疟原虫的镜检技术

疟原虫镜检技术操作规范疟原虫镜检是诊断疟疾、确定虫种及发现传染源的重要手段和方法，具有严格的操作程序和技术要求，为了统一方法、规范程序、提高血检质量，特制定本操作规范。

一、血片制作（一）所需器材载玻片玻片3张（1张作载玻片，1张作推片，1张作采血后滴于玻片备血用）采血针采用一次性采血针。

玻片盒存放50或100片玻片的木质或塑料盒。

皮肤消毒液、棉签或酒精棉球75%的酒精、安尔碘、碘伏等皮肤表面消毒剂。

记号笔用于玻片上书写血检病人基本信息。

（二）操作步骤1、载玻片基本信息登记取1张载玻片，首先用目测法将载玻片从右（磨砂处为右）到左等分成6格，接着用记号笔在第1、2格即（磨砂处）写下血检病人基本信息：编号、姓名、制片日期结果（镜检结束后补写）。

载玻片上信息应与血检登记表中的项目对应。

如图12、采血采血部位为手指末端或耳垂，婴儿可从拇趾或足跟取血。

用消毒剂消毒取血部位皮肤后，以一次性采血针迅速刺入取血部位1～2mm 深，约挤出1-2滴血，滴于玻片上（以备涂制厚薄血膜用）。

3、涂制血膜用推片的左下角刮取玻片上的血液4～5μl，涂于载玻片的第三格（靠近磨砂侧），由里向外一个方向旋转2～4圈，涂成直径为0.8～1.2cm的圆形厚血膜；再用该角沾取血液1～1.5μl血置于载玻片的中心点即（第四格前缘中点）；接着用干棉球或卫生纸擦净推片角上的血渍；最后用推片的下缘置载玻片的中心点（1～1.5μl血液处），当血液在载玻片与推片之间向两侧扩展至约2cm宽时，使两玻片保持25°～35°角，从右向左迅速推成舌状薄血膜，即（薄血膜涂在第4格前缘至第6格中部）。

如（图1）、（图2）疟原虫镜检涂制血膜方法示意图2薄血膜厚度应以红细胞之间互相接触而不相互重叠为佳，（直观透过玻片能清晰看到报纸上的字）；厚血膜的厚度以一个油镜视野内可见到5～10个白细胞为宜。

二、固定（一）所需器材1、甲醇2、器具玻璃棒、吸管（二）操作步骤薄血膜固定薄血膜晾干后，用玻璃棒沾取或用吸管吸取少量甲醇平铺于薄血膜上，起固定薄血膜作用，（注意不能固定厚血膜）。

疟原⾍检测⾎涂⽚镜检法ICS11.020C62WS 中华⼈民共和国卫⽣⾏业标准WS/T 569—2017疟原⾍检测⾎涂⽚镜检法Microscopic examination of blood films for malaria parasites2017-08-01发布2018-02-01实施前⾔本标准按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。

本标准起草单位：海南省疾病预防控制中⼼、江苏省寄⽣⾍病防治研究所、中国疾病预防控制中⼼寄⽣⾍病预防控制所、云南省寄⽣⾍病防治所、海南省农垦总局医院。

本标准主要起草⼈：王善青、⾼琪、汤林华、杨恒林、郑彬、胡锡敏、王光泽、李⾬春、刘莹、欧阳范献。

疟原⾍检测⾎涂⽚镜检法1 范围本标准规定了⾎涂⽚镜检法检测疟原⾍的技术规范。

本标准适⽤于各级疾病预防控制机构和医疗机构对疟原⾍的显微镜检测。

2 术语和定义下列术语和定义适⽤于本⽂件。

2.1疟原⾍Plasmodium spp疟原⾍是⼀类单细胞、寄⽣性的真核动物，是疟疾（malaria）的病原体。

寄⽣于⼈体的疟原⾍主要有恶性疟原⾍（Plasmodium falciparum）、间⽇疟原⾍（Plasmodium vivax）、三⽇疟原⾍（Plasmodium malariae）和卵形疟原⾍（Plasmodium ovale）等。

