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疟原虫镜检技术血片制作与染色一、血片制作（一）所需器材1、载玻片：玻片使用前应清洗。
新玻片应先浸入有液态洗涤剂的清水中10~20分钟，然后用干净棉巾逐个擦拭，再用清水冲洗干净，晾干，最后用干净、柔软的棉巾将玻片擦亮。
用于特殊的目的时，最后可将玻片浸泡在95％酒精中5~10分钟，再将玻片擦干擦亮。
已用过的玻片应先浸泡于洗涤剂溶液中1~2天，或浸泡于煮沸的5％肥皂水中1~2小时，再移到新配置的洗涤剂溶液中1~2小时，逐个擦去玻片上旧的血膜痕迹，用清水漂洗干净，再将玻片擦干擦亮。
洗净的玻片每10~20张用白纸包好放入塑料袋内，保存于干燥环境中备用。
2、采血针：使用一次性釆血针。
3、玻片盒：为防止污染和苍蝇吸食血膜，新制作的血膜应放在玻片盒中，厚血膜放置时要保持水平，直到充分干燥。
4、75％酒精棉球：用于采血前后的消毒。
5、记号笔或铅笔：用于玻片上书写号码。
（二）采血部位及取血方法采血部位以耳垂较为合适，也可在手指末端采血，婴儿可从拇趾或足跟取血。
先用75％酒精棉球消毒取血部位后，以一次性采血针迅速刺入取血部位1~2mm深，然后用左手大拇指、食指和右手中指协同挤出血滴。
（三）涂制血膜取玻片2张，1张作载片，1张作推片（具有光滑边缘）。
用右手拇指和食指夹持推片侧缘中部，用推片的左下角刮取血液4~5μl，再用该端中部刮取血液1~1.5μl。
将左下角的血滴涂于载片的中央偏右处，由里向外划圈涂成直径为0.8~1cm的圆形厚血膜（厚度以1个油镜视野内可见到5~10个白细胞为宜）。
用干棉球抹净玻片角上的血渍，然后将推片下缘平抵载玻片的中线，当血液在载玻片与推片之间向两侧扩展至约2cm宽时，使两玻片保持25°～35°角，从右向左迅速向前推成舌状薄血膜，制成的薄血膜应在玻片上形成平铺的血细胞，细胞之间互相接触而不相互重叠。
每张载玻片上分别做1个薄血膜，1个厚血膜。
取干净玻片及推片各一张，用右手大拇指和食指夹持推片侧缘中部，用推片的左下角刮取血液4～5μl（约火柴头大小），再用该端中部刮取血液1～1.5μl。
目录第一章疟原虫生活史一、概述二、人体内发育三、蚊体内的发育第二章疟原虫镜下形态一、薄血膜中疟原虫形态二、厚血膜中疟原虫形态第三章显微镜使用及维护一、显微镜的构造二、显微镜使用三、使用注意事项四、显微镜的维护保养第四章血片制作与染色一、血片制作二、血膜的染色第五章疟原虫镜检技术一、血液二、血液中各种正常细胞形态三、薄血膜镜检四、厚血膜镜检五、杂质与疟原虫的鉴别六、疟原虫计数附录：疟原虫图谱第一章疟原虫生活史一、概述疟原虫是疟疾的病原体。
疟原虫为单细胞真核生物，属原生动物亚界顶端复合物门、孢子纲、真球虫目、疟原虫科、疟原虫属。
人体疟原虫有4种：间日疟原虫（Plasmodium vivax）、恶性疟原虫(P.falciparum)、三日疟原虫(P.malariae)和卵形疟原虫(P.ovale)，依次引起间日疟、恶性疟、三日疟和卵形疟。
在我国间日疟较常见，恶性疟次之，但对人体危害较间日疟严重，三日疟偶尔发现，卵形疟已无病例报告。
4种人体疟原虫的生物学特征见表1-1。
疟原虫的发育和繁殖，必须通过脊椎动物与昆虫媒介两个宿主，人体疟原虫的宿主是人和按蚊。
