当前位置：文档之家 › 荧光淬灭PPT课件

荧光淬灭PPT课件

  • 格式：ppt
  • 大小：46.44 KB
  • 文档页数：9

下载文档原格式

  / 9

合集下载

报告基因和荧光淬灭 ppt课件

报告基因和荧光淬灭 ppt课件

范围内，则供体CFP发出的荧光可被YFP吸收，并激发YFP发出黄色荧光，此时
通过测量CFP荧光强度的损失量来确定这两个蛋白是否相互作用。两个蛋白距离
越近，CFP所发出的荧光被YFP接收的量就越多，检测器所接收到的荧光就越少。
如Tsien & Miyawaki采用FRET技术检测细胞内Ca2+的浓度变化。他们将CFP
3
直到1992年，道格拉斯•普瑞舍克隆并测序了野生型的GFP，文章发表在《Gene》 杂志上。但具有讽刺意味的是，基金评审委员会认为普瑞舍的工作没有意义，不 愿提供经费。普瑞舍一气之下，离开了科学界，将GFP的cDNA送给了几个实验室。
ppt课件
4
GFP的结构以及发光原理，要到1990年代通过X光衍射才得到证实：GFP的肽链 构成一个桶状结构，在其中心由3个氨基酸携带的芳香集团构成了发光核心结 构。 但克隆并在真核细胞表达很长时间没成功
ppt课件
6
ppt课件
7
钱永健的贡献，是利用他在活体荧光研究方面的丰富经验，对GFP进行改造，他
的实验室利用定点突变改造出来 EGFP，不仅提高了荧光强度，更重要的可以在 普通的荧光显微镜下用现有的荧光滤镜观察到，而且光谱单一，不会和其它荧光 染料的光谱发生干扰。接着他的实验室又陆续推出了不同颜色的 GFP，如蓝色 (BFP)和黃色(YFP)的荧光蛋白。这为同时在同一个细胞或组织内标记多种蛋白或 结构打下了基础
利用某种物质对某一种荧光物质的荧光猝灭作用而建立的对该猝灭剂 的荧光测定方法，即为荧光猝灭法
荧光猝灭法比直接荧光测定法更为灵敏，具有更高的选择性
ppt课件
33
肿瘤转移过程
ppt课件
34
应用举例：

知识点11-荧光猝灭 [兼容模式]

知识点11-荧光猝灭 [兼容模式]

5．荧光熄灭（猝灭）Fluorescence spectra ( -) of TPP and absorption spectra (---) of ETH5294 in plasticized PVC membrane: a. Excitation spectrum of TPP; b. Emission spectrum of TPP; c. Unprotonated ETH5294; d. Protonated ETH5294.荧光物质分子与溶剂或其它溶质分子相互作用，引起荧光强度降低甚至消失的现象。

1)动态猝灭2)静态猝灭3)荧光能量转移4)内滤效应1)动态猝灭动态猝灭（或碰撞猝灭）指激发态荧光分子与环境分子动态接触而使荧光分子由激发态通过非辐射跃迁回到基态的现象。

常见猝灭剂包括O2、I-、Cs+、丙烯酰胺。

Sterm-Volmer方程：F0初始荧光；F猝灭后荧光；Q猝灭剂；Ksv猝灭常数动态猝灭使荧光寿命降低Kq为双分子猝灭速率常数，正比于两分子扩散系数和；t为无猝灭时荧光寿命。

一般而言：2)静态猝灭静态猝灭（或基态复合物猝灭）指基态态荧光分子与环境分子结合形成稳定的、无荧光的复合物的现象。

Ka为复合物的结合常数静态猝灭只是改变荧光分子数目，而不改变荧光分子寿命所谓荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer ，FRET)是指当一个荧光分子(又称为供体分子)的荧光光谱与另一个荧光分子(又称为受体分子) 的激发光谱相重叠时, 供体荧光分子的激发能诱发受体分子发出荧光,同时供体荧光分子自身的荧光强度衰减的现象。

3) 荧光共振能量转移能量传递的效率：R0 ：Foster临界距离，为能量传递达到50% 的距离用途：应用能量转移测量分子内和分子间的距离（一般测量距离为0.5~1.5R0)5）自熄灭与自吸收**hv hv DD D D −→←++−→←当荧光物质的浓度大于1g/L 时，常发生荧光的自熄灭(浓度熄灭)自吸收：由于φF < 1，使荧光强度减弱或消失.D)(D D D 11**−→←+形成二聚体：由于二聚体不发荧光，或发射荧光的能量有改变，造成自熄灭现象。

