荧光淬灭 ppt课件

报告基因和荧光淬灭 ppt课件

范围内，则供体CFP发出的荧光可被YFP吸收，并激发YFP发出黄色荧光，此时
通过测量CFP荧光强度的损失量来确定这两个蛋白是否相互作用。两个蛋白距离
越近，CFP所发出的荧光被YFP接收的量就越多，检测器所接收到的荧光就越少。
如Tsien & Miyawaki采用FRET技术检测细胞内Ca2+的浓度变化。他们将CFP
3
直到1992年，道格拉斯•普瑞舍克隆并测序了野生型的GFP，文章发表在《Gene》杂志上。但具有讽刺意味的是，基金评审委员会认为普瑞舍的工作没有意义，不愿提供经费。普瑞舍一气之下，离开了科学界，将GFP的cDNA送给了几个实验室。
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4
GFP的结构以及发光原理，要到1990年代通过X光衍射才得到证实：GFP的肽链构成一个桶状结构，在其中心由3个氨基酸携带的芳香集团构成了发光核心结构。但克隆并在真核细胞表达很长时间没成功
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6
ppt课件
7
钱永健的贡献，是利用他在活体荧光研究方面的丰富经验，对GFP进行改造，他
的实验室利用定点突变改造出来 EGFP，不仅提高了荧光强度，更重要的可以在普通的荧光显微镜下用现有的荧光滤镜观察到，而且光谱单一，不会和其它荧光染料的光谱发生干扰。接着他的实验室又陆续推出了不同颜色的 GFP，如蓝色 (BFP)和黃色(YFP)的荧光蛋白。这为同时在同一个细胞或组织内标记多种蛋白或结构打下了基础
利用某种物质对某一种荧光物质的荧光猝灭作用而建立的对该猝灭剂的荧光测定方法，即为荧光猝灭法
荧光猝灭法比直接荧光测定法更为灵敏，具有更高的选择性
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33
肿瘤转移过程
ppt课件
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应用举例：

荧光的猝灭解析

1 * 0
5
在猝灭剂存在的情况下： 1M*表示为：[1M*]，同理可得：
I a (k f ki )[ M ] k q [Q ][ M *] 0
1 * 1
Ia [ M ] k f ki k q [Q ]
1 *
式中kq为双分子猝灭过程的速率常数。
6
在猝灭剂不存在和存在的情况下，荧光量子产率分别为：
15
在电荷转移猝灭中，荧光物质的激发态分子与猝灭剂分子相互碰撞时，最初形成了“遭遇配合物”，而后成为实际的激态电荷转移配合物：
1
M Q M ...Q (M Q ) M Q hv
* 1 *

*
M ＋ Q ＋ KT
在介电常数小于10的非极性溶剂中，可观察到有激发态转移配合物所产生的荧光。但其荧光与1M*的相比，光谱处
0 1 K SV [Q ]
式中：t为猝灭剂存在时测得的荧光寿命。由上所述，若以F0/F对[Q]作图得一直线，斜率为Ksv。
直观的看，1/ Ksv的数值等于50％的荧光强度被猝灭时猝灭剂的浓度。假如测定了猝灭剂不存在时的荧光寿命t0，便可根据kq t0=Ksv的关系求得双分子猝灭过程的速率常数kq。
（3）此外，由于碰撞猝灭只影响到荧光分子的激发态，因而并不改变荧光分子的吸收光谱。相反，基态配合物的生成往往引起荧光分子吸收光谱的改变。
Cu2+
结合常数: 7.9×106
Chem. Commun., 2005, 3189–3191.
14
4。 § 4.3 电荷转移猝灭
某些猝灭剂与荧光物质分子相互作用时，发生了电荷转移反应，即氧化还原反应，即引起荧光的熄灭。由于激发态分子往往比基态分子具有更强的氧化还原能力，也就是说，激发态分子是比基态分子更强的电子给体和电子受体，因此激发态分子更容易发生与其他物质的分子发生电荷转移作用。某些强的电子受体的物质，往往是有效的荧光猝灭剂。