疟原虫在人体分别寄生于肝实质细胞和血液中的红细胞内，在蚊体内则寄生于蚊胃，最后积聚于唾腺。
4种人体疟原虫的生活史基本相同，包括在人体内的红细胞外期和红细胞内期以及在蚊体内的配子生殖和孢子增殖两个阶段。
二、人体内发育疟原虫在人体内的发育分成肝细胞内的发育和红细胞内的发育两个阶段。
（一）红细胞外期按蚊吸人血时，按蚊唾腺中的子孢子随唾液进入人体的末梢血液中，在30分钟内，随血流进入肝脏，在肝实质细胞内发育，进行裂体增殖，此时期称红细胞外期（简称红外期）或肝细胞期（简称肝期），此时期的疟原虫称肝期裂殖体。
成熟肝期裂殖体直径为45～60 m，内含数以万计的肝期裂殖子。
肝期裂殖体成熟致使肝细胞破裂，肝期裂殖子释入血液。
不同种疟原虫的此期所需时间不同，从6～12天不等。
附件3疟原虫血涂片镜检技术规范一、吉氏液染色--光学显微镜（油镜）检查同时涂制薄血膜和圆形厚血膜，薄血膜须用甲醇固定，用吉氏染色液（Giemsa stain）进行染色。
吉氏染液用pH7.0-7.2的水配成3%的稀释液，可将血片插入染色缸内染色，或用滴管将稀释液滴在厚、薄血膜上，染色30min，若需快速染色，可在2ml水中加吉氏染液3滴，染色6min 。
对临床诊断为脑型疟者，宜用快速染色法，以便能尽快获得确诊依据。
现症患者至少检查100个厚血膜视野，带虫者应查完整个厚血膜，未发现疟原虫才判为阴性。
薄血膜可用于原虫形态鉴定。
以薄血膜中平均每100个红细胞中的原虫数，或厚血膜中平均每100个白细胞范围内的原虫数，推算每微升血中的原虫密度。
染色血片中的原虫核呈红色，胞浆呈兰色。
除环状体外，其他各期均可查见褐色的疟色素。
除恶性疟病例外，均可查见各期疟原虫。
一般恶性疟病例，仅查见环状体，或可见配子体。
但脑型疟病例，不仅原虫密度高，查见的环状体比一般的粗大，而且可查见大滋养体和裂殖体，疟色素呈黑褐色，这些特点对明确诊断很有帮助。
还有一点值得注意，在非洲感染的非重症恶性疟病例，其环状体往往比国内一般恶性疟病例所见的环状体粗大，胞浆较多，与间日疟原虫小滋养体相似，容易误判为间日疟原虫，但也不能同时查见大滋养体和裂殖体，这一点有别于间日疟原虫感染。
二、瑞氏液染色-光学显微镜（油镜）检查同时制作厚、薄血膜，用瑞氏染液（Wright stain）进行染色。
在厚血膜上加清水2-3滴溶去血红蛋白，染色效果较好。
染色时，先在薄血膜上直接加约1ml瑞氏液染色2min，然后在薄血膜上加与染液等量的水稀释，并引到厚血膜上共染5-6min。
其他参见吉氏液染色法。
三、荧光素吖啶橙染色-荧光显微镜检查要求涂制成直径为1.2-1.5cm的亚厚血膜，不宜过薄。
须用甲醇固定薄血膜，用清水溶去厚血膜的血红蛋白。
吖啶橙1g加pH6.5-7.0磷酸缓冲液100ml配制成1%吖啶橙母液。
目录第一章疟原虫生活史一、概述二、人体内发育三、蚊体内的发育第二章疟原虫镜下形态一、薄血膜中疟原虫形态二、厚血膜中疟原虫形态第三章显微镜使用及维护一、显微镜的构造二、显微镜使用三、使用注意事项四、显微镜的维护保养第四章血片制作与染色一、血片制作二、血膜的染色第五章疟原虫镜检技术一、血液二、血液中各种正常细胞形态三、薄血膜镜检四、厚血膜镜检五、杂质与疟原虫的鉴别六、疟原虫计数附录：疟原虫图谱第一章疟原虫生活史一、概述疟原虫是疟疾的病原体。
