中国团队成功研发提取外泌体的新型片上磁性提取系统

外泌体的提取方法及其在药物递送系统中的应用王飘飘;王会会;王雷;姚亮;彭代银;陈卫东【摘要】外泌体是一种活细胞产生的直径为40～150 nm微小囊泡,通过携带的蛋白质、脂类、RNA等参与细胞间的信息交流和物质交换.因不同生理状态下产生的外泌体作用不同,现其被广泛应用于临床肿瘤的诊断和治疗.另外,外泌体作为内源性的天然纳米材料,在药物的递送中也有着独特的优势.外泌体能更好地应用于各领域的前提是产量和纯度有所保证.因此,该文就外泌体的提取方法及其在药物递送系统中的应用做一介绍.【期刊名称】《中国药理学通报》【年(卷),期】2019(035)003【总页数】6页(P309-314)【关键词】外泌体;提取分离;药物递送系统;靶向给药;肿瘤;抗肿瘤药物【作者】王飘飘;王会会;王雷;姚亮;彭代银;陈卫东【作者单位】安徽中医药大学药学院,安徽合肥 230011;安徽中医药大学药学院,安徽合肥 230011;安徽中医药大学药学院,安徽合肥 230011;安徽中医药大学药学院,安徽合肥 230011;安徽中医药大学药学院,安徽合肥 230011;安徽省中药研究与开发重点实验室,安徽合肥 230031;安徽中医药大学药学院,安徽合肥 230011【正文语种】中文【中图分类】R-05;R329.24;R341;R34-33;R730.5;R943;R979.1外泌体(exosomes，Exos)是细胞分泌的一种膜囊泡，因其可以将供体细胞的信息通过其携带的蛋白质、mRNA、miRNA等传递到受体细胞，实现细胞之间的信息交流及物质交换，并且可以作为药物载体转运药物而引起科学家的广泛关注[1](Fig 1)。

外泌体作为内源性的天然药物载体有着独特的优势，表面由脂质和蛋白质组成，使其可以穿透许多生物膜，提高药物的运输效率和靶向性，可以稳定存在于血液中，纳米级尺寸明显增强药物在肿瘤部位的渗透滞留效应(permeability and retention effect, EPR)[2]。

专利名称：一种用于捕获血液中外泌体的磁性纳米颗粒的制备方法及其应用
专利类型：发明专利
发明人：张晓晶,沈挺,宋毅
申请号：CN201811196530.2
申请日：20181015
公开号：CN109402052B
公开日：
20220222
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开了一种用于捕获血液中外泌体的磁性纳米颗粒的制备方法及其应用，特点是包括以下步骤：（1）将六水合氯化二铁和四水合氯化亚铁混合后溶于蒸馏水中，搅拌混匀后加热至70℃，然后缓慢滴加氨水溶液，水解基本完成后，向溶液缓慢加入溴化十六烷基三甲胺，搅拌离心收集产物洗涤，取下层沉淀真空干燥得到纳米Fe3O4粒子；（2）取纳米Fe3O4粒子分散在由乙醇水溶液中超声处理后，加入原硅酸四乙酯溶液后，逐渐加入氨水水浴中反应5h，离心收集产物，洗涤干燥即为包裹了SiO2且表面分布孔径为40‑200nm的不规则的磁性微纳米颗粒，优点是最大程度无损结合外泌体，且使用的样本量少，处理时间短，操作简便。

申请人：宁波美晶医疗技术有限公司
地址：315100 浙江省宁波市高新区光华路299弄6幢12号1-1
国籍：CN
代理机构：宁波奥圣专利代理有限公司
代理人：何仲
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外泌体提取和鉴定介绍
外泌体是细胞分泌的一种小囊泡，直径在30-150 纳米之间，含有多种生物分子，如蛋白质、核酸、脂质等。