荧光的猝灭解析

荧光的猝灭解析
1 * 0
5
在猝灭剂存在的情况下： 1M*表示为：[1M*]，同理可得：
I a (k f ki )[ M ] k q [Q ][ M *] 0
1 * 1
Ia [ M ] k f ki k q [Q ]
1 *
式中kq为双分子猝灭过程的速率常数。
6
在猝灭剂不存在和存在的情况下，荧光量子产率 分别为：
15
在电荷转移猝灭中，荧光物质的激发态分子与猝灭剂 分子相互碰撞时，最初形成了“遭遇配合物”，而后成为 实际的激态电荷转移配合物：
1
M Q M ...Q (M Q ) M Q hv
* 1 *

*
M ＋ Q ＋ KT
在介电常数小于10的非极性溶剂中，可观察到有激发态 转移配合物所产生的荧光。但其荧光与1M*的相比，光谱处
0 1 K SV [Q ]
式中：t为猝灭剂存在时测得的荧光寿命。 由上所述，若以F0/F对[Q]作图得一直线，斜率为Ksv。
直观的看，1/ Ksv的数值等于50％的荧光强度被猝灭时猝灭 剂的浓度。假如测定了猝灭剂不存在时的荧光寿命t0，便可 根据kq t0=Ksv的关系求得双分子猝灭过程的速率常数kq。
（3）此外，由于碰撞猝灭只影响到荧光分子的激发态，因 而并不改变荧光分子的吸收光谱。相反，基态配合物的生成 往往引起荧光分子吸收光谱的改变。
Cu2+
结合常数: 7.9×106
Chem. Commun., 2005, 3189–3191.
14
4。 § 4.3 电荷转移猝灭
某些猝灭剂与荧光物质分子相互作用时，发生了电荷转 移反应，即氧化还原反应，即引起荧光的熄灭。由于激发态 分子往往比基态分子具有更强的氧化还原能力，也就是说， 激发态分子是比基态分子更强的电子给体和电子受体，因此 激发态分子更容易发生与其他物质的分子发生电荷转移作用 。 某些强的电子受体的物质，往往是有效的荧光猝灭剂。

免疫荧光技术PPT课件

免疫荧光技术PPT课件
可采用涂片、印片或切片方式制备抗原片。
细胞采用涂片、印片或切片的方式制备抗 原片。
2 标本的固定： ⑴ 固定目的
防止细胞、细菌或切片从玻片上脱落。
去除组织中妨碍抗原抗体结合的类脂质。
易于保存。
（但CD、SIg的检测不进行固定，而采用 活细胞染色）。
⑵ 常用的固定方法：
抗原 固定方法
直接法原理示意图
抗原 抗体
标记 抗体
荧光 光原
间接法原理示意图
抗体
补体
标记 抗补 体抗 体
荧光
光 源
补体结合法原理示意图
㈢荧光显微镜检查： （由实验课介绍）
三、其它免疫荧光技术 1 流式细胞仪 2 时间分辨免疫荧光技术 3 荧光偏振免疫分析技术
时间分辨荧光免疫测定
(time-resolved fluoresence immunoassay,TR-FIA)
第四步： 取出透析袋，进行纯化、鉴 定。
搅拌法
第一步：
第二步：
第三步：
液 第四步：
拌
将含40mg/ml BP 溶液5ml 装入反应瓶中。
加入pH=9.0、0.5mol/L碳酸盐 缓冲液4ml
25℃磁力搅拌下，逐滴加入 1ml含2mg的FITC溶
25℃下搅拌1h，4℃下继续搅
2 荧光抗体的纯化： ⑴ 除去未结合荧光素 ⑵ 除去标记不适当的抗体 ⑶ 除去非特异反应物质
按100mg组织粉/ml标记抗体比例混合， 4℃磁力搅拌1h，静置1h，离心取上清液，在 用50mg/ml比例重复一次。
SUCCESS
THANK YOU
2019/7/31
3 荧光抗体的鉴定： ⑴ 抗体含量测定：双扩法
⑵ 结合比率(F/P)测定：

荧光淬灭定义课件

荧光淬灭定义课件
荧光淬灭还可以用于大气污染物的监测，如二氧化氮、二氧化硫等。通过荧光标记技术，可以 实时监测大气污染物的浓度和分布情况，从而为环境保护和治理提供科学依据。
03
荧光淬灭的实验方法
荧光光谱法
总结词
荧光光谱法是一种通过测量荧光物质发射的荧光光谱来 研究荧光物质性质的方法。
详细描述
荧光光谱法利用不同荧光物质发射的荧光具有不同波长 和强度这一特性，通过测量荧光光谱的波长和强度，可 以了解荧光物质的分子结构和分子间的相互作用。
高选择性
荧光淬灭技术可以通 过选择适当的淬灭剂 ，实现对特定荧光物 质的淬灭，从而实现 高选择性检测。
应用广泛
荧光淬灭技术可以应 用于多种类型的荧光 物质，包括有机荧光 物质和无机荧光物质 。
缺点
需要选择合适的淬灭剂
不同的荧光物质可能需要不同的淬灭 剂，因此需要选择合适的淬灭剂才能 获得最佳的检测效果。
用。
荧光淬灭的程度取决于多种因素，如荧光物质的 03 性质、溶剂的性质、温度、压力等。
荧光淬灭的原理
荧光淬灭的原理主要包括能量转移淬 灭、动态碰撞淬灭和静态碰撞淬灭等
。
动态碰撞淬灭是指荧光物质分子与另 一种分子发生碰撞，导致荧光物质分 子振动能级升高，从而降低荧光强度
。
能量转移淬灭是指荧光物质分子与另 一种分子之间发生能量转移，导致荧 光强度降低。
医学研究中的应用
荧光淬灭在医学研究中主要用于药物筛选和疾病 诊断。通过荧光标记技术，可以对药物与靶点的 结合进行实时监测，从而筛选出具有潜在疗效的 药物。
荧光淬灭还可以用于肿瘤诊断和治疗。通过荧光 标记技术，可以对肿瘤细胞进行标记和追踪，从 而实现对肿瘤的精准诊断和治疗。
环境监测中的应用