疟原虫为单细胞真核生物，属原生动物亚界顶端复合物门、孢子纲、真球虫目、疟原虫科、疟原虫属。
人体疟原虫有4种：间日疟原虫（Plasmodium vivax）、恶性疟原虫(P.falciparum)、三日疟原虫(P.malariae)和卵形疟原虫(P.ovale)，依次引起间日疟、恶性疟、三日疟和卵形疟。
在我国间日疟较常见，恶性疟次之，但对人体危害较间日疟严重，三日疟偶尔发现，卵形疟已无病例报告。
4种人体疟原虫的生物学特征见表1-1。
疟原虫的发育和繁殖，必须通过脊椎动物与昆虫媒介两个宿主，人体疟原虫的宿主是人和按蚊。
疟原虫在人体分别寄生于肝实质细胞和血液中的红细胞内，在蚊体内则寄生于蚊胃，最后积聚于唾腺。
4种人体疟原虫的生活史基本相同，包括在人体内的红细胞外期和红细胞内期以及在蚊体内的配子生殖和孢子增殖两个阶段。
二、人体内发育疟原虫在人体内的发育分成肝细胞内的发育和红细胞内的发育两个阶段。
（一）红细胞外期按蚊吸人血时，按蚊唾腺中的子孢子随唾液进入人体的末梢血液中，在30分钟内，随血流进入肝脏，在肝实质细胞内发育，进行裂体增殖，此时期称红细胞外期（简称红外期）或肝细胞期（简称肝期），此时期的疟原虫称肝期裂殖体。
成熟肝期裂殖体直径为45～60 m，内含数以万计的肝期裂殖子。
肝期裂殖体成熟致使肝细胞破裂，肝期裂殖子释入血液。
不同种疟原虫的此期所需时间不同，从6～12天不等。
间日疟原虫的红外期裂体增殖较为复杂。
目前认为间日疟原虫的子孢子在遗传学上具有两种不同的类型，即速发型子孢子和迟发型子孢子。
速发型子孢子侵入肝细胞后，遂开始红外期裂体增殖，释放出肝期裂殖子侵入红细胞，经裂体增殖引起临床发作。
迟发型子孢子侵入肝细胞后暂不继续发育，处于休眠状态（休眠体），经过一段休眠期后，再发育成为成熟的红外期裂殖体，释放出肝期裂殖子侵入红细胞引起复发。
恶性疟原虫和三日疟原虫无迟发型子孢子，因而恶性疟和三日疟也无复发现象（二）红细胞内期红外期裂殖子从肝细胞释放出来进入血液后，一部分被吞噬细胞消灭，一部分在数分钟后侵入红细胞并开始发育，进行裂体增殖，这个时期称为红细胞内期(简称红内期)。
裂殖子进入红细胞后，其细胞质内出现一个较大的空泡，最初为圆形，细胞质少，围绕着空泡，细胞核在虫体的一侧，颇似戒指的宝石，发育成早期滋养体（亦称环状体）。
以后逐渐发育，虫体和细胞核都渐渐增大，细胞质增多，并分解血红蛋白产生疟色素，其色泽、形状有种的差别，此时的疟原虫称为晚期滋养体（亦称大滋养体），因其细胞质向外伸出不规则的伪足，能呈阿米巴样运动，也称为阿米巴样体。
恶性疟原虫的环状体，在外周血液中经十几个小时的发育，逐渐隐匿在微血管、血窦或其他血流缓慢处，发育成大滋养体及裂殖体，因此在外周血液中很难看到这两个时期。
疟原虫由小滋养体发育成大滋养体的时间间日疟约须8-10个小时，恶性疟原虫10余个小时。
大滋养体发育成熟后虫体变圆，胞质内的空泡消失，核开始分裂，逐渐发育成为成熟裂殖体。
成熟裂殖体的每个核被一份胞质包绕，核的数量因不同虫种而异，一般为8～32个，称为裂殖子。
裂殖体成熟后，被寄生的红细胞破裂，释放出裂殖子。
破裂的红细胞碎片、裂殖子和疟色素等进入血液，引起疟疾临床发作。
一部分裂殖子被巨噬细胞吞食，一部分裂殖子再侵入正常红细胞，开始新一轮的红内期发育，如此循环往复，称为裂体增殖周期。