荧光淬灭定义课件

荧光淬灭还可以用于大气污染物的监测，如二氧化氮、二氧化硫等。通过荧光标记技术，可以实时监测大气污染物的浓度和分布情况，从而为环境保护和治理提供科学依据。
03
荧光淬灭的实验方法
荧光光谱法
总结词
荧光光谱法是一种通过测量荧光物质发射的荧光光谱来研究荧光物质性质的方法。
详细描述
荧光光谱法利用不同荧光物质发射的荧光具有不同波长和强度这一特性，通过测量荧光光谱的波长和强度，可以了解荧光物质的分子结构和分子间的相互作用。
高选择性
荧光淬灭技术可以通过选择适当的淬灭剂，实现对特定荧光物质的淬灭，从而实现高选择性检测。
应用广泛
荧光淬灭技术可以应用于多种类型的荧光物质，包括有机荧光物质和无机荧光物质。
缺点
需要选择合适的淬灭剂
不同的荧光物质可能需要不同的淬灭剂，因此需要选择合适的淬灭剂才能获得最佳的检测效果。
用。
荧光淬灭的程度取决于多种因素，如荧光物质的 03 性质、溶剂的性质、温度、压力等。
荧光淬灭的原理
荧光淬灭的原理主要包括能量转移淬灭、动态碰撞淬灭和静态碰撞淬灭等
。
动态碰撞淬灭是指荧光物质分子与另一种分子发生碰撞，导致荧光物质分子振动能级升高，从而降低荧光强度
。
能量转移淬灭是指荧光物质分子与另一种分子之间发生能量转移，导致荧光强度降低。
医学研究中的应用
荧光淬灭在医学研究中主要用于药物筛选和疾病诊断。通过荧光标记技术，可以对药物与靶点的结合进行实时监测，从而筛选出具有潜在疗效的药物。
荧光淬灭还可以用于肿瘤诊断和治疗。通过荧光标记技术，可以对肿瘤细胞进行标记和追踪，从而实现对肿瘤的精准诊断和治疗。
环境监测中的应用

《原子荧光原理》PPT课件

立。当浓度增加时，(4)式带二次项、三次
项… ，If与C的关系为曲线关系。
h
6
4、原子荧光仪器
• 1）、仪器的构成： • 原子荧光仪器由三部分组成：激发光源、
原子化器、检测电路。
• • 激发光源
• 原子化器
检测电路
h
7
• 2）、激发光源：HCL EDL
•
对光源的要求：高强度、高稳定性
• 3）、原子化器：
成氢化物： BH4+3H2O+H+=H3BO3+Na++8H*+Em+
• =EHn+H2(气体）
• 式中Em+代表待测元素，EHn为气态氢化物（m可
以等于或不等于n）。
• 使用适当催化剂，在上述反应中还可以得到了镉和锌的气态组分。
h
10
3、氢化物元素的价态
•
元素
As
•
Sb
•
Bi
•
Se
•
Te
•
Ge
11. 打印机 A. 光学系统
h
15
AFS-820原子荧光光度计
h
16
AFS-820原子荧光光度计
氢化物反应系统连接图
h
17
AFS-830原子荧光光度计
h
18
AFS-830原子荧光光度计
氢化物反应系统连接图
h
19
蠕动泵进样氢化物反应系统原理图
h
20
AFS-930原子荧光光度计
h
21
AFS-920原子荧光光度计
h
5
• 将(3)式按泰勒级数展开，并考虑当N很小时，
忽略高次项，则原子荧光强度If表达式简化为：

第四章荧光的猝灭

16
在极性溶剂中，1M*的荧光被猝灭剂猝灭时，通常并不伴随由基态电荷转移配合物所产生的荧光，代之而发生的是遭遇配合物形成离子对，再经溶剂化作用转变为游离的溶剂化离子。
1M
*
Q1M
*
••Q
M
S
QS
17
具有重原子的猝灭剂分子，它们与荧光物质的激发态分子所形成的电荷转移配合物，有利于电子自旋的改变，以致发生电荷转移配合物的离解并伴随着经由三重态的能量降低：
*对有效的猝灭剂，KSV≈102 － 103 L/mol.
9
§4.2 静态猝灭
某些荧光物质溶液在加入一些猝灭剂之后，溶液的荧光强度显著降低，溶液的吸收光谱有了明显的变化; 其荧光强度随着温度的升高而增强。这种现象可能是由于荧光分子和猝灭剂之间形成不发光的基态配合物的结果。这种现象称为静态猝灭。
某些强的电子受体的物质，往往是有效的荧光猝灭剂。
15
在电荷转移猝灭中，荧光物质的激发态分子与猝灭剂分子相互碰撞时，最初形成了“遭遇配合物”，而后成为实际的激态电荷转移配合物：
1M * Q1M *...Q (M Q )* M Q hv
M ＋ Q ＋ KT 在介电常数小于10的非极性溶剂中，可观察到有激发态转移配合物所产生的荧光。但其荧光与1M*的相比，光谱处于更长的波长范围，且无精细结构。
2
§4.1 动态猝灭
在动态猝灭过程中，荧光物质的激发态分子通过与猝灭剂分子的碰撞作用，以能量转移的机制或电荷转移的机制丧失其激发能而返回基态。
3
溶液中荧光物质分子M和猝灭剂Q相碰撞而引起荧光熄灭。
比较速率
(1)M＋hυ→M* (吸光)
1
(2)M* k1 M＋hυ (发生荧光)

