AmpC酶

大肠埃希菌质粒AmpC酶和ESBLs的基因型及耐药性研究的开题报告题目：大肠埃希菌质粒AmpC酶和ESBLs的基因型及耐药性研究研究背景与意义：大肠杆菌是人和动物肠道中的常见菌群，也是医院及社区中最常见的致病菌之一，其感染可引发泌尿系统、胃肠道、呼吸道、软组织等多种感染病。

然而，随着抗生素的广泛应用及滥用，大肠杆菌对抗生素的耐药性越来越严重，其中质粒AmpC酶和ESBLs的产生是造成其耐药性快速蔓延和治疗的难点之一。

因此，对大肠杆菌质粒AmpC酶和ESBLs 的基因型及其耐药性的研究，对于控制大肠杆菌的传播及其感染具有重要的意义。

研究内容与目的：本研究旨在分离临床大肠杆菌中的质粒AmpC酶和ESBLs阳性株，并对其进行药敏试验，比较不同基因型的耐药表型特点。

同时，对质粒AmpC酶和ESBLs的基因型进行PCR扩增及测序，分析其基因类型、序列差异及功能特征。

通过这些研究，探究大肠杆菌质粒AmpC酶和ESBLs基因型及其耐药性特征对于治疗和预防大肠杆菌感染的重要性。

研究方法：1. 分离临床大肠杆菌中的质粒AmpC酶和ESBLs阳性株，并进行药敏试验。

2. 分别利用PCR扩增、测序和比对分析，得到质粒AmpC酶和ESBLs的基因型及序列。

3. 利用构建重组表达载体等方法，验证质粒AmpC酶和ESBLs的序列特点及其与耐药性之间的联系。

研究进度及安排：1. 完成临床样品的采集及初步病原体分离鉴定（2个月）。

2. 进行药敏试验及筛选质粒AmpC酶和ESBLs阳性株（3个月）。

3. 利用PCR扩增、测序和比对分析，得到质粒AmpC酶和ESBLs的基因型及序列（4个月）。

4. 利用构建重组表达载体等方法，验证质粒AmpC酶和ESBLs的序列特点及其与耐药性之间的联系（5个月）。

5. 结果分析及撰写论文（2个月）。

预期结果及意义：研究结果将为控制大肠杆菌的耐药性提供科学依据，为制定相应的感染预防策略提供重要参考。

革兰阴性杆菌产AmpC酶及ESBLs的检测及耐药性为研究ESBLs、产AmpC酶革兰阴性杆菌的耐药状况，我们对158株革兰阴性杆菌进行耐药性分析及产AmpC酶和ESBLs的检测，并将结果报告如下。

一、材料和方法1 材料1.1 菌株来源2008年10月～2009年12月期间从我院临床标本中分离的至少对一种三代头孢菌素类耐药的部分革兰阴性杆菌。

其中包括大肠埃希菌47株，肺炎克雷伯菌38株，鲍曼不动杆菌23株，铜绿假单胞菌15株，阴沟肠杆菌15株，嗜麦芽假单胞菌6株，产气肠杆菌6株、液化沙雷氏菌4株，弗劳第枸橼酸杆菌4株，共158株。

1.2 试剂增菌培养基为M-H肉汤，三维实验培养基为M-H琼脂，头孢西丁(CFX)、头孢他啶(CAZ)、头孢他啶／棒酸(CAZ／CLA)，头孢噻肟(CTX)、头孢噻肟／棒酸(CTX／CLA)为英国Oxoid公司产品。

GNI鉴定卡、GNS药敏卡均购自法国Biomerievx公司，GNS药敏卡包括氨苄青霉素、庆大霉素、环丙沙星、阿莫西林／克拉维酸、头孢噻吩、头孢他啶、哌拉西林、哌拉西林／他唑巴坦、丁胺卡那、复方新诺明、萘啶酸、头孢噻肟、亚胺培南13种抗菌药物。