《原子荧光原理》PPT课件

《原子荧光原理》PPT课件

立。当浓度增加时，(4)式带二次项、三次
项… ，If与C的关系为曲线关系。
h
6
4、原子荧光仪器
• 1）、仪器的构成： • 原子荧光仪器由三部分组成：激发光源、
原子化器、检测电路。
• • 激发光源
• 原子化器
检测电路
h
7
• 2）、激发光源：HCL EDL
•
对光源的要求：高强度、高稳定性
• 3）、原子化器：
成氢化物： BH4+3H2O+H+=H3BO3+Na++8H*+Em+
• =EHn+H2(气体）
• 式中Em+代表待测元素，EHn为气态氢化物（m可
以等于或不等于n）。
• 使用适当催化剂，在上述反应中还可以得到了镉和 锌的气态组分。
h
10
3、氢化物元素的价态
•
元素
As
•
Sb
•
Bi
•
Se
•
Te
•
Ge
11. 打印机 A. 光学系统
h
15
AFS-820原子荧光光度计
h
16
AFS-820原子荧光光度计
氢化物反应系统连接图
h
17
AFS-830原子荧光光度计
h
18
AFS-830原子荧光光度计
氢化物反应系统连接图
h
19
蠕动泵进样氢化物反应系统原理图
h
20
AFS-930原子荧光光度计
h
21
AFS-920原子荧光光度计
h
5
• 将(3)式按泰勒级数展开，并考虑当N很小时，
忽略高次项，则原子荧光强度If表达式简化为：

荧光淬灭定义

荧光淬灭定义

5纳米磁性颗粒
• 纳米磁性颗粒( magnetic nanoparticle，MNs) 也被称为超顺磁颗粒，它结合了磁性粒子和纳米 材料的优点，具有粒径小、超顺磁性和比表面积 大等特性。
• 典型的是以磁性材料四氧 化三铁. • 表面引入活性基团，通过 耦联反应与酶、抗体等生 物分子结合形成生物标志 物. • 超顺磁性.
• 胶体金标记蛋白质的过程是蛋白被动吸附到金颗 粒表面的过程。 • 由于蛋白分子牢固地结合在金颗粒表面，形成一 个蛋白层，阻止了胶体金颗粒的相互接触，而使 胶体金处于稳定状态。
• 胶体金作为标志物有以下优势: • ①几乎可标记所有的蛋白分子，过程简单， 效率高，用量少，便宜，基本不改变被标 记蛋白的活性。且稳定，无毒，使用方便， 保质期长。 • ②不同直径的纳米金可以用于多重标记。 • ③结果判断只需普通光学仪器或直接肉眼 观察。
荧光寿命
定义:荧光物质被激发后所产生的荧光衰减到一定程
度时所用的时间。
各种荧光物质的荧光寿命不同。
荧光淬灭
• 定义:荧光物质在某些理化因素作用下，发 射荧光减弱甚至消退称为荧光淬灭。 • 引起荧光淬灭的因素：有如紫外线照射、 高温、某些硝基化合物、重氮化合物等。
• 免疫层析技术以固定有检测线和控制线的条状纤 维层析材料为固定相，测试液为流动相，通过毛 细作用使待测物在层析条上移动。 • 待测物在T线处发生特异性免疫反应。 • 游离物在C线处发生免疫反应。
待 测 物 层析方向
T C
免疫反应
免疫层析技术基本原理示意图
常用荧光免疫层析法
夹心法
竞争法
•双抗原夹心法
双抗体夹心法
竞争法
待测物中的某种抗原与T（检测线）线处同 种抗原竞争性地与标记抗体相结合的过程。

