一种标记核酸与另一种核酸单链进行配对形成异源核酸分子的双链,这一过程称A、探针B、杂交C、变性D、复杂性E、复性正确答案：B8、SYBR Green Ⅰ技术常要求扩增片段不大于A、50bpB、100bpC、200bpD、300bpE、400bp正确答案：D9、DNA 指纹分子的遗传性基础是A、连锁不平衡B、MHC 的多样性C、DNA 的多态性D、反向重复序列E、MHC 的限制性正确答案：C10、以等位基因特异的寡核苷酸探针杂交法诊断某常染色体隐性遗传病时,若能与突变探针及正常探针接合,则该样本为A、正常人B、不能确定C、纯合体患者D、杂合体患者E、携带者正确答案：E11、目前细菌表型分型的方法不包括A、血清学分型B、分子分型C、噬菌体分型D、生化分型E、抗生素敏感性分型正确答案：B12、不适宜于直接作为第一代测序技术测序的 DNA 模板( )A、双链 DNA 片段和 PCR 产物B、单链 DNA 片段C、克隆于质粒载体的 DNA 片段D、克隆于真核载体的 DNA 片段E、提取的染色质 DNA正确答案：E13、定点诱发突变可以通过以下哪个过程获得:A、PCRB、LCRC、RT-PCRD、SSCPE、ASO正确答案：A14、基因诊断对下列哪些疾病最具有确切的临床诊断意义A、肿瘤B、染色体疾病C、畸形D、单基因遗传病E、多基因遗传病正确答案：D15、下列关于细菌感染性疾病的分子生物学检验说法错误的是A、可以检测不能或不易培养、生长缓慢的病原菌B、可以实现对感染细菌的广谱快速检测C、可以对细菌进行基因分型D、可以检测病原菌耐药基因E、其检验技术都是 PCR 及其衍生技术正确答案：E16、操纵子结构不存在于:A、原核生物基因组中B、细菌基因组中C、大肠杆菌基因组中D、真核生物基因组中E、病毒基因组中正确答案：D17、分离纯化核酸的原则是( )A、保证一定浓度B、保持一级结构完整并保证纯度C、保持二级结构完整并保证纯度D、保持空间结构完整E、保证纯度与浓度正确答案：B18、关于切口平移法下述不正确的是A、可标记线性 DNAB、可标记松散螺旋 DNAC、可标记超螺旋 DNAD、可标记存在缺口的双链 DNAE、可标记随机引物正确答案：E19、未知突变的检测,下列最准确的方法是A、PCRB、RFLPC、核酸杂交D、序列测定E、ASO正确答案：D20、用于病毒基因突变检测的技术是A、荧光定量 PCR 技术B、PCR-RFLP 技术C、PCR 微卫星检测技术D、原位杂交技术E、cDNA 表达芯片技术正确答案：B21、有关微卫星的描述正确的是A、散在重复序列的一种B、10~100bp 组成的重复单位C、主要存在于着丝粒区域,通常不被转录D、形式为(CA)n/(TG)n、(AG)n、(CAG)n 等E、又称为可变数目串联重复序列(VNTR)正确答案：D22、关于抑癌基因的说法正确的是A、呈隐性作用方式B、可以使细胞丧失生长控制和正性调控功能C、是一类可编码对肿瘤形成起促进作用的蛋白质的基因D、抑癌基因又称为肿瘤分化抑制基因E、正常情况下促进细胞增殖、抑制细胞分化正确答案：A23、决定 PCR 反应特异性的是A、模板B、dNTPC、引物D、缓冲液E、Taq DNA 聚合酶正确答案：C24、关于 DNA 芯片原位合成法的描述错误的是:A、也称在片合成B、直接在芯片上用四种核苷酸合成所需探针C、包括光导原位合成法D、包括原位喷印合成法E、包括直接点样法正确答案：E25、可作为分子遗传标记的是A、HLAB、单拷贝序列C、高表达蛋白D、RFLPE、染色体正确答案：D26、为了避免反复冻融对核酸样品产生的破坏作用,最好( )A、将核酸溶解保存B、将核酸小量分装保存C、将核酸冻干保存D、将核酸沉淀保存E、将核酸大量保存正确答案：B27、GeneXpert 全自动结核检测平台不具有的优势是( )A、检测高度自动化B、单标本单试剂检测,避免浪费C、检测快速准确D、同时检测 TB 与利福平耐药E、检测费用低廉正确答案：E28、Sanger 双脱氧链终止法使用的链终止物是A、α-32P-dNTPB、dNTPC、ddNTPD、α-35S-dNTPE、NTP正确答案：C29、导致世界范围内性传播疾病的最为普遍的因素是A、肺炎衣原体B、豚鼠衣原体C、沙眼衣原体D、鹦鹉热衣原体E、鼠衣原体正确答案：C30、实时荧光 PCR 中,GC 含量在 20%~80%(45%~55%最佳),单链引物的最适长度为A、35~50bpB、15~20bpC、5~70bpD、5~20bpE、70~90bp正确答案：B31、Southern 杂交通常是指( )A、DNA 与 RNA 杂交B、DNA 与 DNA 杂交C、RNA 与 RNA 杂交D、蛋白质与蛋白质杂交E、DNA 与蛋白质杂交正确答案：B32、具有碱基互补区域的单链又可以重新结合形成双链,这一过程称A、杂交B、变性C、复杂性D、复性E、探针正确答案：D33、第二代测序技术不能应用于A、从头测序、重测序B、转录组及表达谱分析C、小分子 RNA 研究D、个体基因组测序和 SNP 研究E、直接测甲基化的 DNA 序列正确答案：E34、目前已知感染人类最小的 DNA 病毒( )A、HIVB、HPVC、HBVD、HAVE、HCV正确答案：C35、下列方法中不属于 RNA 诊断的是A、Northern blotB、RNA 斑点杂交C、基因芯片D、mRNA 差异显示 PCR 技术E、逆转录 PCR正确答案：C36、RNA/RNA 杂交体的 Tm 值一般应增加A、1-5℃B、5~10℃C、10~15℃D、15~20℃E、20~25℃正确答案：E37、下列属于核苷酸三联体重复序列发生高度重复所致的是A、珠蛋白生成障碍性贫血B、脆性 X 综合症C、迪谢内肌营养不良D、血友病E、镰状细胞贫血正确答案：B38、逆转录 PCR 扩增最终产物的特异性由A、随机引物决定B、oligo-d(T)决定C、PCR 扩增的特异引物决定D、扩增效率决定E、逆转录酶决定正确答案：C39、检测融合基因、确定染色体易位的首选方法是A、FISHB、RT-PCRC、实时定量 PCRD、PCRE、DNA 芯片正确答案：D40、单基因遗传病分子诊断的主要应用是A、产前诊断B、携带者筛查C、症状前诊断D、携带者诊断E、耐药基因检测正确答案：A41、乳腺癌分子生物学检测的意义不包括A、预测早期乳腺癌复发、转移的风险B、筛选易感人群C、帮助减轻化疗的不良反应D、反映肿瘤的生物学行为E、筛选适合内分泌、化疗及靶向治疗的患者正确答案：C42、线粒体基因组与核基因组之间,下面描述不正确的是A、线粒体基因组与核基因组分别在不同的位置进行自主复制和转录,之间互不影响B、mtDNA 突变可引起编码蛋白功能障碍,影响细胞呼吸、氧化功能,进而影响核 DNA 的表达C、mtDNA 自主性复制,但复制所需的酶、调控因子等由核基因编码D、二者虽在地理位置上独立,但二者之间关系十分密切E、线粒体基因组与核基因组之间存在“交叉对话”,相互影响,相互协调正确答案：A43、STR 法医鉴定的基础是A、孟德尔遗传定律B、蛋白质空间结构C、基因扩增技术D、碱基配对原则E、基因多态性正确答案：A44、以下哪种酶可用于 PCR 反应( )A、KlenowB、HindⅢC、Taq DNA 聚合酶D、RNaseE、Dnase正确答案：C45、下列不能用于核酸转移作固相支持物的是A、NC 膜B、尼龙膜C、化学活性膜D、滤纸E、PVC 膜正确答案：E46、Southern 印迹杂交的描述正确的是A、不仅可以检测 DNA 样品中是否存在某一特定的基因,而且还可以获得基因片段的大小及酶切位点分布的信息B、检测靶分子是 RNAC、用于基因定位分析D、用于阳性菌落的筛选E、用于蛋白水平的检测正确答案：A47、在下列何种情况下可考虑进行基因连锁检测方法进行基因诊断A、表达异常B、基因结构变化未知C、点突变D、基因片段缺失E、基因片段插入正确答案：B48、关于 mtDNA 非编码序列,描述正确的是A、不参与 mtDNA 的复制、转录等,属于“无用”信息B、是高度重复序列C、占整个 mtDNA 的 15%,比例较大D、mtDNA 中有两段非编码区E、位于 mtDNA 的轻链正确答案：D49、变性梯度凝胶电泳的描述中错误的是A、使 DNA 双链分子局部变性B、采用梯度变性凝胶C、变性难易由核苷酸组成决定D、突变检测率高E、可确定突变位置正确答案：E50、以下对镰刀状红细胞贫血症叙述正确的是( )A、血红蛋白的β链第 6 位由谷氨酸残基变成苯丙氨酸残基B、血红蛋白的β链第 6 位由谷氨酸残基变成甘氨酸残基C、血红蛋白的β链第 6 位由谷氨酸残基变成丝氨酸残基D、血红蛋白的β链第 6 位由谷氨酸残基变成缬氨酸残基E、血红蛋白的β链第 6 位由谷氨酸残基变成异亮氨酸残基正确答案：D51、关于测序策略的叙述正确的是A、应该具有最大重叠、最小数量的测序反应B、最小的目的 DNA 片段(如<1kb),可以使用引物步移法C、最小的目的 DNA 片段(如<1kb),可以使用随机克隆法D、大片段未知序列 DNA 测序,可以直接测序E、大规模基因组计划,可以使用多个测序策略正确答案：E52、组织 DNA 提取中,EDTA 的作用是A、抑制 DNaseB、沉淀 DNAC、减少液体表面张力D、抑制 RNaseE、去除蛋白质正确答案：A53、寡核苷酸探针的 Tm 简单计算公式为A、Tm=4(G+C)+2(A+T)B、Tm=2(G+C)+4(A+T)C、Tm=6(G+C)+4(A+T)D、Tm=2(G+C)+6(A+T)E、Tm=6(G+C)+2(A+T)正确答案：A54、对于 BRCA 基因突变的检测,以下最常用的方法是A、变性高效液相色谱法B、单链构象多态性分析C、变性梯度凝胶电泳D、异源双链分析E、直接 DNA 序列分析正确答案：E55、下列关于人类遗传病的叙述不正确的是A、人类遗传病是指由于遗传物质改变而引起的疾病B、遗传性疾病既可以直接诊断,也可以间接诊断C、人类遗传病包括单基因遗传病、多基因遗传病和染色体异常遗传病D、21-三体综合症患者体细胞中染色体数目为 47 条E、单基因病是指受一个基因控制的疾病正确答案：E56、第一个被发现可以预测晚期转移性结直肠癌患者是否能从靶向治疗药物西妥昔单抗中获益的生物标志物是A、K-rasB、EGFR 基因C、TTF-1D、CEAE、bcl-2 基因正确答案：A57、下列方法中能同时检测几种疟原虫混合感染的是A、竞争 PCRB、巢式 PCRC、多重 PCRD、普通 PCRE、PCR-RFLP正确答案：C58、关于 PCR-RFLP 错误的是A、采用特定的限制性内切酶对 PCR 产物进行处理B、对酶切后的片段长度进行分析C、判断有无点突变D、突变位点不必在限制酶识别序列中E、需先进行 PCR 扩增正确答案：D59、下列哪些技术不适用于鉴定菌种亲缘性:A、随机扩增 DNA 多态性分析B、连接酶链反应C、PCR-RFLPD、多位点测序分型E、DNA 测序技术正确答案：B60、点/狭缝杂交可以用于A、快速确定是否存在目的基因B、不仅可以检测 DNA 样品中是否存在某一特定的基因,而且还可以获得基因片段的大小及酶切位点分布的信息C、用于基因定位分析D、阳性菌落的筛选E、蛋白水平的检测正确答案：A61、DNA 提取中不能有效去除蛋白质的是A、酚/氯仿抽提B、SDSC、高盐洗涤D、蛋白酶 KE、RNase正确答案：E62、宫颈癌与 HPV 病毒感染密切相关,宫颈癌细胞产生的机制是A、HPV DNA 大量复制B、原癌基因被激活C、病毒增殖导致细胞破裂D、HPV 