实验3蛋白质的等电点测定和沉淀反应

蛋白质等电点测定实验报告蛋白质等电点测定蛋白质等电点测定及性质实验一、目的：了解等电点的意义及其与蛋白质分子聚沉能力的关系。

初步学会测定蛋白质等电点的基本方法，了解蛋白质的性质。

二、原理：固体颗粒在液体中为什么能够带电？当固体与液体接触时，固体可以从溶液中选择性吸附某种离子，也可以是固体分子本身发生电离作用而使离子进入溶液，以致使固液两相分别带有不同符号的电荷，由于电中性的要求，带电表面附近的液体中必有与固体表面电荷数量相等但符号相反的多余的反离子。

在界面上带电表面和反离子形成了双电层的结构。

在两种不同物质的界面上，正负电荷分别排列成的面层。

对于双电层的具体结构，一百多年来不同学者提出了不同的看法。

最早于1879年Helmholz提出平板型模型；1910年Gouy和1913年Chapman修正了平板型模型，提出了扩散双电层模型；后来Stern又提出了Stern模型。

根据O.斯特恩的观点，一部分反离子由于电性吸引或非电性的特性吸引作用（例如范德华力）而和表面紧密结合，构成吸附层（或称紧密层、斯特恩层）。

其余的离子则扩散地分布在溶液中，构成双电层的扩散层（或称滑移面）。

由于带电表面的吸引作用，在扩散层中反离子的浓度远大于同号离子。

离表面越远，过剩的反离子越少，直至在溶液内部反离子的浓度与同号离子相等。

紧密层：溶液中反离子及溶剂分子受到足够大的静电力，范德华力或特性吸附力，而紧密吸附在固体表面上。

其余反离子则构成扩散层。

滑动面：指固液两相发生相对移动的界面，是凹凸不平的曲面。

滑动面至溶液本体间的电势差称为ζ电势。

固体颗粒带电量的大小及测量方式？ζ电势只有在固液两相发生相对移动时才能呈现出来。

ζ电势的大小由Zeta电位表示，其数值的大小反映了胶粒带电的程度，其数值越高表明胶粒带电越多，扩散层越厚。

一般来说，以pH值为横坐标，Zeta电位为纵坐标作图，Zeta电位为零对应的pH值即为等电点。

对于蛋白质分子来说：蛋白质分子的大小在胶粒范围内，约1～100微米。

蛋白质的两性反应和等电点测定一、实验目的1.熟悉蛋白质的沉淀反应、颜色反应和两性反应及其机理。

2.掌握蛋白质等电点的测定方法及其原理。

3.掌握蛋白质电荷的测定方法及其机理。

二、实验原理(一)蛋白质的沉淀反应原理蛋白质的水溶液是一种比较稳定的亲水胶体，这是因为蛋白质颗粒表面带有很多极性基团，如—NH3+，—COO-，—SH，—CONH2等和水有高度亲和性，当蛋白质与水相遇时，就很容易被蛋白质吸住，在蛋白质颗粒外面形成一层水膜(又称水化层)。

水膜的存在使蛋白颗粒相互隔开，颗粒之间不会碰撞而聚成大颗粒。

因此蛋白质在溶液中比较稳定而不会沉淀。

蛋白质能形成较稳定的亲水胶体的另一个原因，是因为蛋白质颗粒在非等电状态时带有相同电荷，使蛋白质颗粒之间相互排斥，保持一定距离，不致相互凝集沉淀。

蛋白质由于带有电荷和水膜，因此在水溶液中形成稳定的胶体。

当某些物理化学因素破坏了蛋白质的水膜或中和了蛋白质的电荷，则蛋白质胶体溶液就不稳定而出现沉淀现象。

蛋白质可因加入下列试剂而产生沉淀：1.加盐类如硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等可以破坏蛋白质胶体周围的水膜，同时又中和了蛋白质分子的电荷，因此使蛋白质产生沉淀，这种加盐使蛋白质沉淀析出的现象称盐析。