第四章荧光的猝灭

第四章荧光的猝灭
16
在极性溶剂中，1M*的荧光被猝灭剂猝灭时，通常并 不伴随由基态电荷转移配合物所产生的荧光，代之而发生 的是遭遇配合物形成离子对，再经溶剂化作用转变为游离 的溶剂化离子。
1M
*
Q1M
*
••Q
M
S
QS
17
具有重原子的猝灭剂分子，它们与荧光物质的激发态 分子所形成的电荷转移配合物，有利于电子自旋的改变， 以致发生电荷转移配合物的离解并伴随着经由三重态的能 量降低：
*对有效的猝灭剂，KSV≈102 － 103 L/mol.
9
§4.2 静态猝灭
某些荧光物质溶液在加入一些猝灭剂之后，溶液的 荧光强度显著降低，溶液的吸收光谱有了明显的变化; 其 荧光强度随着温度的升高而增强。 这种现象可能是由于 荧光分子和猝灭剂之间形成不发光的基态配合物的结果。 这种现象称为静态猝灭。
某些强的电子受体的物质，往往是有效的荧光猝灭剂。
15
在电荷转移猝灭中，荧光物质的激发态分子与猝灭剂 分子相互碰撞时，最初形成了“遭遇配合物”，而后成为 实际的激态电荷转移配合物：
1M * Q1M *...Q (M Q )* M Q hv
M ＋ Q ＋ KT 在介电常数小于10的非极性溶剂中，可观察到有激发态 转移配合物所产生的荧光。但其荧光与1M*的相比，光谱处 于更长的波长范围，且无精细结构。
2
§4.1 动态猝灭
在动态猝灭过程中，荧光物质的激发态分子通过与 猝灭剂分子的碰撞作用，以能量转移的机制或电荷转移 的机制丧失其激发能而返回基态。
3
溶液中荧光物质分子M和猝灭剂Q相碰撞 而引起荧光熄灭。
比较速率
(1)M＋hυ→M* (吸光)
1
(2)M* k1 M＋hυ (发生荧光)

荧光淬灭

荧光淬灭

如果这种能量传递不有效的话，可能荧光就强。

另外金的plasmon也会增强荧光材料的光吸收，可能会增强荧光总强度。

这两个竞争过程除了与波长有关外，朱要与距离有关，一般5纳米是界限，距离短被淬灭荧光淬灭有以下几种说法:1. 动态淬灭(碰撞淬灭,淬灭剂与发光物质的激发态分子之间的相互作用)2. 静态淬灭(发光分子基态和淬灭剂形成不发光的基态络合物)3. 转入三重态淬灭4. 自吸淬灭(浓度高时，自淬灭)首先确定荧光物质是否有电性，就是说荧光物质是否带有电荷，而且贵金属，例如纳米金，在制作过程中，表面由于有柠檬酸根而带有负电荷，可以和带正电荷的荧光物质，如带正电荷水溶性荧光共轭聚合物，通过静电作用，而使荧光猝灭；如果带相同电荷或者一方不带电荷，猝灭是不怎么明显的。

可以这样说，这种猝灭，是通过电荷作用相互吸附在一起，你可以让两者相互作用后，做一个TEM，就可以判断了。

荧光淬灭有动态淬灭和静态淬灭两种，稳态的荧光强度都显示出荧光强度的衰减，无法分辨，而动态淬灭至少分裂为2个荧光寿命，意味着能量转移的发生，而静态淬灭只是淬灭剂与荧光物结合生成非荧光物质，荧光寿命并不发生变化。

Acrylamide和碘离子分别用于疏水淬灭或亲水淬灭，测量蛋白质中Trp残基荧光淬灭的寿命，能够轻易的得知Trp残基是位于蛋白质表面还是内部。

荧光淬灭多用于分析大分子或胶体的结构或构象，用淬灭的方法研究荧光基团在分子内还是分子表面，有个淬灭的方程，一时写不出来，大概是淬灭剂浓度和荧光变化的关系，有个K常数，和淬灭效率和荧光寿命有关，如果分子构型改变，K会变化，这样就可以用来研究某些化合物对大分子构型或构象的影响。

荧光漂白，就是用强光把荧光素的激发态全部给消除了，有可逆和不可逆两种，可逆的漂白相当于清理出一个没有荧光的区域，相当于荧光清零，然后再观察测量某种特定的荧光的扩散、产生或恢复。

