疟原虫显微镜镜检技术

疟疾（Malaria）•系世界六大热带病和我国五大寄生虫病之一，危害极大，非洲每年约100万儿童死于疟疾•疟疾主要分布于热带、亚热带各国，我国的华南、华中(特别是云南和海南)•疟原虫属原生动物亚界--顶复门--孢子纲--疟原虫属•寄生人类的疟原虫有：间日疟原虫、恶性疟原虫、三日疟原虫和卵形疟原虫等•疟原虫通过蚊叮咬而感染人，疟疾的典型临床表现是周期性寒战、发热和出汗•疟疾诊断主要靠外周血涂片检查•用磷酸氯喹及磷酸伯氨喹治疗，对于抗氯喹虫株则宜用青蒿素类药物、或与奎宁、咯萘啶、磺胺多辛和乙胺嘧啶等联合用药疟疾的临床症状临床表现•周期性：冷（1-2h)à热(4-6h) à汗。

实际上发作周期多不典型，尤其是儿童、初发时和进入疟区的初患病例•冷：全身颤拦、皮肤鸡皮样、面色苍白，口唇与指甲发紫等；夏天盖几层棉被也不暖•热：面色绯红、皮肤灼热、体温39-40℃可伴头痛\全身酸痛,小儿或严重成人可发生惊厥、谵亡或昏迷•汗：大汗淋漓、体温急降，乏力•贫血：发作次数越多、病程越长贫血越严重。

•脾肿大、硬化：脾切面颜色变深；大可达脐下；重量可达500至1000g.慢性患者脾纤维化，包膜增厚而变硬原因•发作周期和红内期裂体增殖周期一致。

•疟原虫代谢产物(外源性热原质)和裂殖子、残余和变性血红蛋白、红细胞碎片被吞噬细胞吞食而产生内源性热原质•疟原虫对红细胞的直接破坏•脾巨噬细胞吞噬红细胞•骨髓造血受抑制•免疫病理（正常抗疟抗体+红细胞自身抗体）疟原虫的生活周期生活史中的关注点：1.感染阶段：子孢子2.感染方式：蚊虫叮咬和输血3.致病阶段：红内期原虫4.寄生部位：肝、红细胞5.媒介：蚊(为终宿主）6.诊断阶段：红内期原虫疟疾的实验诊断病原检查:1. 血涂片染色取外周血制成厚、薄血膜，经吉氏或瑞氏液染色镜检2. 采血时间•恶性疟：发作时、查环状体，发作数小时后因晚期滋养体寄生虫的红细胞滞留下皮下脂肪及内脏微血管中，不易查见。

疟原虫镜检技术操作规范疟原虫镜检是诊断疟疾、确定虫种及发现传染源的重要手段和方法，具有严格的操作程序和技术要求，为了统一方法、规范程序、提高血检质量，特制定本操作规范。

一、血片制作（一）所需器材载玻片玻片3张（1张作载玻片，1张作推片，1张作采血后滴于玻片备血用）采血针采用一次性采血针。

玻片盒存放50或100片玻片的木质或塑料盒。

皮肤消毒液、棉签或酒精棉球75%的酒精、安尔碘、碘伏等皮肤表面消毒剂。

记号笔用于玻片上书写血检病人基本信息。

（二）操作步骤1、载玻片基本信息登记取1张载玻片，首先用目测法将载玻片从右（磨砂处为右）到左等分成6格，接着用记号笔在第1、2格即（磨砂处）写下血检病人基本信息：编号、姓名、制片日期结果（镜检结束后补写）。

载玻片上信息应与血检登记表中的项目对应。

如图12、采血采血部位为手指末端或耳垂，婴儿可从拇趾或足跟取血。

用消毒剂消毒取血部位皮肤后，以一次性采血针迅速刺入取血部位1～2mm 深，约挤出1-2滴血，滴于玻片上（以备涂制厚薄血膜用）。

3、涂制血膜用推片的左下角刮取玻片上的血液4～5μl，涂于载玻片的第三格（靠近磨砂侧），由里向外一个方向旋转2～4圈，涂成直径为0.8～1.2cm的圆形厚血膜；再用该角沾取血液1～1.5μl血置于载玻片的中心点即（第四格前缘中点）；接着用干棉球或卫生纸擦净推片角上的血渍；最后用推片的下缘置载玻片的中心点（1～1.5μl血液处），当血液在载玻片与推片之间向两侧扩展至约2cm宽时，使两玻片保持25°～35°角，从右向左迅速推成舌状薄血膜，即（薄血膜涂在第4格前缘至第6格中部）。