导致细胞凋亡E、病毒蛋白在细胞内堆积正确答案：B63、纯 DNA 的 A260/A280 比值为 1.8,可使比值升高的是:A、蛋白质B、酚C、RNAD、氯仿E、Mg2+正确答案：C64、关于 TaqMan 探针技术的描述,不正确的是A、R 基团与 Q 基团相距较远,淬灭不彻底,本底较高B、易受到 Taq DNA 聚合酶5’→3’核酸外切酶活性的影响C、操作亦比较简单D、不需要进行寡核苷酸熔解曲线分析,减少了实验时间E、解决了荧光染料技术非特异性的缺点正确答案：C65、基因芯片技术的本质是( ):A、核酸分子杂交B、蛋白质分子杂交技术C、连接酶链反应D、DNA 重组技术E、酶切技术正确答案：A66、编码 HIV 衣壳蛋白的是A、env 基因B、gag 基因C、vif 基因D、tat 基因E、pol 基因正确答案：B67、HIV 核酸类型是A、单链 DNAB、双链 DNAC、单正链 RNAD、单正链 RNA 双聚体E、单负链 RNA正确答案：D68、检测靶序列是 DNA 的技术是:A、Southern 杂交B、Western 杂交C、Northern 杂交D、Eastern 杂交E、杂交淋巴瘤正确答案：A69、HCV 的核酸是A、+ssRNAB、dsRNAC、dsDNAD、ssDNAE、-ssRNA正确答案：A70、关于 Sanger 双脱氧链终止法叙述错误的是A、每个 DNA 模板需进行一个独立的测序反应B、需引入双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)作为链终止物C、链终止物缺少3’-OH,使链终止D、测序反应结果是产生 4 组不同长度的核苷酸链E、高分辨率变性聚丙烯酰胺凝胶电泳可分离仅差一个核苷酸的单链 DNA 正确答案：A71、PCR 中的脱氧核苷三磷酸不包括A、dATPB、dTTPC、dCTPD、dGTPE、dUTP正确答案：E72、以 mRNA 为模板合成 cDNA 的酶是A、DNA 酶B、Taq DNA 聚合酶C、限制性内切酶D、RNA 酶E、逆转录酶正确答案：E73、结核杆菌的分子生物学检验临床意义中不包括A、早期诊断B、耐药检测C、鉴别诊断D、疗效评价E、快速诊断正确答案：A74、目前被 DNA 自动化测序技术广泛采用的酶是A、大肠杆菌 DNA 聚合酶ⅠB、Klenow 片段C、测序酶D、耐热 DNA 聚合酶E、限制性内切核酸酶正确答案：D75、结构基因突变不包括A、基因表达异常B、基因点突变C、基因扩增D、基因缺失E、基因重排正确答案：A76、点突变引起的血友病 A 的分子诊断方法不包括A、PCR-SSCPB、PCR-RFLPC、PCR-VNTRD、PCR-STRE、长距离 PCR正确答案：E77、大肠杆菌类核结构的组成是A、双链 DNAB、RNAC、蛋白质+DNAD、支架蛋白E、RNA+支架蛋白+双链 DNA正确答案：E78、作为芯片固相载体的材料描述正确的是A、主要有玻片、硅片等实性材料B、不使用硝酸纤维素膜、尼龙膜及聚丙烯膜等膜性材料C、这些载体材料不需要处理,其表面存在活性基团(如羟基或者氨基)D、可以直接固定已经合成的寡核苷酸探针E、不需要对介质表面进行化学预处理--活化正确答案：A79、不属于脆性 X 综合征分子诊断人群的是A、已明确母亲为携带者的婴儿B、没有 FraX 家族史C、发育迟缓或自闭症的患者D、未诊断的 MR 家族史E、有 FraX 体格或性格阳性征象者正确答案：B80、关于人工合成的寡核苷酸探针,下列描述不正确的是A、特异性高B、可依赖氨基酸序列推测其序列C、分子量小D、可用于相似基因顺序差异性分析E、可用末端转移酶进行5’端标记正确答案：E81、下列哪一种病毒的遗传物质为 RNA( )A、乙肝病毒B、乳头瘤状病毒C、疱疹病毒D、人类免疫缺陷病毒E、腺病毒正确答案：D82、下列几种 DNA 分子的碱基组成比例,哪一种的 Tm 值最高( )A、A+T=15%B、G+C=25%C、G+C=40%D、A+T=80%E、G+C=60%正确答案：A83、关于逆转录 PCR 的描述,不正确的是A、首先应将 RNA 转化为 cDNA 才能进行 PCRB、除了使用 DNA 聚合酶外,还应使用逆转录酶C、模板为 RNAD、oligo-d(T)理论上可以将所有的 mRNA 进行逆转录反应E、逆转录酶不需要引物进行逆转录反应正确答案：E84、一个完整的生物芯片配套软件不包括A、统计分析软件B、生物芯片的图像处理软件C、画图软件D、生物芯片扫描仪的硬件控制软件E、数据提取软件正确答案：C85、线粒体疾病的遗传特征是A、女患者的子女约 1/2 发病B、母系遗传C、发病率有明显的性别差异D、交叉遗传E、近亲婚配的子女发病率增高正确答案：B86、在人类基因组中,编码序列占的比例为A、23%B、1.5%C、3%D、21%E、5%正确答案：B87、乙型肝炎病毒的核酸类型是( )A、双股 DNAB、负股 DNAC、正股 DNAD、单股 DNAE、DNA-RNA 二聚体正确答案：A88、对于相同大小的核酸片段,最快的转移方法是A、电转移B、真空转移C、毛细管电泳D、向下虹吸转移E、虹吸转移正确答案：B89、延伸的温度通常为A、95℃B、55℃C、37℃D、72℃E、25℃正确答案：D90、在 pH 为下述何种范围时,Tm 值变化不明显A、pH 为 5~9B、pH 为 3~5C、pH 为 5~6D、pH 为 8~11E、pH 为 4~5正确答案：A91、标记的参与杂交反应的核酸分子称为A、复性B、复杂性C、杂交D、变性E、探针正确答案：E92、对于镰刀状红细胞贫血的基因诊断不可以采用( ):A、PCR-RFLPB、DNA 测序C、核酸分子杂交D、设计等位基因特异性引物进行 PCRE、Western blot正确答案：E93、与耳聋有关的最主要的 mtDNA 突变是A、点突变B、插入或缺失C、大片段重组D、拷贝数变异E、异质性突变正确答案：A94、荧光原位杂交的描述正确的是A、快速确定是否存在目的基因B、检测靶分子是 RNAC、用于基因定位分析D、用于阳性菌落的筛选E、用于蛋白水平的检测正确答案：C95、第三代测序技术的最主要特征:A、对单分子 DNA 进行非 PCR 的测序B、对 SNP 进行非 PCR 的测序C、高通量和并行 PCR 测序D、直接分析 SNPE、直接进行个体基因组测序和 SNP 研究正确答案：A96、关于 DNA 变性的描述不正确的是A、二级结构破坏B、一级结构破坏C、黏度降低D、生物活性丧失E、浮力密度增加正确答案：B97、下列不能被列入可移动基因范畴的是A、插入序列B、质粒C、染色体 DNAD、转座子E、可转座噬菌体正确答案：C98、生物芯片根据芯片上固定的探针种类不同可分为几种,不包括:A、DNA 芯片B、蛋白质芯片C、细胞芯片D、组织芯片E、测序芯片正确答案：E99、DNA 芯片的固相载体不可以用A、半导体硅片B、玻璃片C、滤纸D、硝酸纤维素膜E、尼龙膜正确答案：C100、DNA 自动化测序技术一般用不到的技术是A、Sanger 的双脱氧链终止法B、Maxam 和 Gilbert 的化学降解法C、荧光标记技术D、PCR 技术E、电泳技术正确答案：B。
一、名词解释：1. 基因：基因是位于染色体上的遗传基本单位,是负载特定遗传信息的DNA片段,编码具有生物功能的产物包括RNA和多肽链;2. 基因表达：即基因负载遗传信息转变生成具有生物学功能产物的过程,包括基因的激活、转录、翻译以及相关的加工修饰等多个步骤或过程;3.管家基因：在一个生物个体的几乎所有组织细胞中和所有时间段都持续表达的基因,其表达水平变化很小且较少受环境变化的影响;如GAPDH、β-肌动蛋白基因;4. 启动子：是指位于基因转录起始位点上游、能够与RNA聚合酶和其他转录因子结合并进而调节其下游目的基因转录起始和转录效率的一段DNA片段;5.操纵子：是原核生物基因表达的协调控制单位,包括有结构基因、启动序列、操纵序列等;如：乳糖操纵子、色氨酸操纵子等;6.反式作用因子：指由其他基因表达产生的、能与顺式作用元件直接或间接作用而参与调节靶基因转录的蛋白因子转录因子;7.顺式作用元件：即位于基因附近或内部的能够调节基因自身表达的特定DNA序列;是转录因子的结合位点,通过与转录因子的结合而实现对真核基因转录的精确调控;8. Ct值：即循环阈值cycle threshold,Ct,是指在PCR扩增过程中,扩增产物的荧光信号达到设定的荧光阈值所经历的循环数;它与PCR扩增的起始模板量存在线性对数关系,由此可以对扩增样品中的目的基因的模板量进行准确的绝对和或相对定量;9.核酸分子杂交：是指核酸分子在变性后再复性的过程中,来源不同但互不配对的核酸单链包括DNA和DNA,DNA和RNA,RNA和RNA相互结合形成杂合双链的特性或现象,依据此特性建立的一种对目的核酸分子进行定性和定量分析的技术则称为分子杂交技术;10. 印迹或转印：是指将核酸或蛋白质等生物大分子通过一定的方法转移并固定至尼龙膜等支持载体上的一种方法,该技术类似于用吸墨纸吸收纸张上的墨迹;11. 探针：是一种用同位素或非同位素标记核酸单链,通常是人工合成的寡核苷酸片段;12. 基因芯片：又称DNA芯片或DNA微阵列,是基于核酸分子杂交原理建立的一种对DNA进行高通量、大规模、并进行分析的技术,其基本原理是将大量寡核苷酸分子固定于支持物上,然后与标记的待测样品进行杂交,通过检测杂交信号的强弱进而对待测样品中的核酸进行定性和定量分析;13. 基因文库：是指通过克隆方法保存在适当宿主中的一群混合的DNA分子,所有这些分子中的插入片段的总和,可代表某种生物的全部基因组序列或全部的mRNA 序列,因此基因文库实际上是包含某一生物体或生物组织样本的全部DNA序列的克隆群体;基因文库包括两类：基因组文库和cDNA文库;14. 克隆：是来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合;15. 载体：为携带的目的基因,实现其无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子;16. 限制性核酸内切酶：识别DNA的特意序列,并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶;17. 基因工程Genetic Engineering：又称基因操作gene manipulation、DNA重组DNA recombination,是指采用类似于工程建设的方式,按照预先设计的蓝图,将一种或多种生物体供体的基因育载体在体外进行拼接重组构建成杂种DNA分子,然后转入另一种生物体受体内,以改变生物原有的遗传特性并表达出新的性状;获得新品种,生产新产品,或是研究基因的结构和功能;因此,供体、受体和载体称为基因工程的三大要素,其中相对于受体而言,来自供体的基因属于外源基因;由于DNA 重组分子大都需在受体细胞中复制扩增,故还可以将基因工程表征为分子克隆Molecular Cloning或基因的无性繁殖;18. 目的基因：感兴趣的基因或DNA序列;19.生长因子：growth factor通过质膜上特异的受体,将信息传递至细胞内部,调节细胞生长与增殖的多肽类物质;20. 基因组：泛指一个生命体、病毒或细胞器的全部遗传物质;21. 蛋白质组：指一个细胞内的全套蛋白质,反映了特殊阶段、环境状态下,细胞或组织在翻译水平的蛋白质表达谱;22. 