漂白是否可以恢复依赖于荧光素的种类和漂白光强，作为副作用，荧光素的漂白常会发生。

荧光的猝灭ppt课件

荧光的猝灭ppt课件
13
§4。4.3 电荷转移猝灭
某些猝灭剂与荧光物质分子相互作用时，发生了电荷转 移反应，即氧化还原反应，即引起荧光的熄灭。由于激发态 分子往往比基态分子具有更强的氧化还原能力，也就是说， 激发态分子是比基态分子更强的电子给体和电子受体，因此 激发态分子更容易发生与其他物质的分子发生电荷转移作用 。
Org. Lett.，2008， 10， 5577-5580.
Fig.1. Absorption and fluorescence spectral changes of probe 1 upon addition of increasing concentration Cys.
31
例 6：
ICT On
某些强的电子受体的物质，往往是有效的荧光猝灭剂。
14
在电荷转移猝灭中，荧光物质的激发态分子与猝灭剂 分子相互碰撞时，最初形成了“遭遇配合物”，而后成为 实际的激态电荷转移配合物：
1M * Q1M *...Q (M Q )* M Q hv
M ＋ Q ＋ KT 在介电常数小于10的非极性溶剂中，可观察到有激发态 转移配合物所产生的荧光。但其荧光与1M*的相比，光谱处 于更长的波长范围，且无精细结构。
9
荧光分子和猝灭剂之间形成的不发光的基态配合物 ，可表示为：
M Q MQ
配合物的形成常数为：
K [MQ] [M ][Q]
10
荧光强度和猝灭剂浓度之间的关系，可推倒如下：
[M ]0 [M ] [MQ]
F0 F [M ]0 [M ] [MQ] K[Q]
F
[M ]
[M ]
即：
F0 1 K[Q] F
A selective colorimetric chemosensor for thiols based on intramolecular charge transfer mechanism

荧光淬灭定义

荧光淬灭定义
• [1]王倩倩，颜红侠，李朋博，等． 碳纳米管的纯化、性 能及应用［J］． 化学工业与工程，2010，27( 析法检测的实物 图
双抗体夹心法
待测液含抗原Ag (k)Ab1-Ag (k)Ab1-Ag-Ab2 Ab3-(k)Ab1 阳性结果T,C均有颜 色
(k)Ab1
Ab2
T
待测液，不含抗原Ag (k)Ab1 (k)Ab1
C
Ab3-(k)Ab1 阴性结果T无颜色，C 有颜色
(k)Ab1
Ab2
T
双抗体加心法检测原理图
双抗体夹心法
竞争法
待测物中的某种抗原与T（检测线）线处同 种抗原竞争性地与标记抗体相结合的过程。
竞争法
结合垫
免疫层析法检测的实物 图
Y1:A的单抗与标记物的偶联体 Y2：抗原A Y3:羊抗鼠二抗 含抗原 A
夹心法
• 待测物中某种抗体（抗原）与T线处抗原A （抗原A）以及荧光标记的抗原（抗体）特 异性相结合的过程，在T线处形成抗体A+抗 原+抗体B形式的夹心结构。
6碳纳米管
• 碳纳米管( carbon nanotubes，CNTs) 的结构可看成 是石墨的六角形网格结构发生一定弯曲而形成的空间 拓扑结构。
• CNTs 作为生物 分子标志物的 原理与胶体金 类似，其明显 的黑色在定性 或半定量检测 中肉眼即可见。
• 目前无论用何种方法制备 CNTs，均难以去 除其中混杂的无定形碳、石墨碳碎片等杂 质，这些杂质与 CNTs 混杂在一起，严重 [1] 限制了 CNTs的研究与应用 .
• 固定相是固体物质或固定于固体物质上的 成分。 • 流动相是可以流动的物质，如水或各种溶 剂。
• 层析过程：当待分离混合物随流动相通过 固定相时，由于混合物各组分的理化性质 的差异，与固定相相互作用弱的组分随流 动相移动时受到的阻滞作用小，向前移的 速度快；与固定相相互作用强的组分向前 移动的速度慢。从而实现混合物中各组分 的分离。

荧光淬灭专题教育课件

荧光淬灭专题教育课件

PET光致电子转移
• 经典旳光诱导电子(photo induced electron transfer，PET)转移体系 是由包括电子给体旳受体部分R(receptor)，经过间隔基S(spacer,如 一CH2一)和荧光团F(fluorophore)相连而构成旳。其中荧光团部分 是能吸收光和发射荧光旳场合，受体部分则用来结合客体，这两 部分被间隔基隔开，又靠间隔基相连而成一种分子，构成了一种 在选择性辨认客体旳同步又给出光信号变化旳超分子体系。PET 荧光分子探针中，荧光团与受体单元之间存在着光诱导电子转移， 对荧光有非常强旳淬灭作用，一般是电子从供体转移到激发态荧 光团。所以在未结合客体之前，探针分子不发射荧光，或荧光很 弱。一旦受体与客体相结合，光诱导电子转移作用受到克制，甚 至被完全阻断，荧光团就会发射荧光。
• 利用某种物质对某一种荧光物质旳荧光猝灭作用而建立旳对该猝
灭剂旳荧光测定措施，即为荧光猝灭法。一般而言，荧光猝灭法 比直接荧• 激发态荧光分子与猝灭剂碰撞使其荧光猝灭则称为动态猝灭。
静态淬灭
• 基态荧光分子与猝灭剂之间经过弱旳结合生成复合物，且该复合 物使荧光完全猝灭旳现象称为静态猝灭。
• 静态猝灭旳特征是基态荧光分子M和猝灭剂Q发生反应，生成非 荧光性物质，使M失去光谱特征。动态猝灭旳特征是激发态M*和 Q碰撞，发生能量或电子转移从而失去荧光性，或生成瞬时激发 态复合物MQ*，使荧光分子M旳荧光猝灭。动态猝灭一般并不变 化M旳吸收光谱。
PET光致电子转移
• 分子经过特定波长旳电磁波（可视光，紫外光等）照射后发生旳 分子内部电子转移现象。
荧光淬灭
荧光猝灭分为静态淬灭和动态淬灭
荧光猝灭
• 荧光猝灭（fluorescence quenching）是指荧光物质分子与溶剂分 子之间所发生旳造成：荧光强度变化或有关旳激发峰位变化或荧 光峰位变化物理或化学作用过程。