如（图1）、（图2）疟原虫镜检涂制血膜方法示意图2薄血膜厚度应以红细胞之间互相接触而不相互重叠为佳，（直观透过玻片能清晰看到报纸上的字）；厚血膜的厚度以一个油镜视野内可见到5～10个白细胞为宜。

二、固定（一）所需器材1、甲醇2、器具玻璃棒、吸管（二）操作步骤薄血膜固定薄血膜晾干后，用玻璃棒沾取或用吸管吸取少量甲醇平铺于薄血膜上，起固定薄血膜作用，（注意不能固定厚血膜）。

疟原虫镜检操作流程疟原虫镜检操作可有趣啦，就像一场小小的探索之旅呢。

一、准备工作。

咱们先得把要用的东西都找齐喽。

那需要啥呢？显微镜肯定是必不可少的啦，就像战士上战场不能没有枪一样。

然后就是载玻片和盖玻片，这俩就像是舞台和舞台上的小屋顶，疟原虫就在这上面表演呢。

还有采血针、酒精棉球这些小物件，采血针用来取血，酒精棉球用来消毒，它们可都是小助手。

另外，染色剂也得准备好，这染色剂就像是给疟原虫化妆的东西，能让咱们把疟原虫看得更清楚。

二、采血。

采血这一步可得小心点儿。

找个舒服的地方让被采血的人坐好或者躺好，别让人家紧张，就像跟朋友聊天似的，说“放松哈，就一下下，不疼的”。

用酒精棉球在手指尖或者耳垂轻轻擦一擦，消消毒。

然后拿起采血针，就像拿一支小小的魔法棒，轻轻一扎，血就出来啦。

把这一滴血小心地滴在载玻片的一端，可别滴太多，也别滴到外面去了，一滴小小的、圆圆的血滴就像一颗红色的小珍珠在载玻片上呢。

三、涂片。

血滴在载玻片上了，咱们就要开始涂片啦。

拿另一个载玻片的一端，轻轻地斜着靠在有血滴的载玻片上，就像小滑梯一样。

然后慢慢地把这个载玻片往前推，让血滴在两个载玻片之间均匀地铺成薄薄的一层。

这一步可有点像画画的时候把颜料涂开，要涂得薄厚均匀才好呢。

如果涂得太厚了，疟原虫就会像躲猫猫一样藏在里面，咱们就不容易看到它啦；要是涂得太薄了，可能疟原虫都没几个在上面，也不好找。

四、固定和染色。

涂片弄好之后呢，要固定一下。

这就像是给疟原虫拍个照片定住它的样子。

可以用小火苗稍微烤一烤载玻片，不过得小心别烤糊了，要不然疟原虫就被烤成小焦炭啦。

固定好之后就到染色的时候了。

把染色剂小心地滴在涂片上，让染色剂把疟原虫包裹起来，就像给疟原虫穿上一件彩色的衣服。

等染色剂在涂片上待一会儿，就像让疟原虫在染缸里泡个澡，把自己染得美美的。

五、镜检。

终于到了最激动人心的镜检啦。

把载玻片放在显微镜的载物台上，就像把宝贝放在展示台上一样。

先从低倍镜开始看，慢慢地转动粗准焦螺旋，让镜头一点点靠近载玻片，就像在寻找宝藏一样。

疟原虫镜检技术血片制作与染色一、血片制作（一）所需器材1、载玻片：玻片使用前应清洗。

新玻片应先浸入有液态洗涤剂的清水中10~20分钟，然后用干净棉巾逐个擦拭，再用清水冲洗干净，晾干，最后用干净、柔软的棉巾将玻片擦亮。

用于特殊的目的时，最后可将玻片浸泡在95％酒精中5~10分钟，再将玻片擦干擦亮。

已用过的玻片应先浸泡于洗涤剂溶液中1~2天，或浸泡于煮沸的5％肥皂水中1~2小时，再移到新配置的洗涤剂溶液中1~2小时，逐个擦去玻片上旧的血膜痕迹，用清水漂洗干净，再将玻片擦干擦亮。