2.2⾎涂⽚ blood films将⾎液涂制于载玻⽚上制成的涂⽚。

供显微镜疟原⾍检查⽤的⾎涂⽚包括厚⾎膜涂⽚和薄⾎膜涂⽚两种。

3 仪器和器材3.1 ⽣物显微镜（100×油浸物镜、5×或10×⽬镜）。

3.2 计数器。

3.3 载玻⽚（⽆划痕⽆油污的洁净载玻⽚）。

3.4 推⽚。

3.5 ⾎⽚染⾊架。

3.6 ⾎⽚⼲燥架。

3.7 玻⽚盒。

3.8 染⾊盘和染⾊缸。

4 试剂和材料4.1 吉⽒染⾊原液。

4.2 pH7.2磷酸盐缓冲液（PBS）。

4.3 甲醇（分析纯）。

4.4 ⾹柏油或专⽤浸油（折射率≥1.5）。

疟原虫镜检技术血片制作与染色一、血片制作（一）所需器材1、载玻片：玻片使用前应清洗。

新玻片应先浸入有液态洗涤剂的清水中10~20分钟，然后用干净棉巾逐个擦拭，再用清水冲洗干净，晾干，最后用干净、柔软的棉巾将玻片擦亮。

用于特殊的目的时，最后可将玻片浸泡在95％酒精中5~10分钟，再将玻片擦干擦亮。

已用过的玻片应先浸泡于洗涤剂溶液中1~2天，或浸泡于煮沸的5％肥皂水中1~2小时，再移到新配置的洗涤剂溶液中1~2小时，逐个擦去玻片上旧的血膜痕迹，用清水漂洗干净，再将玻片擦干擦亮。

洗净的玻片每10~20张用白纸包好放入塑料袋内，保存于干燥环境中备用。

2、采血针：使用一次性釆血针。

3、玻片盒：为防止污染和苍蝇吸食血膜，新制作的血膜应放在玻片盒中，厚血膜放置时要保持水平，直到充分干燥。

4、75％酒精棉球：用于采血前后的消毒。

5、记号笔或铅笔：用于玻片上书写号码。

（二）采血部位及取血方法采血部位以耳垂较为合适，也可在手指末端采血，婴儿可从拇趾或足跟取血。

先用75％酒精棉球消毒取血部位后，以一次性采血针迅速刺入取血部位1~2mm深，然后用左手大拇指、食指和右手中指协同挤出血滴。

（三）涂制血膜取玻片2张，1张作载片，1张作推片（具有光滑边缘）。

用右手拇指和食指夹持推片侧缘中部，用推片的左下角刮取血液4~5μl，再用该端中部刮取血液1~1.5μl。

将左下角的血滴涂于载片的中央偏右处，由里向外划圈涂成直径为0.8~1cm的圆形厚血膜（厚度以1个油镜视野内可见到5~10个白细胞为宜）。

用干棉球抹净玻片角上的血渍，然后将推片下缘平抵载玻片的中线，当血液在载玻片与推片之间向两侧扩展至约2cm宽时，使两玻片保持25°～35°角，从右向左迅速向前推成舌状薄血膜，制成的薄血膜应在玻片上形成平铺的血细胞，细胞之间互相接触而不相互重叠。

每张载玻片上分别做1个薄血膜，1个厚血膜。

取干净玻片及推片各一张，用右手大拇指和食指夹持推片侧缘中部，用推片的左下角刮取血液4～5μl（约火柴头大小），再用该端中部刮取血液1～1.5μl。

目录第一章疟原虫生活史一、概述二、人体内发育三、蚊体内的发育第二章疟原虫镜下形态一、薄血膜中疟原虫形态二、厚血膜中疟原虫形态第三章显微镜使用及维护一、显微镜的构造二、显微镜使用三、使用注意事项四、显微镜的维护保养第四章血片制作与染色一、血片制作二、血膜的染色第五章疟原虫镜检技术一、血液二、血液中各种正常细胞形态三、薄血膜镜检四、厚血膜镜检五、杂质与疟原虫的鉴别六、疟原虫计数附录：疟原虫图谱第一章疟原虫生活史一、概述疟原虫是疟疾的病原体。