1.3 质控菌株质控菌株E．Coil ATCC25922，K.Pneumoniae ATCC700603，E．Cloacae 029 M。

2 实验方法2.1 菌株鉴定所有菌株都用VITEK-32分析仪GNI细菌鉴定卡进行菌种鉴定。

2.2 体外药物敏感试验采用GNS检测卡测定13种抗菌药物对158株革兰阴性杆菌的MIC值，操作方法按照VITEK-32规定的方法进行。

2.3 产ESBLs菌株检测2.3.1 ESBLs筛选试验方法158株革兰阴性杆菌经VITEK-32检测MIC值，根据仪器专家系统提示，筛选出产ESBLs菌株。

2.3.2 ESBLs确证试验方法采用纸片扩散确证法，按2004年NCCLS推荐的标准纸片扩散确证法测定ESBLs，采用CAZ(30μg)、 CAZ／CLA(30μg/10μg)组合或者CTX(30μg)、CTX／CLA(30μg／10μg)组合，对ESBLs筛选实验阳性菌株进行双纸片协同扩散试验，任一组药物抑菌环的直径差≥5mm时，判定为ESBLs阳性菌株。

国外医学呼吸系统分册２００２年第２２卷第４期ＡｍｐＣ酶诱导调节机制及治疗对策的研究进展中国医科大学附属一院呼吸疾病研究所（１１０００１）夏丽萍综述康健于润江审校岛Ｓｂ＾摘要诱导性Ａｍｐｃ阻内酰胺酶弓Ｉ起的革兰氏阴性杆菌对第三代头孢菌素技单环类抗生素的耐药，已成为Ｉ临床抗感染治疗失败的关键。

目前，国内外对Ａｍｐｃ酶诱导调节的机制尚未完全阐明．但是认为与ａｍｐＲ、ａｍｐｌ）、ａｍｐＥ及ａｍｐＧ的调节有关。

本文就ＡｍｐＣ酶的分子结构、诱导调节机制及治疗对策的研究现状作一综述：关■词ＡｍｐＣｔ｝内酰胺酶；诱导调节机制；治疗对策革兰氏阴性杆菌对８－内酰胺类抗生素的抵抗，已成为今天临床抗感染治疗面临的严重问题。

近年来，在革兰氏阴性杆菌中，导致ｐ内酰胺类抗生素耐药现象的主要机制是产生阻内酰胺酶。

其中由Ａｍｐ嗥内酰胺酶引起的细菌耐药日益增多。

Ａｍｐ（牮一内酰胺酶属Ｂｕｓｈ＿Ｊ—Ｍ１群，是不被克拉维酸抑制的“丝氨酸”头孢菌素酶，具有被融内酰胺类抗生素诱导合成的特性。

主要存在于肠杆菌、柠檬酸杆菌、粘质沙雷氏菌、摩氏摩根菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希氏菌、志贺氏菌、克雷伯杆菌等菌属中…。

以往认为编码Ａｎ『ｌｐＣ酶的基因只位于染色体上，但最近研究发现，编码ＡｍｐＣ酶的基因有随质粒转移的迹象【２１。

这将意味着产Ａｍｐｃ酶的革兰氏阴性杆菌引起的感染随时可能在全球范围内暴发流行。

目前，国内外对ＡｍｐＣ酶诱导调节的机制及如何治疗临床上由产ＡｍｐＣ酶的革兰氏阴性茵引起的感染尚无定论。

本文就ＡｍｐＣ酶的分子结构、诱导调节机制及治疗对策的研究现状作一综述。

１Ａｍｐｃ阻内酰胺酶的基因构成及功能目前认为，革兰氏阴性杆菌染色体编码的诱导性ＡｍｐＣｐ内酰胺酶的表达受ａｍｐ复合操纵子调控．由５个不连锁基因即ａｒｎｐＣ、ａｒｎｐＲ、ａｍｐＤ、ａｒｎｐＥ和ａｍｐＧ组成¨Ｊ。

ａｍｐＣ是ＡｍｐＣ酶的结构基因，编码产生ＡｍｏＣ酶蛋白；基因ａｍｐＲ、ａｍｐＤ、ａｍｐＥ、ａｒｎｐＧ是ＡｍｐＣ酶的调节基因，参与调控ＡｍｐＣ酶的合成过程。

ampc酶细菌的耐药特点
1. AMPC 酶细菌的耐药那可真是厉害啊！就像一个打不死的小强。

比
如说，我们常用的一些抗生素，它根本就不放在眼里，照样活得好好的，这多让人头疼啊！
2. 你知道吗，AMPC 酶细菌的耐药有时候就像一道坚固的城墙，很难突破。

就像对待某些顽固的细菌感染，用了好多药都没啥效果，这不是很气人嘛！
3. AMPC 酶细菌的耐药简直就是个大麻烦呀！好比是一场很难打的仗。

就
好比医生们在和它的战斗中，常常要费好大的劲才能找到有效的办法，真不容易啊！
4. AMPC 酶细菌的耐药特点真的很让人无奈啊！它就像一个调皮的孩子，
总是很难管教。