它们在细胞间通讯、疾病诊断和治疗等方面具有重要的作用。

外泌体的提取通常需要使用特殊的方法，以确保其纯度和完整性。

常见的提取方法包括超速离心、超滤、免疫亲和层析等。

这些方法可以根据外泌体的大小、表面标志物或其他特性进行分离和纯化。

鉴定外泌体的方法也有很多种。

其中一些常见的方法包括：
- 电子显微镜：观察外泌体的形态和大小。

- Western blot：检测外泌体表面标志物或内含物的蛋白质。

- 纳米颗粒跟踪分析：测量外泌体的粒径分布和浓度。

- 流式细胞术：根据外泌体的表面标志物进行分选和定量。

此外，还可以通过检测外泌体中的RNA 或DNA 来进一步分析其内容和功能。

这些鉴定方法可以帮助确定所提取的物质是否为真正的外泌体，并提供有关其特性和功能的信息。

需要注意的是，外泌体的研究仍然是一个相对较新的领域，不同的实验方法和技术可能会有所差异。

在进行外泌体提取和鉴定时，最好根
据具体的研究目的和实验条件选择合适的方法，并结合多种技术进行综合分析。

外泌体提取方法外泌体是一类细胞外囊泡，其直径一般在30-1000纳米之间，可以带有脂质、蛋白质、核酸等多种生物分子，是细胞间物质交换的重要载体。

外泌体的提取方法对于研究其功能和应用具有重要意义。

本文将介绍几种常用的外泌体提取方法，供大家参考。

一、超速离心法。

超速离心法是目前最常用的外泌体提取方法之一。

首先，将细胞培养液离心，去除细胞残渣和大颗粒物质，得到上清液。

然后，将上清液进行超速离心，沉淀出外泌体。

最后，去除上清液，留下外泌体沉淀，即可得到外泌体。

二、超滤法。

超滤法是另一种常用的外泌体提取方法。

首先，将细胞培养液经过低速离心，去除细胞残渣和大颗粒物质，得到上清液。

然后，将上清液通过超滤膜进行过滤，截留外泌体。

最后，用PBS等缓冲液洗涤超滤膜上的外泌体，即可得到外泌体。

三、沉淀法。

沉淀法是一种简单易行的外泌体提取方法。

首先，将细胞培养液离心，去除细胞残渣和大颗粒物质，得到上清液。

然后，向上清液中加入聚乙二醇或其他沉淀剂，使外泌体沉淀出来。

最后，用PBS等缓冲液洗涤外泌体沉淀，即可得到外泌体。

四、免疫磁珠法。

免疫磁珠法是一种特异性较强的外泌体提取方法。

首先，将细胞培养液经过低速离心，去除细胞残渣和大颗粒物质，得到上清液。

然后，向上清液中加入特异性抗体修饰的磁珠，使外泌体与磁珠结合。

最后，利用磁场将外泌体结合的磁珠吸附在管壁上，去除上清液，再用缓冲液洗涤磁珠，即可得到外泌体。

以上介绍了几种常用的外泌体提取方法，每种方法都有其特点和适用范围。

在实际操作中，可以根据研究需求和实验条件选择合适的提取方法。

希望本文的介绍能够对外泌体的研究工作有所帮助。

泌物异常、阴道内肿块、疼痛、性交困难，其中阴道出血是最常见的症状[2]。

黑色素瘤中主要含有的黑色素颗粒是顺磁性物质，能够缩短T1WI和T2WI弛豫时间[3]。

恶性黑色素瘤特征性的MRI表现为T1WI呈等、高信号，T2WI呈低信号，DWI呈高信号，增强扫描呈明显强化[4]。

本例患者偏年轻，无阴道流血等，年龄及临床表现不典型。

初诊时未发现身体其他部位黑色素瘤征象，可排除转移性黑色素瘤。

本例MRI表现DWI呈高信号，增强扫描呈明显强化，提示恶性，对临床术前评估有指导意义。

本例阴道壁占位MRI表现T1WI呈等信号，T2WI及T2WI 压脂呈高信号，与典型的阴道恶性黑色素瘤MRI表现不相符合，与高婧等[4]报道典型MRI表现有差异。

提示本例恶性黑色素瘤中的黑色素颗粒比例较少。

曹军等[5]报道称部分黑色素瘤可由“无黑色素”的梭形细胞构成。

少数黑色素瘤不含有黑色素颗粒，一般表现为T1WI和T2WI呈中等信号，此种情况MRI诊断较为困难[3]。

综上所述，含有黑色素的阴道原发黑色素瘤具有典型的MRI特征，一般可明确诊断。

对不含有黑色素颗粒的黑色素瘤，诊断较为困难。

若T1WI呈等或低信号，T2WI呈高信号，尤其是专科检查发现色素沉着，要考虑到缺乏黑色素颗粒的恶性黑色素瘤可能，确诊需要结合病理免疫组化检测。

利益冲突：无。