盐析法是分离制备蛋白质的常用方法，不同蛋白质盐析时所需的盐浓度不同，因此调节盐浓度，可使混合蛋白质溶液中的几种蛋白质分段析出，这种方法叫做分段盐析。

但中性盐并不破坏蛋白质的分子结构和性质，因此，若除去或降低盐的浓度，蛋白质就会重新溶解。

2.加有机溶剂如酒精、丙酮等可使蛋白质产生沉淀，这是由于这些有机溶剂和水有较强的作用，破坏了蛋白质分子周围的水膜，因此发生沉淀作用。

若及时将蛋白质沉淀与丙酮或乙醇分离，蛋白质沉淀则可重新溶解于水中。

3.重金属盐如氯化汞、硝酸银、醋酸铅及三氯化铁等。

这是因为蛋白质在碱性溶液中带负离子，可与这些重金属的正离子作用而生成不易溶解的盐而沉淀。

4.某些酸类如苦味酸、单宁酸、三氯乙酸等能和蛋白质化合成不溶解的蛋白质盐而沉淀。

实验三蛋白质的两性反应和等电点的测定一、目的和要求1.了解蛋白质的两性解离性质。

2.初步学会测定蛋白质等电点的方法。

二、原理蛋白质由许多氨基酸组成，虽然绝大多数的氨基与羧基成肽键结合，但是总有一定数量自由的氨基与羧基，以及酚基等酸碱基团，因此蛋白质和氨基酸一样时两性电解质。

调节溶液的酸碱度达到一定的氢离子浓度时，蛋白质分子所带的正电荷和负电荷相等，以兼性离子状态存在，在电场内该蛋白质分子既不向阴极移动，也不向阳极移动，这时溶液的PH值称为该蛋白质的等电点（PI）。

当溶液的PH低于蛋白质等电点时，即在氢离子较多的条件下，蛋白质分子带正电荷成为阳离子；当溶液的PH高于蛋白质等电点时，即在氢氧根离子较多的条件下，蛋白质分子带负电荷成为阴离子。

在等电点时蛋白质溶解度最小，容易沉淀析出。

三、试剂和器材1.试剂0.5%酪蛋白溶液；酪蛋白醋酸钠溶液；0.04%溴甲酚绿指示剂；0.02N盐酸；0.1N醋酸溶液；0.01N醋酸溶液；1N醋酸溶液；0.02N氢氧化钠溶液2.器材试管及试管架；滴管；吸量管（1、5ml）四、操作方法1.蛋白质的两性反应（1）取1支试管，加0.5%酪蛋白溶液20滴和0.04%溴甲酚绿指示剂5-7滴，混匀。

观察溶液呈观的颜色，并说明原因。

（2）用细滴管缓慢加入0.02N盐酸溶液，随滴随摇，直至有明显的大量沉淀发生，此时溶液的PH 接近与酪蛋白的等电点。

观察溶液颜色的变化。

（3）继续滴入0.02N盐酸溶液，观察沉淀和溶液颜色的变化，并说明原因。

（4）再滴入0.02N氢氧化钠溶液进行中和，观察是否出现沉淀，解释其原因。

继续滴入0.02N氢氧化钠溶液，为什么沉淀又会溶液？溶液的颜色如何变化？说明了什么问题？2.酪蛋白等电点的测定（1）取9支粗细相近的干燥试管，编号后按下表的顺序准确地加入各种试剂。

加入每种试剂后应混合均匀。

试管编号9蒸馏水（ml）2.43.2—1.60.8———2.03.03.51.52.753.38————————加1N醋酸溶液入0.1N醋酸溶液—的0.01N醋酸溶液—试酪蛋白醋酸钠剂溶液最终PH沉淀出现情况4.02.01.00.5—————2.51.250.621.01.01.01.01.01.01.01.01.03.53.84.14.44.75.05.35.65.9（2）静置约20分钟，观察每支试管内溶液的混浊度，以—，+，++，+++，++++符号表示沉淀的多少。

实验项目一、蛋白质的等电点测定及沉淀反应姓名：指导教师：实验室：组员：成绩：第三部分：实验记录与分析实验现象记录及分析：（一）蛋白质等电点测定（二）蛋白质的盐析1．蛋白质的盐析2．重金属离子沉淀蛋白质3．有机酸沉淀蛋白质4．有机溶剂沉淀蛋白质5．乙醇引起的变性与沉淀第四部分：课后研讨题1.通过本次合作实验后，有否对该项目改进的合理建议。