报告基因和荧光淬灭

报告基因和荧光淬灭

荧光淬灭对报告基因的影响
荧光淬灭对报告基因表达 的影响
荧光淬灭可以影响报告基因的表达水平。在 某些情况下，荧光淬灭可能增强报告基因的 表达，而在其他情况下，它可能抑制表达。
荧光淬灭对报告基因稳定 性的影响
荧光淬灭可以影响报告基因的稳定性。在某 些情况下，荧光淬灭可能增加报告基因的稳 定性，而在其他情况下，它可能降低稳定性
报告基因和荧光淬灭
04
在生物医学研究中的
应用
在疾病诊断中的应用
荧光淬灭技术可用于检测生物体内的特定分子或细胞，如蛋白质、核酸和细胞器 等，从而为疾病诊断提供依据。
报告基因如绿色荧光蛋白（GFP）等，可用于标记和追踪细胞或组织，观察其在疾 病发生和发展过程中的变化，有助于疾病的早期诊断和预后评估。
。
报告基因与荧光淬灭的相互作用
报告基因与荧光淬灭的相互影响
报告基因和荧光淬灭之间存在复杂的相互作用关系。一方面，报告基因的表达水平和稳 定性可以影响荧光淬灭；另一方面，荧光淬灭也可以影响报告基因的表达水平和稳定性。
报告基因与荧光淬灭在生物体内的应用
了解报告基因与荧光淬灭的相互作用关系对于在生物体内应用这些技术至关重要。例如， 在生物成像和生物传感器中，利用这些相互作用关系可以提高检测的灵敏度和特异性。
报告基因和荧光淬灭Байду номын сангаас
目 录
• 报告基因 • 荧光淬灭 • 报告基因与荧光淬灭的关系 • 报告基因和荧光淬灭在生物医学研究中的应用 • 未来展望与研究方向
报告基因
01
定义与特性
定义
报告基因是一类编码可被检测的蛋白 质或酶的基因，通常用于指示细胞或 生物体的特定生理状态或表型。
特性
报告基因具有可检测性、特异性、可 遗传性和可传递性等特性，能够为研 究者提供直观、可靠的实验数据。

【精品】第五章-荧光分析法.PPT课件

【精品】第五章-荧光分析法.PPT课件
光的量子数之比，常用 Φ表示。
23
24
（重点） 252627 Nhomakorabea28
29
30
三、影响荧光强度的外部因素 1、温度 2、溶剂：极性、粘度 3、酸度：荧光物质自身最适宜的pH范围 4、荧光熄灭剂：主要四种类型 5、散射光：瑞利光、拉曼光
31
五、影响荧光强度的外部因素
1）温度 温度降低，荧光效率和荧光强度升高。
39
1、定量依据
荧光强度 If 正比于吸收的光强度 Ia 和荧光
量子产率Φ ：
I f Ia
由朗伯-比耳定律得：
Ia I0 It I0 110bC
荧光强度 If ：
I f I0 110bC I0 1 e2.303bC
40
对于稀溶液，当 2.303bC < 0.05时：
I f 2.303 f I0 bC
2）溶剂 随着溶剂的极性的增加，荧光物质的π→π* 跃迁几率增加，荧光强度将增强，荧光波长也 发生红移；溶剂粘度降低，荧光强度降低；溶 剂应达到足够的纯度。
32
3）pH值
➢具酸或碱性基团的荧光物质，在不同pH值时，其 结构可能发生变化，因而荧光强度将发生改变。荧 光物质都自身最适宜的pH范围。
NH3+
13
振动弛豫
内转换
内转换
S2
系间窜跃
S1
能
T1 T2
量
发
发
吸
射
外转换
射
收
荧
磷
光
光
S0
l3
l1
l2
l 2
振动弛豫
荧光和磷光产生示意图
14
二、 激发光谱与荧光光谱
激发光谱（excitation spectrum）：使不同激发波长 的入射光激发荧光体，然后让所产生的荧光通过固 定发射波长的单色器而照到检测器上，测定不同激 发波长光照射下荧光强度的变化，以激发波长为横 坐标，荧光强度为纵坐标，可得荧光物质的激发光 谱。