疟原虫为单细胞真核生物，属原生动物亚界顶端复合物门、孢子纲、真球虫目、疟原虫科、疟原虫属。

人体疟原虫有4种：间日疟原虫（Plasmodium vivax）、恶性疟原虫(P.falciparum)、三日疟原虫(P.malariae)和卵形疟原虫(P.ovale)，依次引起间日疟、恶性疟、三日疟和卵形疟。

在我国间日疟较常见，恶性疟次之，但对人体危害较间日疟严重，三日疟偶尔发现，卵形疟已无病例报告。

4种人体疟原虫的生物学特征见表1-1。

疟原虫的发育和繁殖，必须通过脊椎动物与昆虫媒介两个宿主，人体疟原虫的宿主是人和按蚊。

疟原虫在人体分别寄生于肝实质细胞和血液中的红细胞内，在蚊体内则寄生于蚊胃，最后积聚于唾腺。

4种人体疟原虫的生活史基本相同，包括在人体内的红细胞外期和红细胞内期以及在蚊体内的配子生殖和孢子增殖两个阶段。

二、人体内发育疟原虫在人体内的发育分成肝细胞内的发育和红细胞内的发育两个阶段。

（一）红细胞外期按蚊吸人血时，按蚊唾腺中的子孢子随唾液进入人体的末梢血液中，在30分钟内，随血流进入肝脏，在肝实质细胞内发育，进行裂体增殖，此时期称红细胞外期（简称红外期）或肝细胞期（简称肝期），此时期的疟原虫称肝期裂殖体。

成熟肝期裂殖体直径为45～60 m，内含数以万计的肝期裂殖子。

肝期裂殖体成熟致使肝细胞破裂，肝期裂殖子释入血液。

不同种疟原虫的此期所需时间不同，从6～12天不等。

疟原虫镜检技术操作规范1.目的指导实验室检验人员正确使用和维护全显微镜，完成疟原虫检测项目2、范围适用于实验室检验人员3、职责检验人员需按照本操作规程使用和维护全显微镜, 确保仪器在最佳状态下运行，以便得到正确的结果，提高结果准确率。

4、作业指导4.1.需用器材显微镜单、双目显微镜均可，目镜一般以5X为宜（有的用10X），物镜必须用油镜（100X）、镜油、擦镜纸、二甲苯或酒精乙醚4.2操作步骤4.2.1、血膜上滴加镜油滴一滴镜油在血膜上，再将血片置载物台上。

4.2.2、镜检用目镜5×和物镜10～40×低倍镜检下找到血膜，再将物镜转换成油镜（100×），查找疟原虫，吉氏染色较好的血膜，红细胞呈淡红色，嗜酸性细胞的颗粒呈鲜红色，淋巴细胞及疟原虫胞浆呈蓝色或淡蓝色，白细胞的核呈紫蓝色，疟原虫的核呈红色。

4.2.3、观察血膜的方法镜检时从血膜的一端开始，自上而下，自左而右，逐个视野顺序查看。

发热病人血片至少要查完200个视野以上，普查带虫血片则需看完全片，方可报告结果。

镜检疟原虫一般只查厚血膜，薄血膜作为疟原虫的分类定种。

4.3、结果报告结果报告分阳性和阴性，阳性者至少要查见一个典型疟原虫（并需鉴别虫种和期别）方可确定；以查完整个厚血膜，未查见疟原虫者判为阴性。

4.4、注意事项4.4.1染色前血膜的保存新制作的血膜应防止污染和苍蝇吸食血膜，新鲜厚血膜放置时要保持水平，直到充分干燥后可不溶血直接染色。

血膜放置时间，夏天不宜超过48小时，冬天不宜超过72小时，否则厚血膜会自然固定而不能溶血，影响镜检。

不能即时染色的血膜，可先用甲醇固定薄血膜，将厚血膜溶血，晾干后包好，放入干燥器中，置于冰箱内保存。

临用时，将干燥器放置室温中1～2小时后取出血片。

4.4.2、患者资料应登记详细，确保能追踪随访，个案调查、登记、统计等资料应有专人负责保管。

4.4.3、镜检人员应加强自身防护，操作戴手套、穿工作服。