人类基因组计划：是美国科学家于1986年率先提出,1990年正式启动的,这一计划的目标是为30亿个碱基对构成的人类基因组精确测序,从而最终弄清楚每种基因产生的蛋白质及其作用,它的实施将会为认识疾病的分子机制以及诊断和治疗提供重要依据;23. 基因诊断：利用现代分子生物学和分子遗传学的技术方法直接检测基因结构及其表达水平是否正常,从而对人体状态和疾病做出诊断的方法;24. 基因治疗：从广义来说,将某种遗传物质转移到患者细胞内,使其在体内发挥作用而达到治疗疾病目的的方法均称为基因治疗;25. 基因替换：用正常的基因通过体内基因同源重组,原位替换病变细胞内的致病基因,使细胞内DNA完全恢复正常状态的基因治疗方法;26. 自杀基因：某些病毒或细菌的基因所表达的酶能将对人体无毒或低毒的药物在人体细胞内转变为细胞毒性产物,从而导致携带该基因的受体细胞也被杀死,故称这类基因为“自杀基因”;27. 转录组：是一个细胞内的一套RNA转录物,包含了某一环境条件下、某一生命阶段、某一生理或病理状态下,生命体的细胞或组织所表达的基因种类及水平; 28.癌基因：oncogene细胞内控制细胞生长和分化的基因,它的结构异常或表达异常,可以引起细胞癌变;29. 病毒癌基因：存在于肿瘤细胞中,能使靶细胞发生恶性转化的基因;30. 抑癌基因：也称为抗癌基因;抑癌基因的产物是抑制细胞增殖,促进细胞分化,和抑制细胞迁移,因此起负调控作用,抑癌基因的突变是隐性的也称抗癌基因;抑癌基因的产物是抑制细胞增殖,促进细胞分化,和抑制细胞迁移,因此起负调控作用,抑癌基因的突变是隐性的;31. 结构基因组学：是以全基因组测序为目标的基因结构研究,弄清楚基因组中全部基因的位置和结构,为基因功能的研究奠定基础;其主要内容就是制作高分辨率的人类基因组的遗传图和物理图,最终完成人类其他重要模式生物全部基因组DNA 序列测定;二、问答题1.以乳糖操纵子为模型解释原核生物转录水平的调控模式转录水平的调节——操纵子调控模式1操纵子的概念：操纵子是原核生物基因表达的协调控制单位,包括有结构基因、启动序列、操纵序列等;如：乳糖操纵子、色氨酸操纵子等;2乳糖操纵子的结构：乳糖操纵子包括调节基因I、一个操纵序列O、一个启动序列P以及单个结构基因Z、Y、A;其中调节基因I编码生成阻遏蛋白,后者与操纵序列结合；RNA聚合酶与启动序列结合；分解代谢物基因激活蛋白CAP也结合在操纵序列附近；结构基因Z、Y和A分别编码三个与乳糖代谢有关的酶,即：β-半乳糖苷酶,透酶和乙酰转移酶;这三个酶的基因作为一个整体由同一个调控区调节,以实现基因的协调表达;3其调节机制主要有正性和负性两种模式;①阻遏蛋白的负性调节：当没有乳糖时,调节基因表达生成阻遏蛋白,阻遏蛋白结合操纵子序列出,阻碍RNA结合酶与启动序列结合,抑制结构基因的转录启动,此时操纵子处于阻遏状态；当有半乳糖存在时,乳糖首先被转变成半乳糖,半乳糖则作为一种诱导剂与阻遏蛋白结合,诱发蛋白质构象改变,使阻遏蛋白从启动序列上解离下来,从而启动结构基因的转录,此时操纵子处于诱导状态;②CAP的正性调节：当没有葡萄糖时,cAMP浓度升高,与CAP结合,CAP进而结合在启动序列附近,从而进一步促进结构基因的转录;当有葡萄糖时,cAMP浓度降低,结合在启动序列附近的CAP减少,结构基因转录速率降低;③协调调节：实际情况下,上述两种调节方式是相辅相成、相互协调的;譬如：在无乳糖且有葡萄糖时,阻遏蛋白负性调节起作用,此时结构基因不被转录；在有乳糖且有葡萄糖时,阻遏蛋白负性调节不起作用,此时结构基因转录水平低；在有乳糖且无葡萄糖时,阻遏蛋白的抑制作用不解除,CAP正性调节被激活,此时结构基因的转录水平最高;2.生长因子的作用机制生长因子由不同的细胞的细胞合成后分泌,作用于靶细胞上的相应受体,这些受体有的是位于细胞膜上的,有的是位于细胞内部;生长因子与受体结合后,激活细胞内信号传递体系,产生相应的生物学作用;根据受体的分布和对生长因子不同的响应,生长因子是作用机制分为三种情况：①生长因子与具有酪氨酸蛋白激酶TPK 活性的跨膜受体结合,TPK 被活化,磷酸化相应蛋白质,产生生理效应;②与膜上受体结合,通过胞内信息传递,产生第二信使,是蛋白激酶活化,再磷酸化相应的效应蛋白质,这些被磷酸化的蛋白质再活化核内的转录因子,引发基因转录,达到调节生长与分化的作用;③与膜内受体结合,形成生长因子-受体复合物,进入胞核活化相关基因,促进细胞生长;3.常规PCRDNA①变性denature ：模板DNA 经加热至95℃左右一定时间后,使模板DNA 双链或经PCR 扩增形成的双链DNA 解离,使之成为单链,以便它与引物结合,为下轮反应作准备;②退火annealing 复性：模板DNA 经加热变性成单链后,将温度降至引物的Tm 值左右或以下55℃左右,引物与模板DNA 单链的互补序列配对结合,形成杂交链; ③延伸extension ：DNA 模板-引物结合物在TaqDNA 聚合酶的作用下,以dNTP 为反应原料,靶序列为模板,按碱基配对与半保留复制原理,合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链;以上三步为一个循环,约需2~4分钟,每一循环的产物作为下一个循环的模板,如此循环30次,大约2~3小时后,新生DNA片段理论上可达到2n-1个分子拷贝;4.定量PCR技术的基本原理基本原理：将荧光信号强弱与PCR扩增情况结合在一起,通过监测PCR反应管内荧光信号的变化来实时检测PCR反应进行的情况,PCR反应管内的荧光信号强度达到设定阈值所经历的循环数即Ct值与扩增的起始模板量进行准确的绝对和或相对定量;循环阈值cycle threshold,Ct是指在PCR扩增过程中,扩增产物的荧光信号达到设定的荧光阈值所经历的循环数;荧光阈值threshold一般是以PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号baseline,缺省设置是3~15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍;实际上就是荧光信号开始由本底信号进入指数增长阶段的拐点时的荧光信号强度;5.Sanger测序法的基本原理Sanger法也称双脱氧链末端终止法,是目前应用最为广泛的方法;基本原理：它巧妙地利用了DNA复制的原理,是利用ddNTP来代替常规的dNTP 作为底物进行DNA合成反应;在DNA合成时,一旦ddNTP参入到合成的DNA链中,由于ddNTP脱氧核糖的3'-位碳原子上缺少羟基而不能与下一位核苷酸的5'-位磷酸基之间形成3',5'-磷酸二酯键,从而使得正在延伸的DNA链在此ddNTP处终止;6.Southern印迹、Northern印迹的异同相同点：基本流程相似不同点：7.基因工程中如何选择载体基因工程选择载体的标准如下：①能自主复制②具有两个以上的遗传标记物,便于重组体的筛选和鉴定③有克隆位点外源DNA插入点,常具有多个单一酶切位点,称为多克隆位点④分子量小,以容纳较大的外源DNA8.重组DNA技术的基本步骤重组DNA技术的基本操作过程可形象的归纳为“分、切、接、转、筛”,即“目的基因的获取→克隆载体的选择和构建→外源基因与载体的连接→DNA导入受体细胞→重组体的筛选→克隆基因的表达”;分述如下：①目的基因的获取;可通过化学合成法、基因组DNA文库、cDNA文库、PCR等方法获取;②克隆载体的选择和构建;根据实验目的和操作基因的性质选择合适的载体和改建方法;③外源基因与载体的连接;将外援DNA通过DNA连接酶进行共价连接;④DNA导入受体细胞;重组DNA 分子导入相应宿主细胞后,随受体细胞生长、增殖而得以复制、扩增;⑤重组体的筛选根据载体体系、宿主细胞特性及外源基因在受体细胞表达情况,采取直接选择法和非直接选择法进行筛选,获得含有重组DNA分子的克隆;⑥克隆基因的表达;克隆的目的基因如果需要正确而大量表达有特殊意义的蛋白质,则需要建立相应的表达体系,包括表达载体的构建、受体细胞的建立及表达产物的分离、纯化等; 9.目前基因治疗采用的方法分为哪几种基因治疗的方法分为以下：①基因矫正,将致病基因的异常碱基进行纠正,而正常部分予以保留的基因治疗方法；②基因置换,用正常的基因通过体内基因同源重组,原位替换病变细胞内的致病基因,使细胞内DNA完全恢复正常状态的基因治疗方法；③基因增补,将目的基因导入病变或其他细胞,不去除异常基因,通过目的基因的非定点整合,使其表达产物补偿缺陷基因的功能或使原有的功能得以加强的基因治疗方法；④基因失活,将特定的序列导入细胞后,在转录或翻译水平阻断某些基因的异常表达的治疗方法；⑤自杀基因的应用,用某些病毒或细菌的基因所表达的酶能将对人体无毒或低毒的药物前体在人体细胞内转变为细胞毒性产物,从而导致携带该基因的受体细胞也被杀死,故称这类基因为“自杀基因”;10.基因治疗的基本过程基因治疗的基本过程包括：①治疗性基因的选择,选择对疾病有治疗作用的特定目的基因是基因治疗的首要问题；②基因载体的选择,目前使用的载体分病毒性载体和非病毒性载体两类,而一般临床多选用病毒性载体;目前被用作基因转移的病毒有逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒；③靶细胞的选择,根据受体细胞的不同,基因治疗可分为体细胞的基因治疗和生殖细胞的基因治疗,而目前基因治疗禁止使用生殖细胞,仅限于使用体细胞为靶细胞;④基因转移,如何有效地将外源基因导入受体细胞,是基因治疗研究的一个重要环节,可分为非病毒介导的基因转移和病毒介导的基因转移；⑤外源基因表达的筛检,一般利用载体中的标记基因对转染细胞进行筛检,再检测转化细胞中的标记基因表达情况；⑥回输体内,将治疗基因修饰的细胞以不同的方式回输体内以发挥治疗作用;11.人类基因组计划的基本任务及意义HCG内容包括人类基因组作图及序列分析,基因的鉴定、基因组研究技术的建立与创新、模式生物基因组作图和测序、信息系统的建立、存储及相应软件的开发、相关产业的开发等;HCG基本任务可用四张图谱来概括,即遗传图、物理图、转录图基因图、序列图;①遗传图：又称连锁图,是具有遗传多态性的遗传标记作为“位标”,遗传学距离为“图距”的基因组图;需要应用多态性标志——RFLP、VNTR、SNP;②物理图谱：是以一段已知核苷酸的DNA片段为“位标”,以DNA实际长度Mb或kb作为图距的基因组图;③5转录图：是以表达序列标记作为位标,实际上就是人类“基因图”的雏形,又称cDNA图或“表达序列图”;④序列图：也就是人类基因组核苷酸序列图,是分子水平上最高层次、最详尽的物理图;这四张图被誉为人类“分子水平上的解剖图”或“生命元素周期表”,可见其重要性;意义：①鉴定人类的全部基因,推动生物技术的进一步发展；②将把人类带入基因医学的新时代；③推动模式生物基因组的研究；④促进学科交叉与重组;12.什么是基因组学包括哪些内容基因组学于1986年被首次提出,以“人类基因组计划”为诞生标志,由“后基因组计划”的实施推动其发展的一门学科;基因组学的内容亚领域内容结构基因组学整个基因组的遗传制图、物理制图及DNA测序功能基因组学认识、分析整个基因组所包含的基因、非基因序列及其功能比较基因组学比较不同物种整个基因组,增强对各个基因组功能及发育相关性的认识13.蛋白质组学研究的主要内容及方法有哪些蛋白质组是指基因组表达的所有相应的蛋白质；研究细胞内全部蛋白质的组成及其活动规律的科学称为蛋白质组学;蛋白质组研究包括两个方面的内容：一是对蛋白质组成表达模式的研究,二是对蛋白质组功能模式的研究;前者主要采取双向凝胶电泳和质谱技术;后者采用酵母双杂交系统;。