荧光淬灭

如果这种能量传递不有效的话，可能荧光就强。

另外金的plasmon也会增强荧光材料的光吸收，可能会增强荧光总强度。

这两个竞争过程除了与波长有关外，朱要与距离有关，一般5纳米是界限，距离短被淬灭荧光淬灭有以下几种说法:1. 动态淬灭(碰撞淬灭,淬灭剂与发光物质的激发态分子之间的相互作用)2. 静态淬灭(发光分子基态和淬灭剂形成不发光的基态络合物)3. 转入三重态淬灭4. 自吸淬灭(浓度高时，自淬灭)首先确定荧光物质是否有电性，就是说荧光物质是否带有电荷，而且贵金属，例如纳米金，在制作过程中，表面由于有柠檬酸根而带有负电荷，可以和带正电荷的荧光物质，如带正电荷水溶性荧光共轭聚合物，通过静电作用，而使荧光猝灭；如果带相同电荷或者一方不带电荷，猝灭是不怎么明显的。

可以这样说，这种猝灭，是通过电荷作用相互吸附在一起，你可以让两者相互作用后，做一个TEM，就可以判断了。

荧光淬灭有动态淬灭和静态淬灭两种，稳态的荧光强度都显示出荧光强度的衰减，无法分辨，而动态淬灭至少分裂为2个荧光寿命，意味着能量转移的发生，而静态淬灭只是淬灭剂与荧光物结合生成非荧光物质，荧光寿命并不发生变化。

Acrylamide和碘离子分别用于疏水淬灭或亲水淬灭，测量蛋白质中Trp残基荧光淬灭的寿命，能够轻易的得知Trp残基是位于蛋白质表面还是内部。

荧光淬灭多用于分析大分子或胶体的结构或构象，用淬灭的方法研究荧光基团在分子内还是分子表面，有个淬灭的方程，一时写不出来，大概是淬灭剂浓度和荧光变化的关系，有个K常数，和淬灭效率和荧光寿命有关，如果分子构型改变，K会变化，这样就可以用来研究某些化合物对大分子构型或构象的影响。

荧光漂白，就是用强光把荧光素的激发态全部给消除了，有可逆和不可逆两种，可逆的漂白相当于清理出一个没有荧光的区域，相当于荧光清零，然后再观察测量某种特定的荧光的扩散、产生或恢复。

漂白是否可以恢复依赖于荧光素的种类和漂白光强，作为副作用，荧光素的漂白常会发生。

荧光的猝灭ppt课件

13
§4。4.3 电荷转移猝灭
某些猝灭剂与荧光物质分子相互作用时，发生了电荷转移反应，即氧化还原反应，即引起荧光的熄灭。由于激发态分子往往比基态分子具有更强的氧化还原能力，也就是说，激发态分子是比基态分子更强的电子给体和电子受体，因此激发态分子更容易发生与其他物质的分子发生电荷转移作用。
Org. Lett.，2008， 10， 5577-5580.
Fig.1. Absorption and fluorescence spectral changes of probe 1 upon addition of increasing concentration Cys.
31
例 6：
ICT On
某些强的电子受体的物质，往往是有效的荧光猝灭剂。
14
在电荷转移猝灭中，荧光物质的激发态分子与猝灭剂分子相互碰撞时，最初形成了“遭遇配合物”，而后成为实际的激态电荷转移配合物：
1M * Q1M *...Q (M Q )* M Q hv
M ＋ Q ＋ KT 在介电常数小于10的非极性溶剂中，可观察到有激发态转移配合物所产生的荧光。但其荧光与1M*的相比，光谱处于更长的波长范围，且无精细结构。
9
荧光分子和猝灭剂之间形成的不发光的基态配合物，可表示为：
M Q MQ
配合物的形成常数为：
K [MQ] [M ][Q]
10
荧光强度和猝灭剂浓度之间的关系，可推倒如下：
[M ]0 [M ] [MQ]
F0 F [M ]0 [M ] [MQ] K[Q]
F
[M ]
[M ]
即：
F0 1 K[Q] F
A selective colorimetric chemosensor for thiols based on intramolecular charge transfer mechanism