洗净的玻片每10~20张用白纸包好放入塑料袋内，保存于干燥环境中备用。

2、采血针：使用一次性釆血针。

3、玻片盒：为防止污染和苍蝇吸食血膜，新制作的血膜应放在玻片盒中，厚血膜放置时要保持水平，直到充分干燥。

4、75％酒精棉球：用于采血前后的消毒。

5、记号笔或铅笔：用于玻片上书写号码。

（二）采血部位及取血方法采血部位以耳垂较为合适，也可在手指末端采血，婴儿可从拇趾或足跟取血。

先用75％酒精棉球消毒取血部位后，以一次性采血针迅速刺入取血部位1~2mm深，然后用左手大拇指、食指和右手中指协同挤出血滴。

（三）涂制血膜取玻片2张，1张作载片，1张作推片（具有光滑边缘）。

用右手拇指和食指夹持推片侧缘中部，用推片的左下角刮取血液4~5μl，再用该端中部刮取血液1~1.5μl。

将左下角的血滴涂于载片的中央偏右处，由里向外划圈涂成直径为0.8~1cm的圆形厚血膜（厚度以1个油镜视野内可见到5~10个白细胞为宜）。

用干棉球抹净玻片角上的血渍，然后将推片下缘平抵载玻片的中线，当血液在载玻片与推片之间向两侧扩展至约2cm宽时，使两玻片保持25°～35°角，从右向左迅速向前推成舌状薄血膜，制成的薄血膜应在玻片上形成平铺的血细胞，细胞之间互相接触而不相互重叠。

每张载玻片上分别做1个薄血膜，1个厚血膜。

取干净玻片及推片各一张，用右手大拇指和食指夹持推片侧缘中部，用推片的左下角刮取血液4～5μl（约火柴头大小），再用该端中部刮取血液1～1.5μl。

疟原虫镜检技术操作规范1.目的指导实验室检验人员正确使用和维护全显微镜，完成疟原虫检测项目2、范围适用于实验室检验人员3、职责检验人员需按照本操作规程使用和维护全显微镜, 确保仪器在最佳状态下运行，以便得到正确的结果，提高结果准确率。

4、作业指导4.1.需用器材显微镜单、双目显微镜均可，目镜一般以5X为宜（有的用10X），物镜必须用油镜（100X）、镜油、擦镜纸、二甲苯或酒精乙醚4.2操作步骤4.2.1、血膜上滴加镜油滴一滴镜油在血膜上，再将血片置载物台上。

4.2.2、镜检用目镜5×和物镜10～40×低倍镜检下找到血膜，再将物镜转换成油镜（100×），查找疟原虫，吉氏染色较好的血膜，红细胞呈淡红色，嗜酸性细胞的颗粒呈鲜红色，淋巴细胞及疟原虫胞浆呈蓝色或淡蓝色，白细胞的核呈紫蓝色，疟原虫的核呈红色。

4.2.3、观察血膜的方法镜检时从血膜的一端开始，自上而下，自左而右，逐个视野顺序查看。

发热病人血片至少要查完200个视野以上，普查带虫血片则需看完全片，方可报告结果。

镜检疟原虫一般只查厚血膜，薄血膜作为疟原虫的分类定种。

4.3、结果报告结果报告分阳性和阴性，阳性者至少要查见一个典型疟原虫（并需鉴别虫种和期别）方可确定；以查完整个厚血膜，未查见疟原虫者判为阴性。

4.4、注意事项4.4.1染色前血膜的保存新制作的血膜应防止污染和苍蝇吸食血膜，新鲜厚血膜放置时要保持水平，直到充分干燥后可不溶血直接染色。

血膜放置时间，夏天不宜超过48小时，冬天不宜超过72小时，否则厚血膜会自然固定而不能溶血，影响镜检。

不能即时染色的血膜，可先用甲醇固定薄血膜，将厚血膜溶血，晾干后包好，放入干燥器中，置于冰箱内保存。

临用时，将干燥器放置室温中1～2小时后取出血片。

4.4.2、患者资料应登记详细，确保能追踪随访，个案调查、登记、统计等资料应有专人负责保管。

4.4.3、镜检人员应加强自身防护，操作戴手套、穿工作服。