适当增加对照组和空白组，使实验数据更加科学可信。

2.鸡蛋清为何可做铅、汞中毒的解素剂？铅、汞是重金属离子，与蛋白质结合能使蛋白质分子内部结构发生重大改变，发生变性而沉淀，不再溶于原来的溶剂中。

3.氯化汞为何能做为杀菌剂？细菌由蛋白质构成，氧化汞是重金属盐，与蛋白质结合能使蛋白质分子内部结构发生重大改变，发生变性而沉淀，不再溶于原来的溶剂中。

4.在等电点时，蛋白质溶液为什么容易发生沉淀？蛋白质颗粒上正负电荷的数目相等，在水溶液中的蛋白质分子由于表面生产水化层和双电层而成为稳定的亲水胶体颗粒，在一定的理化因素影响下，蛋白质颗粒可因失去电荷和脱水而沉淀。

5.将本实验中所涉及到的几种蛋白质沉淀方法各举一应用实例加以说明。

（1）盐析：硫酸铵的浓溶液能析出蛋白质。

（2）乙醇引起的变性与沉淀：低温下用乙醇或丙酮短时间作用于蛋白质，用于提纯蛋白质。

（3）重金属离子沉淀蛋白质：取一支离心管，加入2ml的蛋白质溶液，再加入3%硝酸银溶液1-2滴，振荡试管，观察现象。

（4）某些有机酸沉淀蛋白质：取一支离心管，加入2ml蛋白质溶液，再加入1ml 5%三氯乙酸溶液，振荡试管，观察现象。

（5）有机溶剂沉淀蛋白质：取一支离心管，加入2ml蛋白质溶液，再加入2ml 95%乙醇，观察现象。

教师评阅：签名。

实验三蛋白质的沉淀与变性反应一、实验目的1、加深对蛋白质胶体溶液稳定因素的认识。

2、了解沉淀蛋白质的几种方法及其实用意义。

3、了解蛋白质变性与沉淀的关系。

二、实验原理多数蛋白质是亲水胶体，在水溶液中，蛋白质分子的表面，由于形成水化层和双电层而称为稳定的胶体颗粒，所以蛋白质溶液和其他亲水胶体溶液相类似。

但是，蛋白质胶体颗粒的稳定性是有条件的、相对的。

在一定的物理化学因素影响下，蛋白质颗粒失去电荷，脱水，甚至变性以固态形式从溶液中析出，这个过程称为蛋白质的沉淀反应。

这种反应可以分为以下两种类型。

1、可逆沉淀反应：在发生沉淀反应时，蛋白质虽已沉淀析出，但它的分子内部结构并未发生显著变化，基本上保持原有的性质，沉淀因素出去后，能在溶于原来的溶剂中。

这种作用称为可逆沉淀反应，又叫做不变性沉淀反应。

属于这一类的反应有盐析作用、利用等电点的沉淀以及在低温下，乙醇、丙酮对蛋白质的短时间作用等。

2、不可逆沉淀反应：在发生沉淀反应时，蛋白质分子内部结构、空间构象遭到破坏，失去原来的天然性质，这时蛋白质已发生变性。

这种变性蛋白质的沉淀不能再溶于原来溶剂中的作用叫做不可逆沉淀反应。

重金属盐、生物碱试剂、过酸、过碱、加热、震荡、超声波，有机溶剂等都能使蛋白质发生不可逆沉淀反应。

三、仪器、试剂和材料1、仪器试管及试管架，移液管，玻璃漏斗，滤纸，玻璃棒，烧杯，量筒。

2、试剂（1）蛋白质溶液：取5ml鸡蛋蛋清，用蒸馏水稀释至100ml，搅拌均匀后用4~8层纱布过滤，新鲜配制；（2）饱和硫酸铵溶液：称取固体（NH4）2SO4加于1000ml蒸馏水中，在70~80°C下搅拌促溶，室温中放置过夜，瓶底析出白色结晶，上清液即为饱和硫酸铵溶液。

（3）饱和苦味酸溶液：称取2g苦味酸放入三角烧瓶，加蒸馏水100ml，80℃水浴约10min 使之完全溶解，于室温下冷却后瓶底析出黄色结晶，上清液即为饱和苦味酸，此溶液可存放数年；（4）其他试剂硫酸铵粉末，3%硝酸银，1%醋酸铅，1%硫酸铜，10%三氯乙酸，0.5%磺基水杨酸，95%乙醇，1%醋酸，5%鞣酸。