荧光淬灭定义

• [1]王倩倩，颜红侠，李朋博，等．碳纳米管的纯化、性能及应用［J］．化学工业与工程，2010，27( 析法检测的实物图
双抗体夹心法
待测液含抗原Ag (k)Ab1-Ag (k)Ab1-Ag-Ab2 Ab3-(k)Ab1 阳性结果T,C均有颜色
(k)Ab1
Ab2
T
待测液，不含抗原Ag (k)Ab1 (k)Ab1
C
Ab3-(k)Ab1 阴性结果T无颜色，C 有颜色
(k)Ab1
Ab2
T
双抗体加心法检测原理图
双抗体夹心法
竞争法
待测物中的某种抗原与T（检测线）线处同种抗原竞争性地与标记抗体相结合的过程。
竞争法
结合垫
免疫层析法检测的实物图
Y1:A的单抗与标记物的偶联体 Y2：抗原A Y3:羊抗鼠二抗含抗原 A
夹心法
• 待测物中某种抗体（抗原）与T线处抗原A （抗原A）以及荧光标记的抗原（抗体）特异性相结合的过程，在T线处形成抗体A+抗原+抗体B形式的夹心结构。
6碳纳米管
• 碳纳米管( carbon nanotubes，CNTs) 的结构可看成是石墨的六角形网格结构发生一定弯曲而形成的空间拓扑结构。
• CNTs 作为生物分子标志物的原理与胶体金类似，其明显的黑色在定性或半定量检测中肉眼即可见。
• 目前无论用何种方法制备 CNTs，均难以去除其中混杂的无定形碳、石墨碳碎片等杂质，这些杂质与 CNTs 混杂在一起，严重 [1] 限制了 CNTs的研究与应用 .
• 固定相是固体物质或固定于固体物质上的成分。 • 流动相是可以流动的物质，如水或各种溶剂。
• 层析过程：当待分离混合物随流动相通过固定相时，由于混合物各组分的理化性质的差异，与固定相相互作用弱的组分随流动相移动时受到的阻滞作用小，向前移的速度快；与固定相相互作用强的组分向前移动的速度慢。从而实现混合物中各组分的分离。

第五章荧光光谱法 PPT课件

荧光光谱和吸收光谱的“镜象对称”关系
蒽的乙醇溶液的荧光光谱（右）和吸收光谱（左）
CH2CH CH2
100000 80000
Counts
369
431
O
C
N
3b
C
O
60000 40000 20000 0 300
OC2H5
350
400
450
500
550
600
Wavelength (nm)
从图可看出激发光谱同荧光光谱大致成
二、产生荧光的过程和条件

荧光物质产生荧光的过程可以分为这样四个步骤：
1、处于基态最低振动能级的荧光物质分子受到紫外线的照射，吸收了和它所具有的特征频率相一致的光线，跃迁到第一电子激发态的各个振动能级；

2、被激发到第一电子激发态的各个振动能级的分子，通过无辐射跃迅降落到第一电子激发态的最低振动能级；

吸收光谱和荧光光谱能级跃迁示意图
3 2 1 V=0 吸光无辐射 3 2 1 V=0 系间窜跃吸光荧光磷光热激活 T1 迟滞荧光 3 2 1 V=0 S0 S1 S2

大多数的分子在吸收了光而被激发至第一或以上的电子激发态的各个振动能级之后，通常急剧降落至第一电子激发态的最低振动能级，在达一过程中它们和同类分子或其它分子碰撞而消耗了相当于这些能级之间的能量，因而不发出光，即无辐射跃迁。由第一电子激发态的最低振动能级继续往下降落至基态的各个不同振动能级时，则以光的形式发出，所产生的光即是荧光．