河南农业大学考研专业课《现代分子生物学》课程试卷（含答案）__________学年第___学期考试类型：（闭卷）考试考试时间：90 分钟年级专业_____________学号_____________ 姓名_____________1、分析题（5分，每题5分）1. 根据A基因序列设计原核表达引物。
A基因序列如下：ATGTCCGAAGTAATCGAAGAACATCTTCTCAGCGATAATTCTGATGATTCCAGCTCGGAAT TGACTTCTAC………GGACGAACCACGAAGAGACGATATTAApET28a多克隆位点如下引物设计必须满足：要求在引物两端分别加上BamHI（GGATCC）和EcoRI（GAATTC）。
要求表达的重组蛋白C端带His标签。
答案：设计引物时应注意：（1）酶切位点前后应添加1～6个保护碱基，以提高限制性核酸内切酶的切割效率。
（2）His标签位于酶切位点的下游，且靠近终止密码子，且mRNA的翻译方向是由N端向C端，所以目的片段插入时的顺序不倒转。
（3）引物长度一般在18～27bp，且与目的片段有合适的互补长度以保证引物可以顺利结合。
上游引物可为（5′端至3′端）：CGCGGATCCGCGATGTCCGAAGTA。
下游引物可为（5′端至3′端）：GGCCTTAAGGCCAATTATAGCAGA。
解析：2、判断题（55分，每题5分）1. cDNA文库是包含有细胞中所有mRNA，因此该文库能包含细胞所有的遗传信息。
（）答案：错误解析：cDNA文库不包含有细胞中所有mRNA，因此该文库也不能包含细胞神经细胞所有的遗传信息。
cDNA小说作品只是包含有特定细胞类型和发育中细胞时期的表达信息。
2. 蛋白质在小于等电点的pH溶液中，向阳极移动，而在大于等电点的pH溶液中，将向阴极移动。
（）答案：错误解析：蛋白质在小于等电点的pH溶液中带正电，电泳时向阴极移动；在大于等电点的pH溶液中带负电，色谱法时向阳极移动。
第38卷第2期2024年3月山东理工大学学报(自然科学版)Journal of Shandong University of Technology(Natural Science Edition)Vol.38No.2Mar.2024收稿日期:20230301基金项目:江苏省高校 青蓝工程 项目(2023);江苏省高职院校青年教师企业实践项目(2021QYSJ063);江苏省精准诊疗药物创制工程研究中心(苏州大学)开放课题(SDGC2239)第一作者:谢钰珍,女,295842442@;通信作者:覃鸿妮,女,qinhn@文章编号:1672-6197(2024)02-0067-06基于CRISPR /Cas9基因编辑技术构建PD -L1-GFP 报告基因HT29细胞株谢钰珍1,覃鸿妮1,2,吴凡1,孙曙光1,孟丽君3(1.苏州工业园区服务外包职业学院生物科技学院,江苏苏州215123;2.江苏省精准诊疗药物创制工程研究中心(苏州大学),江苏苏州215000;3.苏州东岭生物技术有限公司,江苏苏州215123)摘要:利用CRISPR /Cas9基因编辑技术和同源重组技术在PD -L1基因的特定位置敲入绿色荧光蛋白(GFP )序列,构建含有PD -L1-GFP 报告基因的结肠癌细胞(HT29)稳定细胞株㊂根据CRISPR -Cas9靶点设计原则,针对PD -L1基因终止密码子设计两对sgRNA ,退火形成双链后连接至Lenti -V2空载质粒中,转化培养后提取质粒并测序验证㊂对于正确的Lenti -V2-sgRNA 重组质粒,T7E1酶切验证其基因编辑效率㊂根据靶点位置设计左同源臂+GFP +右同源臂序列合成Donor 片段,双酶切后连接至pUC19,重组载体转化扩增后同样进行质粒提取和测序验证㊂将验证成功的Lenti -V2-sgRNA 和pUC19-donor -GFP 共转染HT29细胞,荧光显微镜检测GFP 表达情况,菌落PCR 及基因测序验证GFP 报告基因的靶向插入效果㊂经酶切和测序鉴定,靶向编辑PD -L1的Cas9载体Lenti -V2-gRNA 和含GFP 基因的Donor 质粒pUC19-donor -GFP 构建成功㊂两个重组质粒转染HT29细胞后,显微观察㊁多克隆验证㊁单克隆筛选及鉴定结果显示,GFP 成功转入HT29细胞并进行了表达,经有限稀释法筛选出的单克隆细胞荧光均一,且与对照组相比,阳性细胞克隆的基因组PCR 均检测到特异条带,表明在PD -L1终止密码子前成功插入了GFP 片段,细胞株构建成功㊂通过基因编辑技术成功构建了稳定表达PD -L1-GFP 报告基因的HT29结肠癌细胞株,建立了一个可以直观在细胞上观察PD -L1是否表达以及表达的强弱程度的系统,为后期体内外筛选调控PD -L1的上游新靶点及药物奠定了基础㊂关键词:PD -L1;CRISPR /Cas9;报告基因;GFP 中图分类号:TB532.1;TB553文献标志码:AConstruction of HT29cell line with PD -L1-GFPreport gene by CRISPR /Cas9systemXIE Yuzhen 1,QIN Hongni 1,2,WU Fan 1,SUN Shuguang 1,MENG Lijun 3(1.School of Biotechnology,Suzhou Industrial Park Institute of Services Outsourcing,Suzhou 215123,China;2.Jiangsu Province Engineering Research Center of Precision Diagnostics and Therapeutics Development,Soochow University,Suzhou 215000,China;3.Suzhou Dongling Biotechnology Company Limited,Suzhou 215123,China)Abstract :Using CRISPR /Cas9and homologous recombination technology to tap green fluorescent protein (GFP)sequence at specific position of PD -L1gene,we constructed human colon cancer cell (HT29)㊀stable cell line containing PD-L1-GFP reporter gene.According to the design principle of CRISPR-Cas9target,two pairs of sgRNAs were designed for the stop codon of PD-L1gene.After annealing,the sgRNAs were connected to the Lenti-V2plasmid.The plasmid was extracted and verified by sequencing after amplification of the receptor cells.For the correct Lenti-V2-gRNA recombinant plasmid,the effi-ciency of gene editing was verified by T7E1digestion.According to the target location,Donor fragment was synthesized from left homologous arm+GFP+right homologous arm sequence,which was ligated to pUC19after double enzyme digestion.Plasmid extraction and sequencing were also performed after re-combinant vector transformation and amplification.HT29cells were co-transfected with Lenti-V2-gRNA and pUC19-donor-GFP,and the expression of GFP protein was detected by fluorescence microscopy. Finally,the targeted insertion effect of GFP reporter gene was verified by colony PCR and gene sequen-cing.The Cas9vector Lenti-V2-gRNA and Donor plasmid pUC19-donor-GFP containing PD-L1were successfully constructed by enzyme digestion and sequencing.After the two recombinant plasmids were transfected into HT29cells,the results of microscopic observation,polyclonal verification,monoclonal screening and identification showed that GFP was successfully transferred into HT29cells and expressed, and the monoclonal cells screened by limited dilution method had uniform fluorescence.Moreover,com-pared with the control group,specific bands were detected in the genomic PCR of the clones of positive cells,indicating that the GFP fragment was successfully inserted before the PD-L1stop codon,and the cell line was successfully constructed.HT29colon cancer cell line with stable expression of PD-L1-GFP reporter gene was successfully constructed by gene editing technology,and a system was established to di-rectly observe whether PD-L1is expressed and the degree of expression,which laid a foundation for sub-sequent in vitro and in vivo screening of upstream