红内期发育成熟的时间，因不同虫种而异，间日疟原虫和卵形疟原虫为48小时，恶性疟原虫为24~38小时，三日疟原虫为72小时，产生相应的间日发热和三日发热等不同发热周期。
红细胞内的疟原虫经过数次裂体增殖后，部分侵入红细胞的裂殖子不再进行核分裂，而逐渐发育成为雌、雄配子体，或称大、小配子体，这是疟原虫有性生殖的开始。
成熟的雌、雄配子体被雌性按蚊吸入后，便在蚊胃内进行有性生殖。
疟原虫的生活史参见图1-1。
三、蚊体内的发育在按蚊叮吸携带有雌、雄配子体的人血时，红内期疟原虫进入蚊胃，但只有雌、雄配子体能在蚊体内发育和繁殖，其余各期均被消化。
雌、雄配子体在蚊体内的发育和繁殖，包括配子生殖和孢子增殖两个期。
（一）配子生殖在蚊胃内，雌配子体的核经过减数分裂，形成圆形不活动的雌配子。
雄配子体的核分裂成4～8个，细胞浆伸出鞭毛状细丝，每1细胞核进入一条鞭毛状细丝内，形成雄配子。
雄配子游近雌配子，雌、雄配子结合形成圆形的合子，并进一步发育成长形能蠕动的动合子。
动合子穿过蚊胃壁的上皮细胞，停留于上皮细胞和弹性纤维膜之间，发育成卵囊。
此时约为吸血后的第24～72小时。
（二）孢子增殖在卵囊内核反复分裂，形成许多梭状子孢子。
蚊胃壁上的卵囊可有数个到数十个或上百个，一个发育成熟的卵囊内可有1 000到10 000个子孢子。
疟原虫在蚊体内发育时间的长短与温度和湿度有关，室温24℃～26℃，相对湿度75％～80％，是蚊体内疟原虫孢子生殖最适宜的条件。
气温低于16℃或高于30℃时，发育变慢，并退化变性，直至死亡。
成熟子孢子通过卵囊的微孔逸出或卵囊破裂后扩散入血腔，最后聚集于唾腺内。
当含子孢子的雌蚊吸血时，子孢子随唾液进入人体，疟原虫开始其在人体内的发育过程。
表1 4种人体疟原虫的生物学特征图1-1疟原虫的生活史5第二章疟原虫镜下形态采患者的血液制作涂片并染色后，可以在显微镜下观察到疟原虫形态。
常用的血涂片有两种：一种是借推片将血液薄薄地涂在载玻片上，使每个红细胞平铺在玻片上，称薄血膜，因薄血膜血液干燥快，原虫形态极少变形，多用于以观察疟原虫形态与鉴别虫种；另一种是把较多的血液涂成圆形，血膜中血细胞重叠，原虫较为集中，称为厚血膜。
厚血膜涂布面积小，阳性检出率高，厚血膜的镜检效率比薄血膜约高六倍。
现常用的一张载玻片上同时做厚薄血膜各一，厚血膜用来检查，薄血膜供编号和鉴别虫种用。
一、薄血膜中疟原虫形态薄血膜涂制均匀时疟原虫着色良好，结构清晰，便于观察形态和鉴别虫种。
薄血膜上各种红内期疟原虫的形态，见表2-1和图2-1被寄生的红细胞核胞浆空泡核疟色素薛氏小点表2-1 四种疟原虫薄血膜形态鉴别(吉氏染色)二、厚血膜中疟原虫形态厚血膜由于用血量多，细胞重叠，干燥缓慢，以致虫体皱缩，空泡消失，胞质变形，加之红细胞溶解，所以虫种和虫体的鉴别比薄血膜困难。
厚血膜中4种疟原虫形态鉴别要点，见表2-2表2-2 四种疟原虫厚血膜形态鉴别(吉氏染色)图2-1 间日疟原虫形态图2-2 恶性疟原虫形态图2-3三日疟原虫形态图2-4卵形疟原虫形态第三章显微镜使用及维护发热病人血涂片的显微镜检查（简称发热病人血检）是疟疾控制和检测的重要手段，因此掌握显微镜的使用方法和日常维护是十分必要的。
一、显微镜的构造显微镜通常有4个部分组成：A.支撑系统；B.放大系统；C.照明系统；D.调节系统；见图3-1。