一、荧光的产生

如果使激发光的波长和强度保持不变，而让荧光物质所产生的的荧光通过单色器而照射于探测器上，移动单色器至各种不同波长并由探测器测得荧光强度，然后以荧光强度对照着荧光波长所绘成的曲线称为该荧光物质的荧光发射光谱，简称荧光光谱。荧光光谱表示在该物质所产生的荧光中各种不同波长组分的比较强度。

荧光淬灭专题教育课件

PET光致电子转移
• 经典旳光诱导电子(photo induced electron transfer，PET)转移体系是由包括电子给体旳受体部分R(receptor)，经过间隔基S(spacer,如一CH2一)和荧光团F(fluorophore)相连而构成旳。其中荧光团部分是能吸收光和发射荧光旳场合，受体部分则用来结合客体，这两部分被间隔基隔开，又靠间隔基相连而成一种分子，构成了一种在选择性辨认客体旳同步又给出光信号变化旳超分子体系。PET 荧光分子探针中，荧光团与受体单元之间存在着光诱导电子转移，对荧光有非常强旳淬灭作用，一般是电子从供体转移到激发态荧光团。所以在未结合客体之前，探针分子不发射荧光，或荧光很弱。一旦受体与客体相结合，光诱导电子转移作用受到克制，甚至被完全阻断，荧光团就会发射荧光。
• 利用某种物质对某一种荧光物质旳荧光猝灭作用而建立旳对该猝
灭剂旳荧光测定措施，即为荧光猝灭法。一般而言，荧光猝灭法比直接荧• 激发态荧光分子与猝灭剂碰撞使其荧光猝灭则称为动态猝灭。
静态淬灭
• 基态荧光分子与猝灭剂之间经过弱旳结合生成复合物，且该复合物使荧光完全猝灭旳现象称为静态猝灭。
• 静态猝灭旳特征是基态荧光分子M和猝灭剂Q发生反应，生成非荧光性物质，使M失去光谱特征。动态猝灭旳特征是激发态M*和 Q碰撞，发生能量或电子转移从而失去荧光性，或生成瞬时激发态复合物MQ*，使荧光分子M旳荧光猝灭。动态猝灭一般并不变化M旳吸收光谱。
PET光致电子转移
• 分子经过特定波长旳电磁波（可视光，紫外光等）照射后发生旳分子内部电子转移现象。
荧光淬灭
荧光猝灭分为静态淬灭和动态淬灭
荧光猝灭
• 荧光猝灭（fluorescence quenching）是指荧光物质分子与溶剂分子之间所发生旳造成：荧光强度变化或有关旳激发峰位变化或荧光峰位变化物理或化学作用过程。

报告基因和荧光淬灭

荧光淬灭对报告基因的影响
荧光淬灭对报告基因表达的影响
荧光淬灭可以影响报告基因的表达水平。在某些情况下，荧光淬灭可能增强报告基因的表达，而在其他情况下，它可能抑制表达。
荧光淬灭对报告基因稳定性的影响
荧光淬灭可以影响报告基因的稳定性。在某些情况下，荧光淬灭可能增加报告基因的稳定性，而在其他情况下，它可能降低稳定性
报告基因和荧光淬灭
04
在生物医学研究中的
应用
在疾病诊断中的应用
荧光淬灭技术可用于检测生物体内的特定分子或细胞，如蛋白质、核酸和细胞器等，从而为疾病诊断提供依据。
报告基因如绿色荧光蛋白（GFP）等，可用于标记和追踪细胞或组织，观察其在疾病发生和发展过程中的变化，有助于疾病的早期诊断和预后评估。
。
报告基因与荧光淬灭的相互作用
报告基因与荧光淬灭的相互影响
报告基因和荧光淬灭之间存在复杂的相互作用关系。一方面，报告基因的表达水平和稳定性可以影响荧光淬灭；另一方面，荧光淬灭也可以影响报告基因的表达水平和稳定性。
报告基因与荧光淬灭在生物体内的应用
了解报告基因与荧光淬灭的相互作用关系对于在生物体内应用这些技术至关重要。例如，在生物成像和生物传感器中，利用这些相互作用关系可以提高检测的灵敏度和特异性。
报告基因和荧光淬灭Байду номын сангаас
目录
• 报告基因 • 荧光淬灭 • 报告基因与荧光淬灭的关系 • 报告基因和荧光淬灭在生物医学研究中的应用 • 未来展望与研究方向
报告基因
01
定义与特性
定义
报告基因是一类编码可被检测的蛋白质或酶的基因，通常用于指示细胞或生物体的特定生理状态或表型。
特性
报告基因具有可检测性、特异性、可遗传性和可传递性等特性，能够为研究者提供直观、可靠的实验数据。