参考文献 [References][1] Fmmovitz M, Etchepareborda M, Sun CC, et al. Primary malignantmelanoma of the vagina. Obstet Gynecol, 2010, 116(6): 1358-1365. [2] Wang YY, Shi QF, Zhao J, et al. Report of 5 cases malignant melanomaof the vaginal wall. J Diag Pathol, 2017, 24(6): 462-465.王玥元, 石清芳, 赵洁, 等. 阴道壁恶性黑色素瘤5例报道. 诊断病理学杂志, 2017, 24(6): 462-465.[3] Hong BK, Dai HY, Lin FF, et al. MRI diagnosis value of choroidalmelanoma. Chin J Magn Reson Imaging, 2014, 5(3): 178-181.洪璧楷, 代海洋, 林枫枫, 等. 脉络膜黑色素瘤的磁共振诊断价值. 磁共振成像, 2014, 5(3): 178-181.[4] Gao J, Sun QY, Meng Y. A case of primary malignant melanoma of thevagina. J Jilin Med Univ, 2019, 40(2): 112.高婧, 孙崎元, 孟姮. 阴道原发性恶性黑色素瘤1例. 吉林医药学院学报, 2019, 40(2): 112.[5] Cao J, Qiu JX, Li CF, et al. A clinicopathological analysis of a case ofnonpigmented spindle cell melanoma of the vagina. J Clin Exp Pathol, 2016, 32(2): 217-218.曹军, 邱建学, 李春飞, 等. 阴道无色素梭形细胞型恶性黑色素瘤1例临床病理分析. 临床与试验病理学杂志, 2016, 32(2): 217-218.Cite this article as:Yu ZH, Wang H. Primary malignant melanoma of vagina: One case report and literature review. Chin J Magn Reson Imaging, 2020, 11(10): 924-925.本文引用格式：余泽浩, 王虎. 阴道原发恶性黑色素瘤1例并文献复习. 磁共振成像, 2020, 11(10): 924-925.资讯 Information 中科院分子影像重点实验室研发的磁粒子成像关键核心技术获国家发明专利快速授权中科院分子影像重点实验室申请的“基于FFL的磁粒子成像三维立体重建方法、系统、装置”(ZL201910637247.7)和“基于无磁场线扫描的磁粒子成像系统” (ZL201910637709.5)两项国家发明专利已经通过国家知识产权局的审查。

外泌体的提取、鉴定和保存方法研究进展蒲双双【摘要】外泌体是一种直径介于40～100 nm之间的膜性囊泡,由活体细胞分泌产生,广泛存在于人体各种体液中,富含多种蛋白质和RNA,是细胞间传递生物信息的重要载体,在生理调节和病理发展中都发挥重要作用,是近年来研究的热点.为更深入研究外泌体生物学作用机制,提取高质量的外泌体是首要步骤,基于此,笔者就外泌体的各种提取方法及其优缺点以及鉴定和保存方法的研究进展作如下综述,希望此文能为研究者们提供一些参考,为后续研究打好基础.【期刊名称】《现代检验医学杂志》【年(卷),期】2018(033)005【总页数】4页(P157-160)【关键词】外泌体;提取;鉴定;保存【作者】蒲双双【作者单位】山东中医药大学附属医院检验科,济南 250011【正文语种】中文【中图分类】R446外泌体，于1987年由Johnstone等[1]在研究绵羊网织红细胞时发现，是一种直径介于40～100nm的囊泡样结构。

在电子显微镜下，外泌体由双层磷脂膜包裹，内含丰富的蛋白质以及micro RNA等成分，其中一些独特的蛋白(如CD9，CD63，CD81，HSP70，TSG101等)还可作为外泌体的特征蛋白，在外泌体提取和鉴定中起重要作用。

起初，外泌体被认为是细胞排泄的废物，但近年来，越来越多的研究表明外泌体参与物质运输，还携带和传递重要的生物信息[2]，在介导免疫抗原递呈、树突状细胞的活化、神经退行性疾病发生、肿瘤细胞抗原的转移及肿瘤诊断治疗中发挥重要作用[3～5]。

随着蛋白质组学和基因组学等分析手段的发展，外泌体介导的生物学效应及其背后的分子机制将会更加清晰，但在此研究过程中，外泌体的提取纯化、鉴定及合理保存是首要的步骤，也是一切后续实验的基础，毕竟只有高纯度、高活性的外泌体才能确保后续实验的质量和可信度。

为此我们对目前常用的外泌体提取、鉴定和保存的方法及其优缺点做如下综述：1 外泌体提取方法1.1 超速离心法(差速离心法) 超速离心法是目前制备外泌体的经典方法，是根据外泌体的沉降系数差速离心将其分离出来。