比如说，本来有效的治疗方法，过一阵子可能就不行了，这可怎么搞呀！
5. AMPC 酶细菌的耐药可真是顽强啊！就跟野草似的。

哪怕你一次次去试
图消灭它，它还是会想方设法存活下来，太顽固了吧！
6. 看看 AMPC 酶细菌的耐药呀，太让人恼火了！就好比你有一把钥匙，但
就是打不开那扇门。

不管你怎么努力尝试不同的药，它就是不买账，气死人啦！
7. AMPC 酶细菌的耐药真的是个超级大难题啊！就像一座难以翻越的高山。

想想医生们为了解决这个问题，得付出多少努力和智慧，真的希望能早点战胜它呀！
我的观点结论：AMPC 酶细菌的耐药确实给治疗带来了很大的挑战，我们必须不断探索新的方法和药物来应对这一难题，不能让它肆意妄为啊！。

AmpC酶的检测方法及在临床耐药菌检测中的意义抗生素耐药性问题已成为全球关注的焦点，而我国又是世界上滥用抗生素最为严重的国家之一，因此，有必要加强对细菌耐药性的检测、监测，才能及时发现并控制耐药菌的传播。

目前，对于耐药菌产生的重要β-内酰胺酶—超广谱β-内酰胺酶（ESBLs），大家有比较深入的认识，其检测技术也日趋成熟，但是对于在革兰氏阴性杆菌耐药中扮演着同样重要角色的酶—AmpC酶却了解甚少。

1 什么是AmpC酶AmpC酶属Ambler分类中的C组酶，其基因为ampC而得名。

AmpC酶是由细菌染色体或质粒介导产生的一类β-内酰胺酶，其作用于头孢菌素，且不被克拉维酸所抑制，故AmpC酶又称为头孢菌素酶。

染色体介导的AmpC酶可被β-内酰胺类抗生素诱导，属于诱导酶。

质粒介导的AmpC酶（pAmpC酶）与前者不同，pAmpC酶高水平持续表达，且可通过转化、接合等方式转移给其它菌种，造成耐药性的广泛传播。

1989年韩国首次报道发现一种质粒介导的AmpC酶（CMY-1），1990年在美国发现另一种pAmpC酶（MIR-1），目前已有20多种pAmpC酶被陆续报道。

根据AmpC酶的遗传学关系，可将pAmpC酶分为5个家族：（1）枸橼酸杆菌起源的LAT族；（2）未知起源的FOX族；（3）阴沟肠杆菌起源的Entb族；（4）摩根摩根菌起源的Morg族；（5）蜂房哈夫尼起源的Haf族 [1]。