荧光的猝灭ppt课件

1 kq0[Q] 1 KSV[Q]
该式为Stern－Volmmer方程。 t0为没有猝灭剂时测得的荧光寿命； Ksv为Stern－Volmer猝灭常数，是双分子猝灭速率常数与单分子衰变速率常数的比值。
8
根据没有猝灭剂与存在猝灭剂时荧光寿命的不同，可得Stern－Volmer方程式的另一种表示形式：
*对有效的猝灭剂，KSV≈102 － 103 L/mol.
9
§4.2 静态猝灭
某些荧光物质溶液在加入一些猝灭剂之后，溶液的荧光强度显著降低，溶液的吸收光谱有了明显的变化; 其荧光强度随着温度的升高而增强。这种现象可能是由于荧光分子和猝灭剂之间形成不发光的基态配合物的结果。这种现象称为静态猝灭。
0 1 K [ Q ] SV
式中：t为猝灭剂存在时测得的荧光寿命。由上所述，若以F0/F对[Q]作图得一直线，斜率为Ksv。
直观的看，1/ Ksv的数值等于50％的荧光强度被猝灭时猝灭剂的浓度。假如测定了猝灭剂不存在时的荧光寿命t0，便可根据kq t0=Ksv的关系求得双分子猝灭过程的速率常数kq。

0 f
kf [ M ] Ia kf [1M*] Ia
1
* 0

kf ki kf ki kq[Q ] kf
kf
f
7
于是，没有猝灭剂存在时荧光强度F0与存在猝灭剂时的荧光强度F的比值为：
0 k f ki kq[Q] kq[Q] F f 0 1 F f k f ki k f ki
1 * 0
5
在猝灭剂存在的情况下： 1M*表示为：[1M*]，同理可得：
I ( k k M ] k [ Q ][ M *] 0 a f i)[ q

【精品】第五章-荧光分析法.PPT课件

光的量子数之比，常用 Φ表示。
23
24
（重点） 252627 Nhomakorabea28
29
30
三、影响荧光强度的外部因素 1、温度 2、溶剂：极性、粘度 3、酸度：荧光物质自身最适宜的pH范围 4、荧光熄灭剂：主要四种类型 5、散射光：瑞利光、拉曼光
31
五、影响荧光强度的外部因素
1）温度温度降低，荧光效率和荧光强度升高。
39
1、定量依据
荧光强度 If 正比于吸收的光强度 Ia 和荧光
量子产率Φ ：
I f Ia
由朗伯-比耳定律得：
Ia I0 It I0 110bC
荧光强度 If ：
I f I0 110bC I0 1 e2.303bC
40
对于稀溶液，当 2.303bC < 0.05时：
I f 2.303 f I0 bC
2）溶剂随着溶剂的极性的增加，荧光物质的π→π* 跃迁几率增加，荧光强度将增强，荧光波长也发生红移；溶剂粘度降低，荧光强度降低；溶剂应达到足够的纯度。
32
3）pH值
➢具酸或碱性基团的荧光物质，在不同pH值时，其结构可能发生变化，因而荧光强度将发生改变。荧光物质都自身最适宜的pH范围。
NH3+
13
振动弛豫
内转换
内转换
S2
系间窜跃
S1
能
T1 T2
量
发
发
吸
射
外转换
射
收
荧
磷
光
光
S0
l3
l1
l2
l 2
振动弛豫
荧光和磷光产生示意图
14
二、激发光谱与荧光光谱
激发光谱（excitation spectrum）：使不同激发波长的入射光激发荧光体，然后让所产生的荧光通过固定发射波长的单色器而照到检测器上，测定不同激发波长光照射下荧光强度的变化，以激发波长为横坐标，荧光强度为纵坐标，可得荧光物质的激发光谱。