第四章 荧光的猝灭

第四章 荧光的猝灭

1 k q 0 [Q] 1 K SV [Q]
该式为Stern－Volmmer方程。 t0为没有猝灭剂时测得的荧光寿命； Ksv为Stern－Volmer猝灭常数，是双分子猝灭速率常数 与单分子衰变速率常数的比值。
8
根据没有猝灭剂与存在猝灭剂时荧光寿命的不同， 可得Stern－Volmer方程式的另一种表示形式：
0 1 K SV [Q ]
式中：t为猝灭剂存在时测得的荧光寿命。 由上所述，若以F0/F对[Q]作图得一直线，斜率为Ksv。
直观的看，1/ Ksv的数值等于50％的荧光强度被猝灭时猝灭 剂的浓度。假如测定了猝灭剂不存在时的荧光寿命t0，便可 根据kq t0=Ksv的关系求得双分子猝灭过程的速率常数kq。
上式中 [M]0为荧光分子的总浓度；F0与F分别为猝灭 剂加入之前和加入之后所测得的荧光强度。
12
区分动态猝灭与静态猝灭： （1）最确切的方法是测量荧光体寿命；
对静态猝灭，猝灭剂的存在并没有改变荧光分子激发态的 寿命，因此t0/t=1; 对动态猝灭，猝灭剂的使荧光分子寿命缩短， t0/t=F0/F （2）动态猝灭由于与扩散有关，而温度升高时溶液的粘度下 降，同时双分子的运动加速，其结果使扩散系数增大，从而 增大双分子猝灭常数。 反之，温度升高可能引起配合物的稳定度下降，从而减 小静态猝灭的常数。
20

光诱导电荷转移（photo-induced charge transfer)
Excitation of a fluorophore induces the motion of an electron from one orbital to another. If the initial and final orbitals are separated in space, the electronic transition is accompanied by an almost instantaneous change in the dipole moment of the fluorophore. When the latter possesses an electrondonating group (e.g. -NH2, -NMe2, -CH3O) conjugated to an electronwithdrawing group (e.g. -C=O, -CN), the increase in dipole moment can be quite large. Consequently, the excited state reached upon excitation (called the Franck–Condon state or locally excited state, LE) is not in equilibrium with the surrounding solvent molecules if the latter are polar. In a medium that is sufficiently fluid, the solvent molecules rotate during the lifetime of the excited state until the solvation shell is in thermodynamic equilibrium with the fluorophore. A relaxed intramolecular charge transfer (ICT) state is then reached.

(10检本)第七章-荧光免疫技术PPT课件

(10检本)第七章-荧光免疫技术PPT课件
• 落射光：照明光线从标本上经垂直照明器落射到标本，经 标本反射进入物镜。
透射荧光显微镜光路(a)
落射荧光显微镜光路(b)
-
31
第四节 荧光免疫分析
基本原理：将抗原抗体反应与荧光 物质发光分析相结合，用荧光检测 仪检测抗原抗体复合物中特异性荧 光强度，对液体标本中微量或超微 量物质进行定量测定。
-
• (E)
-
49
6、FITC在紫外光的激发下，所产生的荧光为 • A 灰蓝色 • B 黄绿色 • C 橙色 • D 暗红色 • E 橙红色 • （B）
-
50
7、双标记荧光抗体技术的主要用途是 • A 提高荧光强度 • B 提高荧光效率 • C 可同时检测同一标本中两种抗原 • D 使用一种标记物可检测多种抗原 • E 减少非特异性荧光 • （C）
• 涂片：各种体液、穿刺液、细菌培养物和 细胞悬液
• 培养细胞：单层培养细胞（人喉癌上皮细 胞HEP-2)
-
20
标本的固定和保存： 固定剂： 乙醇、甲醇、丙酮、甲醛等 保存：4℃、-20 ℃
-
21
二、荧光抗体染色与结果判断
于已固定的标本上滴加经适当稀释的荧光 抗体 置25-37 ℃ 30min或4 ℃过夜 用 PBS充分洗涤 镜检。
-
22
试验类型
1 直接法 2 间接法 3 双标记法 两种荧光素分别标记的两种不 同的特异性抗体，与同一标本反应，荧光显 微镜观察两种颜色。
-
23
返回
-
24
-
25
荧光抗体染色结果判断
设立实验对照:阳性对照和阴性对照 区分特异和非特异染色 阳性细胞显色分布:胞质型、胞核型和膜表 面型
抗核抗体(均质型)