根据AmpC酶的产生方式又可将其分为3类：诱导高产酶、持续高产酶和持续低产酶。

（1）诱导高产酶：AmpC酶的合成往往与β-内酰胺类抗生素的存在有关。

大部分肠杆菌科细菌和铜绿假单胞菌在无β-内酰胺类抗生素存在的条件下只产生少量的AmpC酶。

当有诱导作用的β-内酰胺类抗生素存在时，AmpC酶的产量明显增加。

（2）持续高产酶：即产AmpC酶的菌株无论在有无β-内酰胺类抗生素存在的条件下均可持续高水平产生AmpC酶，其原因为去阻遏突变。

质粒介导ampc型β-内酰胺酶的基因型和检测方法质粒介导ampc型β-内酰胺酶是一种常见的抗生素耐药基因。

该基因的存在会导致细菌对β-内酰胺类抗生素的耐药性增强，从而使得抗生素治疗变得更加困难。

因此，对于该基因的检测显得尤为重要。

首先，我们需要了解质粒介导ampc型β-内酰胺酶的基因型。

该基因是由ampC基因突变所导致的，因此其基因型可以分为两种：突变型和野生型。

突变型ampC基因会导致细菌产生抗生素酶，从而增强其耐药性；而野生型ampC基因则不会产生抗生素酶，因此细菌对抗生素的敏感性较高。

接下来，我们需要了解质粒介导ampc型β-内酰胺酶的检测方法。

目前，常用的检测方法包括PCR扩增法、DNA芯片法、荧光原位杂交法等。

其中，PCR扩增法是最为常用的一种方法。

具体步骤如下：1. 提取待检测菌株的DNA。

2. 设计特异性引物，用PCR扩增出ampC基因片段。

3. 对PCR产物进行电泳分析，观察是否存在目标片段。

4. 对PCR产物进行序列分析，确定其基因型。

除了PCR扩增法外，DNA芯片法也是一种快速、高通量的检测方法。

该方法利用芯片上的探针与待检测DNA序列进行互补杂交，从而实现对目标基因的检测。

荧光原位杂交法则是一种直接观察细菌中目标基因表达情况的方法，其原理是利用荧光标记的探针与待检测菌株中的RNA序列进行互补杂交，从而实现对目标基因表达情况的观察。

总之，质粒介导ampc型β-内酰胺酶的检测对于临床抗生素治疗具有重要意义。

通过合理选择检测方法，并结合临床表现和药敏试验结果，可以更好地指导抗生素治疗方案的制定。

AmpG在AmpC酶表达中的调控作用及研究进展文章编号:1007～4287(2012)01～0176一O4ChinJLabDiagn,January,2012,V ol16,No.1AmpG在AmpC酶表达中的调控作用及研究进展洛丹婷,多丽波(哈尔滨医科大学附属第二医院,黑龙江哈尔滨150001)AmpC酶,是由革兰氏阴性菌产生的一种G一内酰胺酶口].近年来,由于8一内酰胺类抗菌药物的过度使用,使得p一内酰胺酶介导的耐药情况越来越严重,最终给临床抗菌药物的选择和治疗带来了困难].AmpC酶能够水解三代头孢菌素酶,单环类和头霉素类抗生素,而且不受酶抑制剂所抑制l3I.AmpC酶的作用机制目前还没有完全确定,它的出现与细胞壁肽聚糖循环相关,至少有四个基因参与了AmpC酶的表达,分别为ampR,ampD,ampG和ampE,其中ampR和ampD的相关性研究较多,而ampG和ampE的研究甚少.现就其调控因子之一,AmpG的研究进展作一综述.lAmpC酶表达的调控机制'I.1amp复合操纵子学说AmpCB～内酰胺酶的表达受到amp复合操纵子的调控.amp复合操纵子由ampC,ampR,ampD,ampE和ampG基因构成【".其中ampC是结构基因,编码产生Ampc口一内酰胺酶.ampR与ampC相邻排列,反向编码AmpC酶的转录调控因子AmpR,属于LysR调节子家族].ampD位于染色体远端,编码N一乙酰葡萄糖胺一I一丙氨酸酰胺酶(AmpD),是AmpCI3一内酰胺酶表达的负性调控蛋白;ampE位于ampD的下游,编码产生的内膜蛋白AmpE充当一个信号感受器'].ampG编码的跨膜蛋白AmpG,作为一种透酶在AmpcB一内酰胺酶表达调控中起着向胞浆传递诱导信号的作用].