new targets and drugs regulating PD-L1. Keywords:PD-L1;CRISPR/Cas9;reporter gene;GFP㊀㊀PD1(programmed death-1,程序性死亡受体-1)为PDCD1基因编码的Ⅰ型跨膜糖蛋白,主要表达于活化的免疫细胞表面,如T细胞㊁B细胞㊁NK细胞以及单核细胞等㊂PD1是维持自身耐受性的重要因子,在生理条件下可通过TCR识别抗原,调节外周组织中T细胞的功能,从而应对和清除外源病菌及内源异常细胞㊂PD-L1(程序性死亡配体-1)也称CD274,是PD1的配体之一,是由CD274基因编码的一种细胞表面糖蛋白,多过度表达于肿瘤细胞表面[1]㊂作为重要的负性免疫调节因子,当T细胞表面PD1受体与肿瘤细胞表面表达的PD-L1配体结合后,可向细胞内传递调控信号,抑制T细胞活化与增殖,从而帮助肿瘤细胞逃脱宿主的免疫监视,因此,抑制PD1/PD-L1通路或者通过特异性靶点抑制PD-L1蛋白的表达,可有效增强肿瘤治疗效果㊂近年来的临床研究结果显示,由PD1/PD-L1通路介导下的免疫抑制在非小细胞肺癌㊁胃癌㊁乳腺癌㊁大肠癌等多种恶性肿瘤的发生发展中均具有重要作用,PD-L1在以上各种癌组织的表达明显升高,且PD-L1的阳性表达与肿瘤大小㊁转移情况㊁分化程度及远期生存率存在密切关系[2-3];此外,从诱导肿瘤细胞表面高表达PD-L1的相关因素来看,目前已报道的肿瘤细胞中调控PD-L1表达的相关信号通路主要有Akt3信号通路和MAPK信号通路㊁IFN-γ信号通路和AR信号通路[4],而且这些通路的某些抑制剂已被证明可调节PD-L1㊂例如:TGFβR-1抑制剂LY364947可明显降低TGFβR-1诱导的PD-L1mRNA和蛋白表达[5];突变转录因子FOXP3在PD-L1启动子区的结合位点后,胰腺癌细胞PD-L1的表达明显受到抑制[6];但关于结肠癌肿瘤细胞PD-L1表达的具体调控机制仍需进一步研究㊂CRISPR/Cas9系统是一种新型基因编辑技术,通过sgRNA介导核酸酶Cas9对基因组特定位点进行识别㊁切割,从而实现基因编辑,操作相对简便,基因编辑效率高㊂本文利用CRISPR/Cas9技术,在PD-L1基因终止密码子之前插入绿色荧光蛋白GFP基因,通过构建稳定表达PD-L1-GFP报告基因的结肠癌细胞株HT29,旨在建立一个可直观观察细胞上PD-L1是否表达以及表达强弱的系统,为进一步研究结肠癌细胞中PD-L1表达的可能调控机制提供帮助,为后期体内外筛选调控PD-L1的上游新靶点及药物奠定基础㊂86山东理工大学学报(自然科学版)2024年㊀1㊀材料与方法1.1㊀材料HT29细胞和293T细胞(苏州东岭生物技术有限公司保存),Lenti CRISPR V2质粒载体和pUC19载体(苏州东岭生物技术有限公司),胶回收试剂盒(Thermo),Stbl3感受态大肠杆菌(TransGen Biotech),DMEM培养基和D10培养基(HYclone), T4连接酶(Takara公司),DNA聚合酶(NEB)㊂1.2㊀方法1.2.1㊀sgRNA引物的设计与合成根据NCBI查询的PD-L1基因序列,使用CRISP在线设计工具(/E-CRISP/),根据靶点设计原则,在PD-L1基因终止密码子处设计sgRNA,并在序列正义链与反义链的5 端添加Esp3I(BsmBI)酶切位点,合成的具体序列如下:sgRNA-1:GAGGAGACGTAATCCAGCAT gRNA-1-F:CACCGAGGAGACGTAATCCAGCA gRNA-1-R:AAACATGCTGGATTACGTCTCCTC sgRNA-2:GTCTCCTCCAAATGTGTATC gRNA-2-F:CACCGTCTCCTCCAAATGTGTATC gRNA-2-R:AAACGATACACATTTGGAGGAGA为检测突变是否成功,设置了一对检测引物,扩增产物为包含sgRNA靶点的基因组DNA片段,检测引物具体序列如下:Test-F:TGGGGGACAAGCCATCCCAA Test-R:ATGATTTGCTTGGAGGCTCC1.2.2㊀LentiV2-gRNA重组质粒的构建及鉴定根据所设计序列合成单链sgRNA,经梯度降温PCR退火形成双链sgRNA㊂退火结束后,将得到的双链gRNA连接到已用Esp3I酶切回收后的线性Lenti-V2空载质粒中,连接产物转化Stbl3感受态细胞,37ħ培养过夜后挑取阳性单克隆进行测序验证,测序引物:LKO1-5(GACTATCATATGCTTAC-CGT)㊂针对序列正确的单克隆,提取其对应菌液中的质粒DNA,即可得到正确的Lenti-V2-sgRNA重组质粒㊂1.2.3㊀pUC19-Donor-GFP重组质粒的构建及鉴定设计左同源臂+GFP+右同源臂序列,序列两端添加酶切位点XbaI/BamHI,送公司合成Donor片段,将合成的Donor片段㊁pUC19分别用XhaI和BamHI双酶切后连接㊂取10μL连接产物转化至50μL Stbl3感受态大肠杆菌中,37ħ培养1h 后,均匀涂在含有Amp的LB平板上,过夜培养㊂次日挑取6个克隆于4mL含有Amp的LB培养基中, 37ħ培养16h㊂16h后取1mL菌液抽提质粒,并对质粒进行菌落PCR,判断选取的单克隆中是否含有目的片段㊂将验证正确的质粒送至测序,测序引物:M13-R(CAGGAAACAGCTATGACC),测序正确后冻存菌种㊂1.2.4㊀细胞培养和细胞转染从-80ħ冰箱中取出冻存的HT29细胞,复苏结束后留2mol/L的细胞量在10cm培养皿中培养,隔天进行传代培养㊂培养至第4天时将HT29转移至24孔板中的2孔(一孔转染,一孔阴性对照),每孔0.5ˑ106细胞㊂转染前1~2h更换新鲜培养基(0.9mL/孔),按Lenti-V2-sgRNA(0.6μg)㊁Donor-GFP(0.4μg)㊁1mg/mL PEI(3μL)㊁DMEM(97μL)配制转染体系,室温孵育30min后,将混合液加入到1孔中,另一个孔无须加入,轻轻摇匀后放入培养箱培养(37ħ,5%CO2)㊂1.2.5㊀多克隆效果验证提取转染后的HT29细胞基因组DNA,利用在PD-L1基因组以及GFP上分别设计的上下游引物,对其进行PCR鉴定,以检测其中是否含有在PD-L1位点成功插入GFP片段的目的细胞㊂引物序列: PD-L1-F(TTCAAATTTATCATTTATCA),GFP-R (CCGGACACGCTGAACTTGTG),PCR体系:模板DNA10ng㊁PD-L1-F和GFP-R各1μL,2X PrimeSTAR HS DNA Polymerase MIX10μL,总体积20μL㊂PCR扩增程序:98ħ预变性20s,98ħ变性10s,55ħ退火5s,72ħ延伸35s,共30个循环,68ħ彻底延伸2min㊂扩增的PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析㊂1.2.6㊀单克隆细胞筛选转染72h后,观察细胞生长状况并计数,采用有限稀释法,用D10(10%的FBS+DMEM)按每200μL一个细胞稀释到96孔板中,培养24h 后,显微镜观察荧光及细胞状态,并做好标记㊂继续培养,当上一步标记的单克隆细胞密度达到80%后,消化并收集细胞,用基因组DNA抽提试剂盒提取基因组,作为检测引物(TestF㊁R)的扩增模板,最后将扩增产物送至公司测序,以检测PD-L1-GFP 报告基因是否插入成功㊂96第2期㊀㊀㊀㊀㊀谢钰珍,等:基于CRISPR/Cas9基因编辑技术构建PD-L1-GFP报告基因HT29细胞株2㊀结果与分析2.1㊀Lenti -V2-gRNA 重组质粒构建结果重组质粒基因测序结果显示,在酶切位点之间插入的片段位置㊁方向以及序列与预期一致(图1),含有本实验所需要的两条sgRNA 序列,证明LentiV2-gRNA 重组质粒构建成功㊂2.2㊀两条sgRNA 切割效果验证结果为了验证所设计的两条sgRNA 的切割效果,将两种Lenti -V2-gRNA 重组质粒转入293T 细胞后提取基因组DNA,并对其进行T7E1酶切鉴定,结果显示1和2两种sgRNA 都能切下相应大小的条带(图2),证明Lenti -V2-sgR1和Lenti -V2-sgR2都具有切割效果,本实验随机使用其中1条,采用sgRNA2,即Lenti -V2-sgR2㊂图1㊀Lentiv2-gRNA重组质粒测序结果图2㊀T7E1酶切图2.3㊀pUC19-Donor -GFP 重组质粒构建结果以挑选的6个单克隆为模板,经菌落PCR 均能扩增出目的片段(图3),说明菌落中含有目标质粒㊂将阳性质粒进一步送至金唯智测序,从图4可以看出,第一行的序列为测序结果,第二行的序列是所需的模板序列,序列比对完全正确,pUC19-Donor -GFP 质粒构建成功㊂2.4㊀Lenti -V2-sgR2和pUC19-donor -GFP 细胞转染结果㊀㊀将Lenti -V2-sgR2和pUC19-donor -GFP 转染至HT29细胞,72h 后荧光显微镜下观察细胞状态㊂由图5可知,培养72h后可观察到少量细胞表达绿注:1-6为随机挑取的6个单克隆,M 为DNA marker㊂图3㊀pUC19-Donor -GFP 重组质粒转化质粒菌落PCR 结果色荧光,证明GFP 成功转入HT29并进行了表达㊂2.5㊀PD -L1-GFP 报告基因工程细胞株阳性单克隆筛选结果2.5.1㊀多克隆效果验证结果图6为多克隆PCR 鉴定结果,可以发现实验组在200bp 位置有目的条带,而对照组没有,证明GFP 插入到指定位点㊂2.5.2㊀单克隆细胞筛选结果为将上述验证的插入正确GFP 序列位点的细胞挑选出来,将多克隆细胞进行单克隆筛选,图7为荧光显微镜观察结果,可以看到细胞形成了单克隆并且具有均一的荧光,可以进行后续的验证㊂7山东理工大学学报(自然科学版)2024年㊀图4㊀pUC19-Donor重组质粒测序结果(a)细胞图(b)荧光图图5㊀HT29细胞荧光蛋白表达为验证上述挑选的单克隆中所需的序列存在,对其基因组PCR 之后送至金唯智测序,图8显示与正常HT29细胞基因组相比,敲入的实验组所挑的单克隆在终止密码子前插入了GFP 片段,证明细胞系构建成功㊂3㊀讨论PD1表达于活化的免疫细胞表面,如B淋巴细图6㊀多克隆验证琼脂糖凝胶电泳图图7㊀单克隆细胞荧光状态图胞㊁CD4+T 细胞等㊂PD -L1作为PD1的配体之一,在癌组织上可见异常高表达,如肾癌㊁肝癌㊁肺癌㊁乳腺癌及卵巢癌等;但在肿瘤邻近的正常组织中低水平表达,提示它参与肿瘤发生发展,并在削弱抗肿瘤免疫反应中发挥重要作用㊂PD1/PD -L1是负性共刺激分子,当肿瘤细胞表面的PD -L1与免疫细胞表面的PD1结合时,可抑制免疫细胞的增殖与活性甚至诱导其凋亡,使癌细胞成功逃脱免疫杀伤㊂近年来,PD -L1及其受体PD1信号通路一直是肿瘤免疫领域的热门研究对象,针对阻断PD1/PD -L1通路的单克隆抗体已然成为了肿瘤免疫治疗的明星产品,目前FDA 已经批准了五种PD -L1抑制剂㊂作为非特异性免疫治疗产品,PD -L1抑制剂的抗癌效应具有广谱性,且在不同癌症疾病中显示出了很好的治疗[7-11],但由于治疗过程中的原发性和获得性耐药,相当大比例的患者无法从中受益㊂相较于单药疗法,近年来越来越多的研究正向着PD1/PD -L1耐药机制研究以及联合用药靶点的筛选上转移[12]㊂在一些研究报道中,针对不同类型免疫检查点的联合疗法已被证明对几种肿瘤有效㊂例如:采用抗PD -1抑制剂抗体㊁抗CD137激动剂抗体和疫苗治疗的三联疗法可以显著增强胰腺导管腺癌的治疗效果[13-14];联合anti -PD -L1和anti -TIGIT 在临床上对转移性NSCLC 患者非常有效[15];增强ITCH 活17第2期㊀㊀㊀㊀㊀谢钰珍,等:基于CRISPR /Cas9基因编辑技术构建PD -L1-GFP 报告基因HT29细胞株性可促进PD -L1泛素化降解从而降低肿瘤细胞PD -L1表达,化合物AK087与MAPK 抑制剂联用可明显增强MAPK 靶向治疗黑色素瘤的效果[16]等㊂但对于其他大部分肿瘤来说,不同疗法治疗过程中肿瘤表面PD -L1的表达量变化情况及产生治疗抗性的关键机制,仍需进一步研究㊂注:斜体为GFP 片段,下划线为PDL1终止密码子,WT 为正常HT29测序序列,Knock -in clone 为实验组测序序列㊂图8 对照组和实验组序列对比图㊀㊀为了探究结肠癌细胞表面PD -L1表达的更多可能调控机制,本研究利用CRISPR /Cas9系统和同源重组的原理,通过两次转染将GFP 荧光基团成功插入到PD -L1基因终止密码子之前,成功构建了PD -L1-GFP 报告基因HT29细胞株,通过荧光信号直观观察细胞上PD -L1是否表达以及表达的强弱程度,为进一步研究结肠癌细胞中PD -L1表达的可能调控机制提供了材料,并为后期体内外筛选调控PD -L1的上游新靶点及药物奠定了基础㊂参考文献:[1]谢丽叶,付杰军,卢奕,等.PD1/PD -L1激活促进癌症发生㊁发展和转移的研究进展[J].