第四章荧光的猝灭

1 k q 0 [Q] 1 K SV [Q]
该式为Stern－Volmmer方程。 t0为没有猝灭剂时测得的荧光寿命； Ksv为Stern－Volmer猝灭常数，是双分子猝灭速率常数与单分子衰变速率常数的比值。
8
根据没有猝灭剂与存在猝灭剂时荧光寿命的不同，可得Stern－Volmer方程式的另一种表示形式：
0 1 K SV [Q ]
式中：t为猝灭剂存在时测得的荧光寿命。由上所述，若以F0/F对[Q]作图得一直线，斜率为Ksv。
直观的看，1/ Ksv的数值等于50％的荧光强度被猝灭时猝灭剂的浓度。假如测定了猝灭剂不存在时的荧光寿命t0，便可根据kq t0=Ksv的关系求得双分子猝灭过程的速率常数kq。
上式中 [M]0为荧光分子的总浓度；F0与F分别为猝灭剂加入之前和加入之后所测得的荧光强度。
12
区分动态猝灭与静态猝灭：（1）最确切的方法是测量荧光体寿命；
对静态猝灭，猝灭剂的存在并没有改变荧光分子激发态的寿命，因此t0/t=1; 对动态猝灭，猝灭剂的使荧光分子寿命缩短， t0/t=F0/F （2）动态猝灭由于与扩散有关，而温度升高时溶液的粘度下降，同时双分子的运动加速，其结果使扩散系数增大，从而增大双分子猝灭常数。反之，温度升高可能引起配合物的稳定度下降，从而减小静态猝灭的常数。
20

光诱导电荷转移（photo-induced charge transfer)
Excitation of a fluorophore induces the motion of an electron from one orbital to another. If the initial and final orbitals are separated in space, the electronic transition is accompanied by an almost instantaneous change in the dipole moment of the fluorophore. When the latter possesses an electrondonating group (e.g. -NH2, -NMe2, -CH3O) conjugated to an electronwithdrawing group (e.g. -C=O, -CN), the increase in dipole moment can be quite large. Consequently, the excited state reached upon excitation (called the Franck–Condon state or locally excited state, LE) is not in equilibrium with the surrounding solvent molecules if the latter are polar. In a medium that is sufficiently fluid, the solvent molecules rotate during the lifetime of the excited state until the solvation shell is in thermodynamic equilibrium with the fluorophore. A relaxed intramolecular charge transfer (ICT) state is then reached.

(10检本)第七章-荧光免疫技术PPT课件

• 落射光：照明光线从标本上经垂直照明器落射到标本，经标本反射进入物镜。
透射荧光显微镜光路(a)
落射荧光显微镜光路(b)
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31
第四节荧光免疫分析
基本原理：将抗原抗体反应与荧光物质发光分析相结合，用荧光检测仪检测抗原抗体复合物中特异性荧光强度，对液体标本中微量或超微量物质进行定量测定。
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• (E)
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49
6、FITC在紫外光的激发下，所产生的荧光为 • A 灰蓝色 • B 黄绿色 • C 橙色 • D 暗红色 • E 橙红色 • （B）
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7、双标记荧光抗体技术的主要用途是 • A 提高荧光强度 • B 提高荧光效率 • C 可同时检测同一标本中两种抗原 • D 使用一种标记物可检测多种抗原 • E 减少非特异性荧光 • （C）
• 涂片：各种体液、穿刺液、细菌培养物和细胞悬液
• 培养细胞：单层培养细胞（人喉癌上皮细胞HEP-2)
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标本的固定和保存：固定剂：乙醇、甲醇、丙酮、甲醛等保存：4℃、-20 ℃
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二、荧光抗体染色与结果判断
于已固定的标本上滴加经适当稀释的荧光抗体置25-37 ℃ 30min或4 ℃过夜用 PBS充分洗涤镜检。
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试验类型
1 直接法 2 间接法 3 双标记法两种荧光素分别标记的两种不同的特异性抗体，与同一标本反应，荧光显微镜观察两种颜色。
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返回
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荧光抗体染色结果判断
设立实验对照:阳性对照和阴性对照区分特异和非特异染色阳性细胞显色分布:胞质型、胞核型和膜表面型
抗核抗体(均质型)