在无诱导剂存在时,AmpG参与正常的细胞壁肽聚糖循环,AmpD与AmpR形成复合体,AmpR由于不能被激活,作为抑制因子抑制ampC的转录,细菌只表达基础水平的AmpC酶;在诱导剂存在时,AmpG感知这一信息并将其传递至胞浆内,AmpD与其相互作用不再与Am—pR形成复合物,使AmpR能够发挥激活子的作用,激活ampC的转录,此时AmpC酶呈诱导性表达;当AmpD缺失或突变时,产生有功能缺陷的AmpD蛋白,不能与AmpR形成复合体,导致AmpR持久处于转录激活因子状态,引起酶的高水平表达,即为AmpC酶的去阻遏表达.1.2细胞壁肽聚糖循环机制1997年Jacobsll12在对细菌细胞壁和耐药性关系的研究中发现,细胞壁代谢产生的胞壁质在基质中被水解,产生N一乙酰葡糖胺一N一乙酰胞壁酰三肽(G—aMT),被AmpG基金项目:国家自然科学基金资助项目(30672005)*通讯作者图1AmpC酶的基因调控机制转入胞质中.aMT存在两种裂解途径,①直接被AmpD分解,生成三肽;②被葡萄糖苷酶(Gamse)分解掉N一乙酰葡糖胺,生成脱水N一乙酰胞壁酰三肽(aMT),再被AmpD分解生成三肽.两种情况下产生的三肽都会与肽聚糖的前体物质UDP—N一乙酰胞壁酸酯结合,生成UDP—N一乙酰胞壁酰五肽(UDP—aMP),重新参与到胞壁质的生物合成中.aMT对AmpR具有活化作用,而UDP—aMP对AmpR具有抑制作用.在诱导剂不存在时,UDP-aMP使AmpR保持在非活化的形式.在诱导剂存在时,这种非活性即被解除.ampD发生突变或缺失时,其底物aMT将在胞内大量聚积,取代UDP—aMP与ArnpR结合,使AmpR重新活化.可见,内酰胺酶的表达就是通过aMT和UDP--aMP这两种胞壁肽的相对水平调控的.然而,DietzDl1等人认为,AmpG也可以将N一乙酰葡糖胺一N一乙酰胞壁酰五肽(G-aMP)转运至胞内,其水解产物N一乙酰胞壁酰五肽(aMP)取代UDP—aMP 与AmpR结合,使AmpR由抑制子变为激活子.2AmpG的信号转导及调控作用AmpG(53Dka)是染色体B一内酰胺酶诱导的一个信号转导蛋白.AmpG存在于很多细菌中,其将肽聚糖的代谢产物转运至细胞内,起到透酶的作用,与AmpC酶的表达有着密切联系.但是在一些不产AmpC酶的细菌中也存在着AmpG.2.1肠杆菌菌属中的AmpG蛋白1989年KorfmannE"等人将ampC,ampR或ampD基因分别导入阴沟肠杆菌(E.cloacae)55M—L(ampD-,ampG一),发现E.cloacae55M—L不能恢复到野生型菌株E.cloacae55的表型,而将ampD和ampG同时导入E.cloacae55M—L时重建了诱导性的野生表型,证明了ampG为E.cloacaeAmpC[3-~ 酰胺酶表达所必需.1995年Schmidt等人采用亚硝基胍(NTG)对大肠埃希菌(E.coli)sNo301(带有E.cloacaeampC一mpR)进行化学诱变,得到了三个ampG基因突变体AmDG1(G151-->D151),AmpG3(G268-->D268)和中国实验诊断学2012年1月第16卷第1期AmpG5(G373-->D373),并在EMBL分别注册为X82158, X82159,X82160.ampG基因的突变导致AmpG蛋白功能丧失,菌株不再具有诱导性或只表达低水平诱导.可见,AmpcB一内酰胺酶的诱导需要完整的ampG基因.但是ampG缺乏本身的启动序列,它作为操纵子的一部分,与其上游一个未知功能的ORF一起被转录.2005年Chah—bouneE蚓等人在对E.coli细胞壁肽聚糖循环的研究中发现, E.coli等一些革兰阴性杆菌具有一种高效的蛋白机制AmpG.AmpG作为一种信号传感器,参与Ampc口一内酰胺酶的诱导.此后他们采用疏水时刻曲线分析法和B一内酰胺酶融合试验构建了AmpG的拓扑学结构(见图2).E.coli AmpG蛋白由491个氨基酸组成,分子量53KDa,带有lO个跨膜片段(1,2,3,4,7,8,9,10,13,14),另外还有4个疏水片段保留在胞质内,其中两个片段(5,11)因为较短不能伸展到细胞膜上,另外两个片段(6,12)含有脯氨酸.氨基(N)和羧基(C)末端存在于细胞质内.周矮细胞膜臆质图2E.coliAmpG的拓扑结构(Fx为基因融合点)2.2铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)中的AmpG蛋白2010年Kongl1"等人在对P.aeruginosa8一内酰胺酶诱导所需透酶进行研究时提出P.aeruginosaPA01含有两个ampG同系物,PA4218和PA4393,命名为ampG和ampP.