肿瘤防治研究,2017,44(6):423-427.[2]车章洪.PD -1/PD -L1通路在肿瘤的发生发展过程中对T 细胞的活化作用研究进展[J].中国新药杂志,2017,26(16):1913-1917.[3]方宇,王海娟,李征洋,等.PD -L1和A2aR 在大肠癌中的表达及意义[J].河北医药,2021,43(3):345-348,352.[4]丰江舟,杨梦梦,朱彬彬,等.人PD -L1基因启动子克隆及其荧光素酶报告基因载体的构建[J].皖南医学院学报,2016,35(6):524-526.[5]柯佳,李卓伟,李超,等.TGF -β1对结肠癌SW620细胞及其PD -L1表达的影响[C]//中国解剖学会.中国解剖学会2019年年会论文文摘汇编.昆明:解剖学杂志编辑部,2019:182.[6]王秀超.胰腺癌肿瘤细胞PD -L1表达调控机制及联合干预实验研究[D].天津:天津医科大学,2017.[7]李青丽,唐瑶,李富丽,等.抗PD -L1抗体抑制小鼠非小细胞肺癌移植瘤的生长及其机制[J].肿瘤,2020,40(8):531-540.[8]孙晨,镡云辉,耿波,等.PD -1/PD -L1抑制剂在肾癌中的研究进展[J].国际外科学杂志,2020,47(9):639-643.[9]张丽娜,杨艳芳,姜战胜.PD -1/PD -L1抑制剂治疗三阴性乳腺癌的研究进展[J].中国肿瘤生物治疗杂志,2021,28(8):844-849.[10]李一鑫,路丹.PD -1/PD -L1抑制剂治疗晚期卵巢癌的研究进展[J].现代肿瘤医学,2021,29(15):2741-2744.[11]陈茜,周建英,黎扬斯.抗PD -1/PD -L1治疗在晚期难治性肺鳞癌中的疗效和安全性[J].循证医学,2015,15(4):213-216.[12]YUAN Y,ADAM A,ZHAO C,et al.Recent advancements in themechanisms underlying resistance to PD -1/PD -L1blockade immu-notherapy[J].Cancers(BaseⅠ),2021,13(4):663.[13]韩丽炘,黄玉,温娟娟.PD -1/PD -L1抑制剂联合化疗对比免疫单药治疗晚期NSCLC 疗效及安全性的Meta 分析[J].山西大同大学学报(自然科学版),2022,38(4):84-90.[14]汝继轩,吴川林,张占田,等.PD -1/PD -L1免疫检查点抑制剂治疗胰腺癌研究进展[J].中华胰腺病杂志,2021,21(2):143-147.[15]陈丽丽.EGFR 联合PD -L1在可切除或临界可切除胰腺癌中的预后评价作用[C]//第二届中国临床分子诊断大会.第二届中国临床分子诊断大会论文集.成都:出版者不详,2019:73.[16]YANG Z T,WANG Y,LIU S X,et al.Enhancing PD -L1degra-dation by ITCH during MAPK inhibitor therapy suppresses acquiredresistance[J].Cancer Discovery,2022,12(8):1942-1959.(编辑:姚佳良)27山东理工大学学报(自然科学版)2024年㊀。
LC3真核表达载体构建及其在293T细胞中自噬诱导研究游金;李游;施洁;卢洁;卢春花【摘要】[Objective]The pEGFP-N1-LC3 eukaryotic expression vector was constructed and transfected into human embryonic kidney 293T cells and the expression of the fusion protein in the state of autophagy was observed by Earle's Balanced salt solution(EBSS)starvation induc-tion.[Methods]The LC3 gene was amplified by RT-PCR and inserted into pEGFP-N1 eukary-otic expression vector to construct a recombinant plasmid.The recombinant plasmids were transfected into 293T cells and the expression of the GFP-LC3 fusion protein was observed un-der fluorescent microscope and detected by Western blot.The transfected cells were subjected to starvation with Earle's Balanced salt solution,then the autophagic development was confirmed by Western blot and the formation of autophagic vacuoles was observed by confocal laser scanning microscope.[Results]The eukaryotic expression vector pEGFP-N1-LC3 was constructed and the recombinant protein was efficiently expressed in 293T cells.Autophagic vacuoles were observed after starvation induced by Earle's Balanced salt solution,and then the conversion of LC3-Ⅰ to LC3-Ⅱ was detected by Western blot.[Conclu-sion]This experiment provided an experimental material for the later study on the mechanisms of autophagy in tumorigenesis.%[目的]构建 pEGFP-N1-LC3 真核表达载体,并将其转染进人胚肾细胞 293T,通过 Earle's 盐平衡液(Bal-anced salt solution,EBSS)饥饿诱导观察细胞自噬现象.[方法]RT-PCR扩增 LC3 基因,并将其插入 pEGFP-N1真核表达载体构建重组质粒.将重组质粒转染至人胚肾细胞 293T,显微镜观察、Western blot检测 GFP-LC3 融合蛋白表达情况.对转染细胞进行 Earle's 盐平衡液饥饿诱导,通过Western blot验证自噬指标,激光共聚焦显微镜观察自噬泡形成.[结果]成功构建pEGFP-N1-LC3 真核表达载体,并在 293T 细胞中成功表达目的蛋白,在进行Earle's 盐平衡液饥饿诱导后观察到自噬泡的形成,Western blot 检测到 LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的转化.[结论]本实验为研究自噬在癌细胞病理进程中的机制提供了实验素材.【期刊名称】《广西科学》【年(卷),期】2018(025)003【总页数】6页(P313-317,324)【关键词】LC3;细胞自噬;绿色荧光蛋白;人胚肾293T细胞【作者】游金;李游;施洁;卢洁;卢春花【作者单位】广西大学生命科学与技术学院,广西南宁 530005;广西大学生命科学与技术学院,广西南宁 530005;广西大学生命科学与技术学院,广西南宁 530005;广西大学生命科学与技术学院,广西南宁 530005;广西大学生命科学与技术学院,广西南宁 530005【正文语种】中文【中图分类】Q2910 引言【研究意义】自噬是一种蛋白质大量降解过程，该过程中待降解的蛋白质包裹于自噬体中，传递至溶酶体或者液泡中进行降解[1]。
基因定点敲入方法随着生物科技的飞速发展，基因编辑技术已经成为了生命科学领域中的一颗璀璨明珠。
基因定点敲入方法，作为基因编辑技术的重要分支，以其精确、高效的特点，在基因治疗、农作物改良、动物模型制备等方面展现出了广阔的应用前景。
本文将详细介绍基因定点敲入方法的原理、技术流程、应用以及未来发展趋势。
一、基因定点敲入方法的原理基因定点敲入方法是一种基于同源重组原理的基因编辑技术。
它通过设计特定的基因载体，将外源基因片段导入目标细胞，并利用细胞内的同源重组机制，将外源基因片段精确地插入到基因组中的特定位置，从而实现对目标基因的定点敲入。
这种方法具有高度的精确性和可控性，能够有效地避免随机插入导致的基因突变和不可预测的生物伦理问题。
二、基因定点敲入方法的技术流程1. 设计基因载体：根据目标基因的序列和敲入位置，设计特定的基因载体。
基因载体通常包括同源臂、筛选标记和外源基因片段等部分。
同源臂是与目标基因两侧序列高度相似的DNA片段，用于引导同源重组；筛选标记则用于在后续筛选过程中识别已成功敲入外源基因的细胞。
2. 导入基因载体：将构建好的基因载体通过病毒感染、电穿孔、显微注射等方式导入目标细胞。
导入过程中需要保证细胞的存活率和基因载体的转染效率。
3. 同源重组：在细胞内，基因载体中的同源臂与目标基因两侧的序列发生同源重组，将外源基因片段精确地插入到基因组中的特定位置。
此过程需要细胞内同源重组酶的参与，因此需要对细胞进行适当的处理以提高同源重组效率。
4. 筛选阳性细胞：利用筛选标记对已成功敲入外源基因的细胞进行筛选。