荧光淬灭

荧光淬灭

如果这种能量传递不有效的话，可能荧光就强。

另外金的plasmon也会增强荧光材料的光吸收，可能会增强荧光总强度。

这两个竞争过程除了与波长有关外，朱要与距离有关，一般5纳米是界限，距离短被淬灭荧光淬灭有以下几种说法:1. 动态淬灭(碰撞淬灭,淬灭剂与发光物质的激发态分子之间的相互作用)2. 静态淬灭(发光分子基态和淬灭剂形成不发光的基态络合物)3. 转入三重态淬灭4. 自吸淬灭(浓度高时，自淬灭)首先确定荧光物质是否有电性，就是说荧光物质是否带有电荷，而且贵金属，例如纳米金，在制作过程中，表面由于有柠檬酸根而带有负电荷，可以和带正电荷的荧光物质，如带正电荷水溶性荧光共轭聚合物，通过静电作用，而使荧光猝灭；如果带相同电荷或者一方不带电荷，猝灭是不怎么明显的。

可以这样说，这种猝灭，是通过电荷作用相互吸附在一起，你可以让两者相互作用后，做一个TEM，就可以判断了。

荧光淬灭有动态淬灭和静态淬灭两种，稳态的荧光强度都显示出荧光强度的衰减，无法分辨，而动态淬灭至少分裂为2个荧光寿命，意味着能量转移的发生，而静态淬灭只是淬灭剂与荧光物结合生成非荧光物质，荧光寿命并不发生变化。

Acrylamide和碘离子分别用于疏水淬灭或亲水淬灭，测量蛋白质中Trp残基荧光淬灭的寿命，能够轻易的得知Trp残基是位于蛋白质表面还是内部。

荧光淬灭多用于分析大分子或胶体的结构或构象，用淬灭的方法研究荧光基团在分子内还是分子表面，有个淬灭的方程，一时写不出来，大概是淬灭剂浓度和荧光变化的关系，有个K常数，和淬灭效率和荧光寿命有关，如果分子构型改变，K会变化，这样就可以用来研究某些化合物对大分子构型或构象的影响。

荧光漂白，就是用强光把荧光素的激发态全部给消除了，有可逆和不可逆两种，可逆的漂白相当于清理出一个没有荧光的区域，相当于荧光清零，然后再观察测量某种特定的荧光的扩散、产生或恢复。

漂白是否可以恢复依赖于荧光素的种类和漂白光强，作为副作用，荧光素的漂白常会发生。

  1. 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
  2. 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
  3. 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
部分被间隔基隔开，又靠间隔基相连而成一个分子，构成了一个 在选择性识别客体的同时又给出光信号变化的超分子体系。PET 荧光分子探针中，荧光团与受体单元之间存在着光诱导电子转移，
对荧光有非常强的淬灭作用，通常是电子从供体转移到激发态荧
光团。因此在未结合客体之前，探针分子不发射荧光，或荧光很
弱。一旦受体与客体相结合，光诱导电子转移作用受到抑制，甚 至被完全阻断，荧光团就会发射荧光。
荧光淬灭
Hale Waihona Puke 2019/11/2荧光猝灭分为静态淬灭和动态淬灭
2019/11/3
2
荧光猝灭
• 荧光猝灭（fluorescence quenching）是指荧光物质分子与溶剂分 子之间所发生的导致：荧光强度变化或相关的激发峰位变化或荧 光峰位变化物理或化学作用过程。
• 与荧光物质分子发生相互作用而引起荧光强度变化和相关的激发 峰位和荧光峰位变化的物质被称为荧光猝灭剂
2019/11/3
7
PET光致电子转移
• 分子经过特定波长的电磁波（可视光，紫外光等）照射后发生的 分子内部电子转移现象。
2019/11/3
8
PET光致电子转移
• 典型的光诱导电子(photo induced electron transfer，PET)转移体系 是由包含电子给体的受体部分R(receptor)，通过间隔基S(spacer,如 一CH2一)和荧光团F(fluorophore)相连而构成的。其中荧光团部分 是能吸收光和发射荧光的场所，受体部分则用来结合客体，这两
• 基态荧光分子与猝灭剂之间通过弱的结合生成复合物，且该复合 物使荧光完全猝灭的现象称为静态猝灭。
2019/11/3
6
• 静态猝灭的特征是基态荧光分子M和猝灭剂Q发生反应，生成非 荧光性物质，使M失去光谱特性。动态猝灭的特征是激发态M*和 Q碰撞，发生能量或电子转移从而失去荧光性，或生成瞬时激发 态复合物MQ*，使荧光分子M的荧光猝灭。动态猝灭通常并不改 变M的吸收光谱。
2019/11/3
3
• 利用某种物质对某一种荧光物质的荧光猝灭作用而建立的对该猝
灭剂的荧光测定方法，即为荧光猝灭法。一般而言，荧光猝灭法 比直接荧光测定法更为灵敏，具有更高的选择性。
2019/11/3
4
动态猝灭
• 激发态荧光分子与猝灭剂碰撞使其荧光猝灭则称为动态猝灭。
2019/11/3
5
静态淬灭
2019/11/3
9