采用PCR技术扩增基因片段,发现ampG和ampP与其各自上游的ORF构成两个基因操纵子ampF-ampG和ampO ampP.ampP与ampC相似,其表达依赖于AmpR的激活(见图3).AmpCB一内酰胺酶的表达需要ampG和ampP的参与,但是作用却不相同,ampG在高浓度诱导时起关键作用,而ampP主要在低浓度诱导时起作用.采用碱性磷酸酶和p一半乳糖苷酶融合法进行拓扑学分析,AmpG和AmpP 分别含有594和414个氨基酸,等电点为9.3和9.4,分子量为64.6和43.2KDa.AmpG带有14个跨膜片段,而AmpP带有10个跨膜片段.与E.coli一样,P.aeruginosaAmpG的N,C末端也存在于细胞质内.同年,Zhang["等人将PA4218和PA4393命名为AmpG和AmpGhl,采用基因重组的方法将P.aeruginosaPAO1和PA01ADDh2Dh3(ampD一)的ampG和ampGhl基因分别或同时敲除,ampG的失活抑制了天然p一内酰胺酶的耐药性,也使由于AmpD蛋白缺失所引起的去阻遏表达丧失,而ampGhl却几乎无此作用. 2.3嗜麦芽窄食单胞菌(S.maltophilia)中的AmpG蛋白2010年Huang_l等人采用PCR技术扩增基因片段,发现S.maltophiliaKJ的ampG上游存在着ampN基因,ampG与ampN形成一个操纵子,在启动序列PampN的调控下共同上图3P.aenlgm~AIIlpR.AIIIpP和AI呷lG的调控机制转录.通过插入xylE—Gmn盒,使S.maltophiliaKJ的ampG 和ampN基因失活,E.coli的AmpG透酶能够补偿S.malto—philiaampG或ampN突变体B一内酰胺酶的诱导性.S.real—tophilia的AmpG蛋白与E.coliAmpG相比具有33的同源性,带有12个跨膜片段,N,C末端都在胞质内.AmpN蛋白含有220个氨基酸的,其可能为一种胞内蛋白,参与AmpG对诱导物配基的转运,或者与AmpG一起形成功能性透酶.一个完整的ampN—ampG操纵子对于S.maltophiliaB 一内酰胺酶的表达的必不可少的.2.4其他菌种中的AmpG蛋白2008年Daniel_2等人研究发现淋病奈瑟氏菌(N.gon—orrhoeae)ampG或ampD的突变影响肽聚糖片段的释放, ampG的缺失引起肽聚糖片段释放的大量增加.2009年Dawnl_2等人报道了费希尔弧菌(V.fischeri)ampG突变体菌株肽聚糖片段的释放量增加了100倍.可见,肽聚糖片段依靠透酶AmpG的作用被转运至细胞内.V.fischeriAmpG与E.coliAmpG相比,具有26的同源性,其编码序列比E. coilAmpG更短,在C末端少了73个氨基酸.而N.gonor—rhoeaeAmpG也更短,C末端少了77个氨基酸.3AmpG跨膜蛋白及其拓扑学3.1跨膜蛋白的一般特性跨膜蛋白,又称整合蛋白或内在蛋白,部分或全部镶嵌在细胞膜中或内外两侧.露在膜外的部分含较多的极性氨基酸,属亲水性,与磷脂分子的亲水极邻近,嵌入脂双层内部的膜蛋白是由一些非极性的氨基酸组成,与脂质分子的疏水尾部相互结合_2.跨膜蛋白的跨膜结构域可以是1个或多个疏水的0t螺旋.形成亲水通道的跨膜蛋白跨膜区域有两种组成形式,一是由多个两性a螺旋组成亲水通道;二是由两性p折叠组成亲水通道.大部分跨膜蛋白为a螺旋组成, 也有少部分为p折叠组成.跨膜蛋白所含疏水氨基酸的成分较高,分为单次跨膜,多次跨膜等.3.2AmpG跨膜蛋白的拓扑学我国王庆达等人提出,膜蛋白的拓扑可被定义为它来回穿膜的方式,即跨膜片段在氨基酸序列中的定位和分子在膜上的总的定向.拓扑代表的是膜蛋白的二级结构,是预测膜蛋白三维结构的出发点.融合蛋白法是目前应用于原核膜蛋白拓扑分析最广泛的方法.常用的有碱性磷酸酶(PhoA),p一内酰胺酶(Bla)和口一半乳糖苷酶(LacZ).PhoA 和Bla只在被转运到胞质外周时具有活性而在位于胞内时一178不表现活性.LacZ则正好相反,通过观察膜蛋白的一系列融合方式l的活力模式即可推测膜蛋白的拓扑学.