常用的筛选标记包括抗生素抗性基因、荧光蛋白基因等。
通过抗生素筛选、荧光显微镜观察等手段，可以筛选出已成功敲入外源基因的阳性细胞。
5. 验证和鉴定：对筛选出的阳性细胞进行进一步的验证和鉴定。
通过PCR扩增、测序等技术手段，确认外源基因片段已正确插入到目标位置，并对插入后的基因表达和功能进行分析。
三、基因定点敲入方法的应用1. 基因治疗：基因定点敲入方法为基因治疗提供了一种新的思路。
生物化学（查锡良，人卫七版）绪论 (2)第一章蛋白质的结构与功能 (3)第二章核酸的结构与功能 (5)第三章酶 (7)第四章糖代谢 (9)第五章脂类代谢 (12)第六章生物氧化 (16)第七章氨基酸代谢 (18)第八章核苷酸代谢 (21)第九章物质代谢的联系与调节 (22)第十章DNA的生物合成 (24)第十一章RNA的生物合成 (26)第十二章蛋白质的生物合成 (28)第十三章基因表达调控 (31)第十四章基因重组与基因工程 (34)第十五章细胞信号转导 (36)第十六章血液的生物化学 (39)第十七章肝的生物化学 (42)第十八章维生素与无机物 (43)第十九章糖蛋白、蛋白聚糖和细胞外基质 (45)第二十章癌基因、抑癌基因与生长因子 (46)第二十一章常用分子生物学技术的原理及应用 (48)绪论第一节生物化学发展简史一、叙述生物化学阶段二、动态生物化学阶段三、分子生物学时期1.DNA双螺旋结构被发现2.DNA克隆使基因操作无所不能3.基因组学及其他组学的研究四、我国科学家对生物化学发展的贡献1.协和-吴宪-血液化学分析-血滤液的制备、血糖测定法、蛋白质变性学说2.刘思职-免疫化学-定量分析法研究抗原抗体反应机制3.1965年-人工合成-牛胰岛素-解出三方二锌猪胰岛素的晶体结构4.有机合成+酶促→酵母丙氨酰tRNA第二节当代生物化学研究的主要内容1.生物分子的结构与功能2.物质代谢及调节3.基因信息传递及其调控第三节生物化学与医学一、生物化学已成为生物学各学科之间、医学各学科之间相互联系的共同语言二、生物化学为推动医学各学科发展做出了重要的贡献第一章蛋白质的结构与功能第一节蛋白质的分子组成一、组成人体蛋白质的20种氨基酸属于L-α-氨基酸二、氨基酸可根据侧链结构和理化性质进行分类三、20种氨基酸具有相同或特异的理化性质（一）氨基酸具有两性解离的性质（二）含共轭双键的氨基酸具有紫外吸收性质（三）氨基酸与茚三酮反应生成蓝紫色化合物四、蛋白质是由许多氨基酸残基组成的多肽链（一）氨基酸通过肽键连接而形成肽（二）体内存在多种重要的生物活性肽1.谷胱甘肽2.多肽类激素及神经肽第二节蛋白质的分子结构一、氨基酸的排列顺序决定蛋白质的一级结构二、多肽链的局部主链构象为蛋白质二级结构（一）参与肽键形成的6个原子在同一平面上（二）α-螺旋结构是常见的蛋白质二级结构（三）β-折叠使多肽链形成片层结构（四）β-转角和无规卷曲在蛋白质分子中普遍存在（五）模体是具有特殊功能的超二级结构（六）氨基酸残基的侧链对二级结构形成的影响三、在二级结构基础上多肽链进一步折叠形成蛋白质三级结构（一）三级结构是指整条肽链中全部氨基酸残基的相对空间位置（二）结构域是三级结构层次上的局部折叠区（三）分子伴侣参与蛋白质折叠分子伴侣可分为3类：①热休克蛋白70（Hsp70）②伴侣蛋白③核质蛋白四、含有两条以上多肽链的蛋白质具有四级结构五、蛋白质的分类六、蛋白质组学（一）蛋白质组学基本概念（二）蛋白质组学研究技术平台1.双向电泳分离样品蛋白质2.蛋白质点的定位、切取3.蛋白质点得质谱分析（三）蛋白质组学研究的科学意义第三节蛋白质结构与功能的关系一、蛋白质一级结构是高级结构与功能的基础（一）一级结构是空间构象的基础（二）一级结构相似的蛋白质具有相似的高级结构与功能（三）氨基酸序列提供重要的生物进化信息（四）重要蛋白质的氨基酸序列改变可引起疾病二、蛋白质的功能依赖特定空间结构（一）血红蛋白亚基与肌红蛋白结构相似（二）血红蛋白亚基构象变化可影响亚基与氧结合（三）蛋白质构象改变可引起疾病第四节蛋白质的理化性质一、蛋白质具有两性电离性质二、蛋白质具有胶体性质三、蛋白质空间结构破坏而引起变性四、蛋白质在紫外光谱区有特征性吸收峰五、应用蛋白质呈色反应可测定蛋白质溶液含量1.茚三酮反应2.双缩脲反应第五节蛋白质的分离、纯化与结构分析一、透析及超滤法可去除蛋白质溶液中的小分子化合物二、丙酮沉淀、盐析及免疫沉淀是常用的蛋白质沉淀方法三、利用荷电性质可用电泳法将蛋白质分离四、应用相分配或亲和原理可将蛋白质进行层析分离五、利用蛋白质颗粒沉降行为不同可进行超速离心分离六、应用化学或反向遗传学方法可分析多肽链的氨基酸序列七、应用物理学、生物信息学原理可进行蛋白质空间结构测定1.同源模建2.折叠识别3.从无到有表格&示意图1.表格-氨基酸分类（结构式、英文名、三字符、一字符）2.芳香族氨基酸的紫外吸收3.GSH与GSSH之间的转换4.超二级结构与蛋白质模体（αα、βαβ、ββ、锌指结构、钙结合蛋白之螺旋-转角-螺旋）5.β-巯基乙醇及尿素对核糖核酸酶的作用6.肌红蛋白与血红蛋白的氧解离曲线7.PrP c转变为PrP sc的过程8.离子交换层析分离蛋白质9.凝胶过滤分离蛋白质肽的氨基酸末端测定法第二章核酸的结构与功能第一节核酸的化学组成及一级结构一、核苷酸是构成核酸的基本组成单位二、DNA是脱氧核苷酸通过3’,5’-磷酸二酯键连接形成的大分子三、RNA也是具有3’,5’-磷酸二酯键的线性大分子四、核酸的一级结构是核苷酸的排列顺序第二节DNA的空间结构与功能一、DNA的二级结构是双螺旋结构（一）DNA双螺旋结构的研究背景（二）DNA双螺旋结构模型要点1.DNA是反向平行、右手螺旋的双链结构2.DNA双链之间形成了互补碱基对3.疏水作用力和氢键共同维持着DNA双螺旋结构（三）DNA双螺旋结构的多样性（四）DNA的多链螺旋结构二、DNA高级结构是超螺旋结构（一）原核生物DNA的环状超螺旋结构（二）真核生物DNA高度有序和高度致密的结构三、DNA是遗传信息的物质基础第三节RNA的结构与功能一、mRNA 是蛋白质合成的模板1.大部分真核细胞mRNA的5’-末端都以7-甲基鸟嘌呤-三磷酸核苷（m7GpppN）为起始结构2.在真核生物mRNA的3’-末端，有一段由80~250个腺苷酸连接而成的多聚腺苷酸结构，称为多聚腺苷酸尾或多聚A尾3.mRNA依照自身的碱基顺序指导蛋白质氨基酸顺序的合成，也就是为氨基酸的生物合成提供模板4.mRNA的成熟过程是hnRNA 的剪接过程二、t RNA是蛋白合成的氨基酸载体1.t RNA含有多种稀有碱基2.t RNA具有茎环结构3.t RNA的3’-末端连有氨基酸4.t RNA的反密码子能够识别mRNA的密码子三、以rRNA为组分的核糖体是蛋白质合成的场所四、snmRNA参与了基因表达的调控五、核酸在真核细胞和原核细胞中表现了不同的时空特异性第四节核酸的理化性质一、核酸分子具有强烈的紫外吸收二、DNA变性是双链解离为单链的过程三、变性的核酸可以复性或形成杂交双链第五节核酸酶结构&流程图1.构成核苷酸的嘌呤和嘧啶的化学结构式2.构成核苷酸的核糖和脱氧核糖的化学结构式3.核苷和脱氧核苷的化学结构式4.核苷酸的化学结构（包括3’,5’-cAMP）5.多聚腺苷酸的化学结构式6.DNA双螺旋结构示意图（数据）7.封闭的环状DNA分子（形成超螺旋）8.真核生物DNA形成核小体的示意图9.双链DNA经历折叠、盘绕形成高度有序和高度致密染色体的示意图10.表格-真核细胞内主要RNA的种类和功能（5+3）11.成熟的真核mRNA的结构示意图12.mRNA的甲基化位点（2点）13.真核生物mRNA的帽结构及加帽过程14.真核生物mRNA多聚A尾结构的形成过程15.鸡卵清蛋白mRNA的成熟过程16.t RNA分子中含有的稀有碱基17.t RNA的二级结构和三级结构18.t RNA的反密码子与m RNA的密码子相互识别示意图19.表格-核糖体的组成（原核、真核）20.由核糖体、mRNA和t RNA形成的复合体21.真核细胞和原核细胞基因表达的时空特异性22.DNA在解链过程中表现出得增色效应23.DNA解链温度曲线24.核酸分子复性和杂交的示意图第三章酶第一节酶的分子结构与功能一、酶的分子组成中常含有辅助因子二、酶的活性中心是酶分子中执行其催化功能的部位三、同工酶是催化相同化学反应但一级结构不同的一组酶第二节酶的工作原理一、酶反应特点（一）酶反应具有极高的效率（二）酶促反应具有高度的特异性1.绝对特异性2.相对特异性3.有些酶具有立体异构特异性（三）酶促反应具有可调节性二、酶通过促进底物形成过渡态而提高反应速率（一）酶比一般催化剂更有效地降低反应活化能（二）酶和底物的结合有利于底物形成过渡态1.诱导契合作用使酶与底物密切结合2.邻近效应与定向排列使诸底物正确定位于酶的活性中心3.表面效应使底物分子去溶剂化（三）酶的催化机制呈多元催化1.酸碱催化作用：酶是两性电离的蛋白质，活性中心可为质子供体，或质子受体，参与质子转移2.共价催化作用：酶的催化基团通过形成瞬间共价键而将底物激活3.亲核催化作用：中心基团属于亲核基团，可提供电子给带正电荷的过渡态中的中间物，加速产物生成第三节酶促反应动力学一、底物浓度对反应速率影响的作图呈矩形双曲线（一）米-曼氏方程式揭示单底物反应的动力学特性（二）Km与Vm是最有意义的酶促反应动力学参数1.Km值=酶促反应速率为最大速率一半时的底物浓度2.Km值愈小，酶对底物的亲和力愈大3.Km值是酶特性常数之一，只于酶的结构、底物和反应环境（T Ph 离子强度等）有关，与酶的浓度无关4.Vmax是酶完全被底物饱和时的反应速率，与酶的浓度呈正比（三）Km值和Vmax值可以通过作图法求取二、底物足够时酶浓度对反应速率的影响呈直线关系三、温度对反应速率的影响具有双重性四、P H通过改变酶和底物分子解离状态影响反应速率五、抑制剂可逆地或不可逆地降低酶促反应速率（一）不可逆性抑制剂主要与酶共价结合（二）可逆性抑制剂与酶和（或）酶-底物复合物非共价结合1.竞争性抑制作用的抑制剂与底物竞争结合酶的活性中心2.非竞争性抑制作用的抑制剂不改变酶对底物的亲和力3.反竞争性抑制作用的抑制剂仅与酶-底物复合物结合六、激活剂可加快酶促反应速率第四节酶的调节一、调节酶实现对酶促反应速率的快调节（一）变构酶通过变构调节酶的活性（二）酶的化学修饰调节是通过某些化学基团与酶共价结合与分离实现的（三）酶原的激活使无活性的酶原转变成有催化活性的酶二、酶含量的调节包括对酶合成与分解速率的调节（一）酶蛋白合成可被诱导或阻遏（二）酶的降解与一般蛋白质降解途径相同第五节酶的分类与命名一、酶可根据其催化的反应类型予以分类：1.氧化还原酶类2.转移酶类3.水解酶类4.裂解酶类（裂合酶类，synthase）：合酶属此类5.异构酶类6.合成酶类（连接酶酶，ligases）二、每一种酶均有其系统名称和推荐名称第六节酶与医学的关系一、酶和疾病密切相关（一）酶的质、量与活性的异常均可引起某些疾病（二）酶的测定有助于对许多疾病的诊断1.酶活性测定和酶活性单位是定量酶的基础2.血清酶对某些疾病的诊断具有更重要的价值（三）酶和某些疾病的治疗关系密切二、酶在医学上的应用领域广泛（一）酶作为试剂用于临床检验和科学研究1.酶法分析是以酶作为工具对化合物和酶活性进行定量分析的一种方法2.酶标记测定法是酶学与免疫学相结合的一种测定方法3.工具酶广泛地应用于分子克隆领域（二）酶的分子工程是方兴未艾的酶工程学1.固定化酶是固相酶2.