图3-1 显微镜的构造（Ａ）支撑系统：1，镜座；2，镜臂；3，镜头座；4，载物台；5，持片夹（图3-2）。
图3-2 显微镜支撑系统（Ｂ）放大系统：1、目镜：放大尺寸为10倍（图3-3）；图3-3 显微镜目镜2、物镜：放大倍数分别为10倍、40倍、100倍，在使用100倍时需要使用镜油（图3-4）。
图3-4 显微镜物镜（C）照明系统：1，反光镜；2，聚光器；3，光圈；固定在聚光器内，它可以调节通过聚光器的光线的强弱（彩图3-5）。
图3-5 显微镜照明系统D）调节系统：1，粗对焦螺旋；2，细对焦螺旋：缓慢移动观察物用以精确调节；3，光圈调节杠杆；4，持片夹：控制玻片向前向后向左向右移动。
二、显微镜使用（一）使用环境与工作习惯显微镜的工作场所应当清洁、干燥、无震动、无腐蚀性气体存在。
台面和凳子的高度要适当。
镜检时，即便用单目显微镜，也须两眼同时睁开。
（二）聚光器及可变光阑的用法一般的聚光镜，在平行光照射的情况下，其焦点落在它上端透镜平面中心上方约1.25mm处。
当使用高倍或油镜时，由于放大率大，镜像亮度小，需要较强的照明。
因此，应把聚光器升至最高，以便使聚光镜的焦点正好落在标本平面上。
但在使用低倍镜时，可将聚光器适当下降。
可变光阑一是控制射向标本的光通量；二是改变聚光器的数值孔径。
在这两个作用中，后者是主要的。
为了使物镜的分辨率得到充分的利用，从原则上说，聚光器的数值孔径应与物镜的相同。
否则，分辨率或清晰度就要下降。
（三）物镜的正确调焦对光完成后，升高镜筒，将标本玻片夹在移动器上，并将欲检查的部分移至载物台通光孔的中央，然后开始调焦。
无论作何种检查，均应从低倍镜开始。
调焦时，先用粗动手轮将镜筒下降，使低倍镜的前透镜与盖玻片之间的距离略缩小于该物镜的工作距离（5mm以下）。
为了避免物镜压在载玻片上，可从侧面窥视。
然后，一边从目镜中观察视野，一边利用粗动手轮将镜筒徐徐上升，待初见物像后，改用微动手轮作精细调焦，直至物像最清晰为止。
低倍物镜的视场大，有利于观察标本的全貌。
从低倍镜转换为高倍镜时，如果物镜是显微镜的原配物镜，所用的载玻片、盖玻片有符合标准，一般都可以进行"等高转换"。
即转换后，只要稍微调节一下微调旋钮，即可看到清晰的图像。
但油镜不强求齐焦，最好先将镜筒升高后再转换，最后按低倍镜的调焦方法重新调焦。
用油镜观察时，要先将物镜移开，在要观察的部位加一滴香柏油，然后将油镜放正，并慢慢转动粗调节器，降下镜筒，使镜头浸入油滴中。
可下降至几乎与制片接触，但切不可压及玻片。
然后，向上微微转动粗调节器，使镜筒上升，当视野中出现有模糊的影像时，改用细调节器向上转到直至影像清晰为止。
在使用油镜时，在聚光镜与标本之间滴加浸油，可提高物镜的分辨率。
在整个调焦过程中（尤其是高倍物镜和油镜的调焦），每个动作都要缓慢进行。
否则，物像会一闪而过，找不到观察目标。
油镜使用完毕后，要及时将浸油擦拭干净。
镜头上可先用干净的擦镜纸擦干净即行。
聚光镜的擦拭方法与此相同。
三、使用注意事项（一）取出显微镜时，要用右手握住执手，左手托住镜座，小心地放到桌面上，不可单手拎着移动。
（二）任何旋钮转动有困难时，绝不能用力过大，而应查明原因，排除障碍。
如果自己不能解决时，要向专业人员请求解决。
所有的镜头均经校验，请勿自行拆开。
（三）保持显微镜的清洁，尽量避免灰尘落到镜头上，否则容易磨损镜头。