外泌体分离富集新技术
外泌体分离富集新技术是指利用新的技术方法从体液或细胞培养液中分离并富集外泌体的过程。

外泌体是一种细胞释放的小囊泡，含有多种生物分子，如蛋白质、核酸和脂质等。

研究表明，外泌体可以在细胞间传递信号分子，对细胞功能和疾病发展起到重要调控作用，因此对于外泌体的研究具有重要意义。

传统的外泌体分离方法包括超速离心、滤膜过滤和密度梯度离心等，但这些方法存在着分离效率低、样品体积限制和操作复杂等问题。

为了克服这些问题，研究人员开发了一系列新的外泌体分离富集技术。

一种新的技术是使用亲和捕获剂，如抗体或受体配体，将特定的外泌体与其他细胞成分区分开来。

这种方法可以通过专一的结合作用将外泌体富集在特定的固相材料上，从而提高分离效率。

另一种新技术是利用纳米技术，如纳米悬浮液体或纳米过滤器，实现对外泌体的选择性富集。

纳米技术可以根据外泌体的大小和表面特性，通过调整纳米材料的孔径和表面功能化，实现对外泌体的高效分离。

此外，一些新技术还利用电声流芯片、微流控技术和磁性颗粒等方法实现了对外泌体的快速、高通量分离。

这些方法具有成本低、操作简便和可扩展性好等优点，可以在临床和基础研究中广泛应用。

总之，外泌体分离富集新技术的发展为外泌体研究提供了更多的选择，可以更准确、高效地获取外泌体，并进一步深入研究其功能和应用。

M2巨噬细胞来源的外泌体转运miR-1260b促进胶质母细胞瘤迁移的机制研究张衡;陈倩倩;桂艳萍;黄敏;郭雅冰;赵丽【期刊名称】《中国药科大学学报》【年(卷),期】2023(54)1【摘要】肿瘤相关巨噬细胞浸润肿瘤组织并促进胶质母细胞瘤进展,但作用机制还有待进一步研究。

本文以探究M2巨噬细胞通过分泌外泌体影响胶质母细胞瘤迁移能力的机制为目的。

采用超高速离心法提取外泌体;采用RNA测序筛选差异表达的miRNA;采用数据库靶点预测miRNA可能的靶蛋白;采用双萤光素酶报告基因实验验证miRNA与靶基因的相互作用;采用裸鼠皮下移植瘤模型检测肿瘤细胞增殖能力。

实验结果表明,肿瘤相关巨噬细胞主要是M2巨噬细胞,M2巨噬细胞分泌的外泌体能够促进脑胶质瘤细胞的迁移,其机制与转运miR-1260b且靶向调控AJAP1影响脑胶质瘤细胞的迁移有关,提示巨噬细胞分泌的外泌体通过转运miR-1260b,从而影响胶质母细胞瘤的迁移能力。

【总页数】12页(P95-106)【作者】张衡;陈倩倩;桂艳萍;黄敏;郭雅冰;赵丽【作者单位】中国药科大学基础医学与临床药学学院;中国药科大学药学动物实验中心【正文语种】中文【中图分类】R965【相关文献】1.扶正抗癌方通过M2型巨噬细胞来源的外泌体途径抑制95D细胞转移的作用机制研究2.M2型巨噬细胞来源的外泌体对类风湿关节炎小鼠的作用及其机制研究3.恶性肿瘤来源外泌体在巨噬细胞M2极化中作用的研究进展4.喉癌细胞来源外泌体通过微小核糖核酸-21-5p促进巨噬细胞M2极化的作用及机制研究5.肝癌细胞外泌体诱导巨噬细胞M2极化后促进肝癌细胞迁移及侵袭因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710985380.2(22)申请日 2017.10.20(71)申请人 上海市同济医院地址 200065 上海市普陀区新村路389号(72)发明人 李冬　潘星昊　权文强　吴军录　(74)专利代理机构 上海卓阳知识产权代理事务所(普通合伙) 31262代理人 巫蓓丽(51)Int.Cl.C12N 5/071(2010.01)(54)发明名称一种组织来源外泌体的提取方法及应用(57)摘要本发明涉及一种组织来源外泌体的提取方法，属于生物技术领域，所述的方法基于酶裂解组织后直接进行外泌体提取，所述的方法包括以下步骤：步骤一、将组织用机械法剪碎后加入胶原酶和Dnase酶进行裂解；步骤二、对裂解后的混合液使用PEG法进行外泌体提取操作。

其优点表现在：本发明的方法直接从组织中获取外泌体用于下一步的研究，本方法克服了不能从组织中直接提取外泌体的难题，采用酶解-过滤-离心的方法提取外泌体，拓展了外泌体研究的领域，对于推动外泌体的研究意义重大。

权利要求书1页 说明书5页 附图3页CN 107523536 A 2017.12.29C N 107523536A1.一种组织来源外泌体的提取方法，其特征在于，所述的方法基于酶裂解组织后直接进行外泌体提取，所述的方法包括以下步骤：步骤一、将组织用机械法剪碎后加入胶原酶和Dnase酶进行裂解；步骤二、对裂解后的混合液使用PEG法进行外泌体提取操作。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤一为以下步骤：(1)新鲜组织直接置于冷的1640培养液中，用机械法将组织破碎；(2)加入的胶原酶和Dnase酶裂解组织为细胞悬液。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤一为以下步骤：(1)冷冻的组织迅速置于37℃水浴锅中回温，之后置于冷的1640培养液中，用机械法将组织破碎；(2)加入的胶原酶和Dnase酶裂解组织为细胞悬液。