抗体酶是具有酶活性的抗体结构&流程示意图1.表格-某些辅酶（辅基）在催化中的作用2.表格-几种蛋白激酶的共有序列3.底物浓度对酶促反应速率的影响4.对氨基苯甲酸-磺胺类药物5.表格-各种可逆性抑制作用的比较第四章糖代谢第一节概述一、糖的主要生理功能是氧化供能二、糖的消化吸收主要是在小肠进行三、糖代谢的概况第二节糖的无氧代谢一、糖无氧氧化反应过程分为糖酵解途径和乳酸生成两个阶段（一）葡萄糖经糖酵解途径分解为两分子丙酮酸1.葡萄糖磷酸化为6-磷酸葡萄糖2.6-磷酸葡萄糖变为6-磷酸果糖3.6-磷酸果糖转变为1,6-二磷酸果糖4.磷酸己糖裂解为2分子磷酸丙糖5.磷酸二羟丙酮转变为3-磷酸甘油醛6.3-磷酸甘油醛氧化为1，3-二磷酸甘油酸7.1，3-二磷酸甘油酸转变为3-磷酸甘油酸8.3-磷酸甘油酸转变为2-磷酸甘油酸9.2-磷酸甘油酸脱水生成磷酸烯醇式丙酮酸10.磷酸烯醇式丙酮酸将高能磷酸基转移给ADP形成ATP和丙酮酸（二）丙酮酸被还原为乳酸二、糖酵解的调控是对3个关键酶活性的调节（一）6-磷酸果糖激酶-1对调节糖酵解途径的流量最重要（二）丙酮酸激酶是糖酵解的第二个重要调节点（三）己糖激酶受到反馈调节三、糖酵解的主要生理意义是机体缺氧的情况下快速功能第三节糖的有氧氧化一、糖有氧氧化的反应过程包括糖酵解途径、丙酮酸氧化脱羧、三羧酸循环及氧化磷酸化（一）葡萄糖循糖酵解途径分解为丙酮酸（二）丙酮酸进入线粒体氧化脱羧生成乙酰CoA1.丙酮酸脱羧形成羟乙基-TPP2.由二氢硫辛酰胺转乙酰酶E2→乙酰硫辛酰胺-E23.生成乙酰CoA,E2二硫键还原为两个巯基4.二氢硫辛酰胺脱氢酶E3，脱氢生成FADH2和硫辛酰胺5.FADH2→NADPH+H+二、三羧酸循环是以形成柠檬酸为起始物的循环反应系统（一）TCA循环由8步代谢反应组成1.乙酰CoA与草酰乙酸缩合成柠檬酸2.柠檬酸经顺乌头酸转变为异柠檬酸3.异柠檬酸氧化脱羧转变为α-酮戊二酸4.α-酮戊二酸氧化脱羧生成琥珀酰CoA5.琥珀酰CoA合成酶催化底物水平磷酸化反应6.琥珀酸脱氢生成延胡索酸7.延胡索酸加水生成苹果酸8.苹果酸脱氢生成草酰乙酸（二）TCA循环受底物、产物、关键酶活性的调节1.TCA循环中有3个关键酶2.TCA循环与上游和下游的反应相协调3.TCA循环是糖、脂肪、氨基酸代谢联系的枢纽三、糖有氧氧化是机体获得ATP的主要方式四、糖有氧氧化的调节是基于能量的需求五、巴斯德效应是指糖有氧氧化抑制糖酵解的现象第四节葡萄糖的其它代谢途径一、磷酸戊糖途径生成NADPH和磷酸戊糖（一）磷酸戊糖途径的反应过程分为两个阶段1.6-磷酸葡萄糖在氧化阶段生成磷酸戊糖和NADPH2.经过基团转移反应进入糖酵解途径（二）磷酸戊糖途径主要受NADPH/NADP+比值调节（三）磷酸戊糖途径的生理意义在于生成NADPH和5-磷酸核糖1．为核酸的生物合成提供核糖2．提供NADPH作为供氢体参与多种代谢反应二、糖醛酸途径可生成葡萄糖醛酸三、多元醇途径可生成木糖醇、山梨醇等第五节糖原的合成与分解一、糖原的合成代谢主要在肝和肌组织中进行二、糖原分解产物—葡萄糖可补充血糖三、糖原的合成与分解受到彼此相反的调节（一）糖原磷酸化酶是糖原分解的关键酶（二）糖原合酶是糖原合成的关键酶四、糖原累积症是由先天性没缺陷所致第六节糖异生一、糖异生途径不完全是糖酵解的逆反应（一）丙酮酸经丙酮酸羧化支路变为磷酸烯醇式丙酮（二）1,6-二磷酸果糖转变为6-磷酸果糖（三）6-磷酸葡萄糖水解为葡萄糖二、糖异生的调节是通过对两个底物循环的调节与糖酵解调节彼此协调（一）第一个底物循环：在6-磷酸果糖和1,6-二磷酸果糖之间进行（二）第二个底物循环：磷酸烯醇式丙酮酸和丙酮酸之间进行三、糖异生的生理意义主要在于维持血糖水平恒定（一）维持血糖水平的恒定是糖异生最主要的生理作用（二）糖异生是补充或恢复肝糖原储备的重要途径（三）肾糖异生增强有利于维持酸碱平衡四、肌中产生的乳酸运输至肝进行糖异生形成乳酸循环第七节其他单糖的代谢一、果糖被磷酸化后进入糖酵解途径二、半乳糖可转变为1-磷酸葡萄糖成为糖酵解的中间代谢产物三、甘露糖可转变为6-磷酸果糖进入糖酵解途径第八节血糖及其调节一、血糖的来源和去路是相对平衡的二、血糖水平的平衡主要是受激素调节（一）胰岛素是体内唯一降低血糖的激素（二）机体在不同状态下有相应的升高血糖的激素1.胰高血糖素2.糖皮质激素可引起血糖升高3.肾上腺素是强有力的升高血糖激素三、血糖水平异常及糖尿病是最常见的糖代谢紊乱（一）低血糖是指血糖浓度低于3.0mmol/L（二）高血糖是指空腹血糖高于6.9 mmol/L（三）糖尿病是最常见的糖代谢紊乱疾病结构&流程示意图：1.糖酵解的代谢途径2.2,6-二磷酸果糖激酶-1的活性调节3.丙酮酸脱氢酶复合体作用机制4.三羧酸循环5.表格-葡萄糖有氧氧化生成的ATP6.三羧酸循环的调控7.磷酸戊糖途径8.糖醛酸途径9.分支酶的作用10.脱支酶的作用11.糖原合成、分解的共价修饰调节12.糖异生途径13.乳酸循环14.半乳糖的代谢15.甘露糖的代谢第五章脂类代谢第一节不饱和脂酸的命名及分类一、脂酸的系统命名遵循有机酸命名的原则二、脂酸主要根据其碳链长度和饱和度分类（一）脂酸根据其碳链长度分为短链、中链、长链脂酸（二）脂酸根据其碳链是否存在双键分为饱和脂酸和不饱和脂酸1.饱和脂酸的碳链不含双键2.不饱和脂酸的碳链含有一个或一个以上双键第二节脂类的消化吸收一、脂类的消化发生在脂-水界面，需要胆汁酸盐参与二、饮食脂肪在小肠被吸收第三节甘油三酯代谢一、甘油三酯是甘油的脂酸酯（一）甘油三酯是脂酸的主要储存形式（二）甘油三酯的主要作用是为机体提供能量1.甘油三酯是机体重要的能量来源2.甘油三酯是机体主要能量储存形式二、甘油三酯的分解代谢主要是脂酸的氧化（一）脂肪动员是甘油三酯分解的起始步骤（二）甘油经糖代谢途径代谢（三）脂酸经β-氧化分解功能1.脂酸的活化形式为脂酰CoA2.脂酰CoA经肉碱转运入线粒体3.脂酸的β-氧化的终产物主要是乙酰CoA（1）脱氢（2）加水（3）再脱氢（4）硫解4.脂酸氧化是体内能量的重要来源（四）脂酸的其他氧化方式1.不饱和脂酸的氧化2.过氧化物酶体的β-氧化3.奇数碳原子脂酸的氧化（五）酮体的生成及利用1.酮体在肝细胞中生成（1）2个乙酰辅酶A→乙酰乙酰辅酶A（2）乙酰乙酰辅酶A+乙酰辅酶A→HMG CoA（3）HMGCoA 裂解为乙酰乙酸和乙酰辅酶A2.酮体在肝外组织中利用3.酮体生成的生理意义4.酮体生成的调节（1）饱食及饥饿的影响（2）肝细胞糖原含量及代谢影响（3）丙二酰CoA抑制脂酰CoA进入线粒体三、脂酸在脂酸合成酶系的催化下合成（一）软脂酸的合成1.合成部位2.合成原料3.脂酸合成酶系及反应过程（1）丙二酰CoA的合成（2）脂酸合成（二）脂酸碳链的加长1.脂酸碳链在内质网中的延长2.脂酸碳链在线粒体中的延长（三）不饱和脂酸的合成（四）脂酸合成的调节1.代谢物的调节作用2.激素的调节作用四、甘油和脂酸合成甘油三酯（一）合成部位（二）合成原料（三）合成基本过程1.甘油一酯途径2.甘油二酯途径五、几种多不饱和脂酸衍生物具有重要生理功能（一）前列腺素、血栓烷、白三烯的化学结构和命名（二）PG、TX、LT的合成1.前列腺素及血栓烷的合成2.白三烯的合成（三）PG、TX、LT的生理功能1.PG的主要生理功能2.TX的主要生理功能3.LT的主要生理功能第四节磷脂代谢一、含磷酸的脂类被称为磷脂（一）由甘油构成的磷脂统称为甘油磷脂（二）由鞘氨醇或二氢鞘氨醇构成的磷脂称为鞘磷脂二、磷脂在体内具有重要的生理功能（一）磷脂是构成生物膜的重要成分1.卵磷脂存在于细胞膜中2.心磷脂是线粒体膜的主要脂质（二）磷脂酰肌醇是第二信使的前体（三）缩醛磷脂存在于脑和心组织中（四）神经鞘磷脂和卵磷脂在神经髓鞘中含量较高三、甘油磷脂的合成与降解（一）甘油磷脂的合成1.合成部位2.合成的原料及辅因子3.合成的基本过程（1）甘油二酯合成途径（2）CDP-甘油二酯合成途径（二）甘油磷脂的降解四、鞘磷脂的代谢（一）鞘氨醇的合成1.合成部位2.合成原料3.合成过程（二）神经鞘磷脂的合成（三）神经鞘磷脂的降解第五节胆固醇代谢一、胆固醇的合成原料为乙酰CoA和NADPH（一）合成部位（二）合成原料（三）合成基本过程1.甲羟戊酸的合成2.鲨烯的合成3.胆固醇的合成（四）胆固醇合成受多种因素调节1.限速酶2.饥饿与饱食3.胆固醇4.激素二、转变为胆汁酸及类固醇激素是体内胆固醇的主要去路（一）胆固醇可转变为胆汁酸（二）胆固醇可转变为类固醇激素（三）胆固醇可转化为维生素D3前体第六节血浆脂蛋白代谢一、血脂是血浆所含脂类的统称二、不同血浆脂蛋白其组成、结构均不同（一）血浆脂蛋白的分类1.电泳法2.超速离心法（二）血浆脂蛋白的组成（三）载脂蛋白（四）脂蛋白结构三、血浆脂蛋白是血脂的运输形式，但代谢和功能各异（一）乳糜微粒（二）极低密度脂蛋白（三）低密度脂蛋白（四）高密度脂蛋白四、血浆脂蛋白代谢异常导致血脂异常或高脂血症（一）高脂血症（二）动脉粥样硬化1.LDL和VLDL具有致AS作用2.HDL具有抗AS作用（三）遗传缺陷结构&流程示意图1.常见的脂酸2.甘油一酯途径3.脂肪动员4.长链脂酰CoA进入线粒体5.脂酸的β-氧化6.酮体在干细胞中的生成7.酮体的氧化8.柠檬酸-丙酮酸循环9.软脂酸的生物合成10.表格-体内几种重要的甘油磷脂11.磷脂酶对磷脂的水解12.胆固醇的生物合成13.血浆脂蛋白琼脂糖凝胶电泳示意图14.超速离心分离血浆脂蛋白示意图15.血浆脂蛋白结构示意图16.脂蛋白代谢示意图第六章生物氧化第一节生成ATP的氧化磷酸化体系一、氧化呼吸链是一系列有电子传递功能的氧化还原组分（一）氧化呼吸链由4种具有传递电子能力的复合体组成1.复合体Ⅰ作用是将NADPH+H+中的电子传递给泛醌2.复合体Ⅱ作用是将电子从琥珀酸传递到泛醌3.复合体Ⅲ作用是将电子从还原型泛醌传递给细胞色素C4.复合体Ⅳ将电子从细胞色素C传递给氧（二）氧化呼吸链组分按氧化还原电位由低到高的顺序排列二、氧化磷酸化将氧化呼吸链释能与ADP磷酸化生成ATP偶联（一）氧化磷酸化偶联部位在复合体Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ内1.P/O比值2.自由能变化（二）氧化磷酸化偶联机制是产生跨线粒体内膜的质子梯度（三）质子顺梯度回流释放能量被ATP合酶利用催化ATP合成三、氧化磷酸化作用可受某些内外源因素影响（一）有3类氧化磷酸化抑制剂1.呼吸链抑制剂阻断氧化磷酸化的电子传递过程2.解偶联剂破坏电子传递建立的跨膜质子电化学梯度3.ATP合酶抑制剂同时抑制电子传递和ATP的生成（二）ADP是调节正常人体氧化磷酸化速率的主要因素（三）甲状腺激素刺激机体耗氧量和产热同时增加（四）线粒体DNA突变可影响机体氧化磷酸化功能四、ATP在能量的生成、利用、转移和储存中起核心作用五、线粒体内膜对各种物质进行选择性转运（一）胞质中NADH通过穿梭机制进入线粒体氧化呼吸链1.α-磷酸甘油穿梭主要存在于脑和骨骼肌中2.苹果酸-天冬氨酸穿梭主要存在于肝和心肌中（二）ATP-ADP转位酶促进ADP进入和ATP移出紧密偶联第二节其他不生成ATP的氧化体系一、抗氧化酶体系有清除反应活性氧类的功能二、微粒体细胞色素P450单加氧酶催化底物分子羟基化结构&流程示意图1.表格-人线粒体呼吸链复合体2.电子传递链各复合体位置示意图3.化学渗透假说示意图4.ATP合酶结构和质子的跨内膜流动机制模式图5.ATP合酶的工作机制6.不同底物和抑制剂对线粒体氧耗的影响。