荧光猝灭

荧光猝灭分为静态猝灭和动态猝灭。

基态荧光分子与猝灭剂之间通过弱的结合生成复合物，且该复合物使荧光完全猝灭的现象称为静态猝灭。

激发态荧光分子与猝灭剂碰撞使其荧光猝灭则称为动态猝灭。

荧光分子本身浓度增大使其荧光猝灭的现象称为浓度猝灭或自猝灭。

由于荧光的再吸收、荧光物质发生化学变化而观察不到荧光的现象一般不称为荧光猝灭。

在利用荧光进行定量、液体闪击计数等包含荧光过程的测定方法中，一定要注意溶剂、共存杂质、氧气等猝灭剂的影响。

利用某种物质对某一种荧光物质的荧光猝灭作用而建立的对该猝灭剂的荧光测定方法，即为荧光猝灭法。

一般而言，荧光猝灭法比直接荧光测定法更为灵敏，具有更高的选择性。

分子结构和化学环境是影响物质发射荧光和荧光强度的重要因素. 至少具有一个芳环或具有多个共轭双键的有机化合物容易产生荧光,稠环化合物也会产生荧光.饱和的或只有一个双键的化合物,不呈现显著的荧光.最简单的杂环化合物,如吡啶,呋喃,噻吩和吡咯等,不产生荧光。

取代基的性质对荧光体的荧光特性和强度均有强烈影响.苯环上的取代基会引起最大吸收波长的位移及相应荧光峰的改变.通常给电子基团,如-NH2-,-OH,-OCH3,-NHCH3和-N(CH3)2等,使荧光增强;吸电子基团,如-CL,-Br,-I,-NHCOCH3,-NO2和-COOH,使荧光减弱.具有刚性结构的分子容易产生荧光。

大多数无机盐类金属离子不产生荧光,而某些情况下,金属螯合物却能产生很强的荧光. 溶剂的性质,体系的PH值和温度,都会影响荧光的强度. 荧光分子与溶剂或其他分子之间相互作用,使荧光强度减弱的现象称为荧光猝灭.引起荧光强度降低的物质称为猝灭剂.当荧光物质浓度过大时,会产生自猝灭现象。

荧光淬灭

如果这种能量传递不有效的话，可能荧光就强。

另外金的plasmon也会增强荧光材料的光吸收，可能会增强荧光总强度。

这两个竞争过程除了与波长有关外，朱要与距离有关，一般5纳米是界限，距离短被淬灭荧光淬灭有以下几种说法:1. 动态淬灭(碰撞淬灭,淬灭剂与发光物质的激发态分子之间的相互作用)2. 静态淬灭(发光分子基态和淬灭剂形成不发光的基态络合物)3. 转入三重态淬灭4. 自吸淬灭(浓度高时，自淬灭)首先确定荧光物质是否有电性，就是说荧光物质是否带有电荷，而且贵金属，例如纳米金，在制作过程中，表面由于有柠檬酸根而带有负电荷，可以和带正电荷的荧光物质，如带正电荷水溶性荧光共轭聚合物，通过静电作用，而使荧光猝灭；如果带相同电荷或者一方不带电荷，猝灭是不怎么明显的。

可以这样说，这种猝灭，是通过电荷作用相互吸附在一起，你可以让两者相互作用后，做一个TEM，就可以判断了。

荧光淬灭有动态淬灭和静态淬灭两种，稳态的荧光强度都显示出荧光强度的衰减，无法分辨，而动态淬灭至少分裂为2个荧光寿命，意味着能量转移的发生，而静态淬灭只是淬灭剂与荧光物结合生成非荧光物质，荧光寿命并不发生变化。

Acrylamide和碘离子分别用于疏水淬灭或亲水淬灭，测量蛋白质中Trp残基荧光淬灭的寿命，能够轻易的得知Trp残基是位于蛋白质表面还是内部。

荧光淬灭多用于分析大分子或胶体的结构或构象，用淬灭的方法研究荧光基团在分子内还是分子表面，有个淬灭的方程，一时写不出来，大概是淬灭剂浓度和荧光变化的关系，有个K常数，和淬灭效率和荧光寿命有关，如果分子构型改变，K会变化，这样就可以用来研究某些化合物对大分子构型或构象的影响。

荧光漂白，就是用强光把荧光素的激发态全部给消除了，有可逆和不可逆两种，可逆的漂白相当于清理出一个没有荧光的区域，相当于荧光清零，然后再观察测量某种特定的荧光的扩散、产生或恢复。

漂白是否可以恢复依赖于荧光素的种类和漂白光强，作为副作用，荧光素的漂白常会发生。

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