已有部分学者采用上述融合方法推测了AmpG蛋白的拓扑学.Chahboune[16等人采用B一内酰胺酶融合试验构建的E.coliAmpG的拓扑结构,将.3'末端截短的ampG基因与blaM基因融合表达,融合点位于睐水片段的中间位置.如果融合点在胞外,B一内酰胺酶具有活性,如果融合点在胞内,8一内酰胺酶不具有活性(见图4).Kong["等人采用PhoA/LacZ双融合的方法构建了P.aeruginosaAmpG和AmpP的拓扑结构.-,1J/"1I1/-13-内酰胺酶图4利用时酰胺酶的融合确定膜蛋白拓扑学1t融点在胞外.融合点在胞内4AmpG的底物特异性及其抑制剂AmpG是转运大分子的透酶,冻融的E.coli细胞允许大分子量胞壁肽穿过.2002年,Cheng_2]等人制备了E.coli冻融细胞并用放射性物质加以标记,采用高效液相色谱法分别测定了ampG+,ampG一菌株中各种胞壁肽的吸收峰.经研究发现,AmpG转运的主要物质是GlcNAc—anhMurNAc,缺乏GlcNAc或anhMurNAc的胞壁肽不会被转运.20l氰氯苯腙(CCCP)的加入可以阻止AmpG对G1cNAc—anhMurNAc的转运.CCCP是典型的质子泵抑制剂,通过抑制主动外排泵的能量来源来破坏主动外排系统的作用,表现为药物在菌体内的蓄积显着增加].CCCP对于AmpG的抑制作用说明AmpG是一种依赖质子动力势的单要素透酶[2.应用CCCP对AmpG的抑制作用,也许可以阻断AmpC酶诱导性的产生.?5结束语,耐药菌株的迅速增长,使传统的抗生素已不再能够治疗常见的感染性疾病.对.AmpC一内酰胺酶分子结构及调控机制的研究为临床抗感染性治疗提供了新的方向.ampG基因是AmpC酶的调控基因之一,它编码的Ami~G蛋白作为一种透酶,在ChinJLabDiagn,Janqary,2012,V ol16,No.1AmpCJ3一内酰胺酶表达调控中起着向胞浆传递信号的重要作用.在AmpC酶的表.达中,若能将AmpG蛋白的传导作用有效的抑制即可阻止AmpC酶的产生,其有望成为解决细菌对8一内酰胺酶类抗生素产生诱导性耐药现象的一个重要手段.因此,对于ampG基因和AmpG蛋白的研究,有利于更好的分析AmpC酶的调控机制,为临床耐药性的研究提供更好的理论基础.但是,AmpG作为细菌的一种跨膜蛋白,在传递诱导信号的同时是否还存.在其他作用以及作用之间具有何种联系,仍有待于进一步的研究和探讨.作者简介:洛丹婷(1983一),女(蒙古族),辽宁阜新,检验技师,哈尔滨医科大学硕士研究生在读.参考文献:[1]马艳红,孙慧芳.AmpC酶分类及检测的研究进展[J].黑龙江医学,2009,33(§):184.[2]侯伟伟,蒋燕群.三种AmpC酶表型检测方法比较[J].检验医学, 2O10,25(2):122.[3]郑卫.口一内酰胺酶及其抑制剂研究进展[J].国外医学?抗生素分册,2001,22(2):49.[4]KanekoK,Okam~R,NakanoR,eta1.Genemutationsresponsiblefor0verexpressionofAmpCbeta—lactamaseinsomeclinicali—solatesofEnterobactercloacae[J].JClinMicrobiol,2005,43(6):2955.[5]涂婉,赵虎.Ampc0一内酰胺酶的分子生物学研究进展[J].检验医学,g009,24(11):845.[6]夏丽萍,康健,于润江.AmpC酶诱导调节机制及治疗对策的研究进展[J].国外医学?呼吸系统分册,2002,22(4):203.[7]JacobyGA.AmpCbate—lactamase[J].CliMicrobiolRev,2009,22 (1):161.E8]李桂玲,多丽波.革兰阴性杆菌AmpC酶表达调控中AmpD蛋白作用研究进展[J].中华医院感染学杂志,2009,19('24):3448.[9]NiM,ZhangD,QiJ.AnalysisofAmpCbeta—lactamasegenein Pseudomonasaeruginosa[J].JHuazhongUnivSciTechnolog 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