常用核酸探针标记方法

常用核酸探针标记方法1、切口平移法（nick translation）原理：先用适量的DNase I 在Mg2+存在下，在双链DNA 上打开若干个单链缺口。

利用E. coli DNA 聚合酶I 的5'- 3' 核酸外切酶活性在切处将旧链从5’-末端逐步切除。

同时DNA 聚合酶I的5'- 3'聚合酶活性的作用下，顺序将dNTP连接到切口的3’-末端-OH上，以互补的DNA 单链为模板合成新的DNA单链。

图1 切口平移法原理示意图特点：1）各种螺旋状态（超螺旋、闭环及开环）及线性的双链DNA均可作为缺口平移法的标记底物。

但单链DNA和RNA不能采用此方法进标记。

双链DNA小片段（>100-200bp）也不是此法标记的理想底物。

2）DNA多聚酶必须是E·Coli DNA多聚酶的全酶。

3）DNA模板要用纯化过DNA2、随机引物法（random priming）原理：将待标记的DNA探针片段变性后与随机引物一起杂交，然后以此杂交的寡核苷酸为引物，大肠杆菌DNA聚合酶I大片段（E·Coli DNA polymerase I Klenow Fragment）的催化下，合成与探针DNA互补的DNA链。

当反应液中含有标记的dNTP时，即形成标记的探针。

图2 随机引物标记法原理示意图特点：1）除了能进行双链DNA标记外，也可用于单链DNA和RNA探针的标记。

2）所得到的标记产物是新合成的DNA单链，而所加入的DNA片段本身并不能被标记。

3）新形成的标记DNA单链的长度与加入寡核苷酸引物的量成反比，因为加入的寡核苷酸数量越多，合成起点也越多，得到的片段的长度也越短。

按标准方法得到的标记产物长度一般为200-400bp。

3、末端标记与切口平移法和随机引物法不同，DNA末端标记法并不将DNA片段的全长进行标记，而是只将其一端（5’或3’端）进行部分标记。

其特点是可得到全长DNA片段，DNA片段并非均匀标记，标记活性不高。

核酸的分子杂交技术一、核酸分子杂交用标记的已知DNA或RNA片段（探针）来检测样品中未知核酸序列，通过核苷酸间碱基互补的原则发生异源性结合，再经显影或显色的方法，将结合核酸序列的位置或大小显示出来。

待测的核酸序列，可以是克隆的基因片段，也可以是未克隆化的基因组DNA和组织细胞的RNA。

二、核酸分子杂交的分类液相杂交核算分子杂交印记杂交固相杂交原位杂交1.固相杂交：将需要杂交的一条核酸链先固定在固体支持物上，另一条核酸链游离在液体中。

2.液相杂交：参与反应的两条核酸链都游离在液体中。

常用固相杂交类型：Southern印迹杂交、Northern印迹杂、菌落原位杂交、斑点杂交、狭缝杂交、组织原位杂交、夹心杂交等。

三、核酸分子杂交的基本原理1、变性：在某些理化因素的作用下，核酸双链分子碱基对的氢键断裂，疏水作用被破坏，双链螺旋或发夹结构被拆开，有规则的空间结构被破坏，形成单链分子，称为核酸的变性。

﹡引起核酸变性的因素：热、酸、碱、化学试剂（如：尿素、甲酰胺、甲醛等）。

﹡加热变性是最常用的方法，一般加热80-100℃数分钟即可使核酸分子氢键断裂，双链分开。

﹡变性的核酸分子失去了生物活性，同时理化性质也随之改变，其紫外吸收值（A260）也随之升高。

可用紫外吸收的变化来跟踪DNA的变性过程。

以A260吸收值对应温度作图，得到DNA的变性曲线或熔解曲线。

增色效应：DNA变性后对260nm紫外光收增加的现象。

DNA热变性现象双螺旋结构即发生解体，两条链分开形成无规则线团。

同时，一系列物化性质发生改变：260nm处紫外吸收值升高，粘度降低，浮力密度升高。

由于二级结构的丧失，也失去了部分或全部生物活性。

增色效应和减色效应当DNA分子加热变性后，其260nm的紫外吸收会急剧增加的现象称为增色效应。

变性DNA复性后，在260nm处的吸收值减少的现象称为减色效应。

A260值达到最大值1/2时的温度称为解链温度或熔解温度（melting temperature,Tm)，此时50%的DNA分子发生了变性。

探针标记方法大全1、DNA的缺口平移法缺口平移是一种快速、简便、成本相对较低以及生产高比活性均一标记DNA的方法。

该技术可以制备序列特异的探针。

当使用重组质粒探针时，虽然任何形式的双链DNA都可以进行缺口平移标记。

但通常使用限制性核酸内切酶将插入片段进行酶切和凝胶电泳纯化后再进行缺口平移标记。

此外，用这种探针进行杂交可产生较低的背景信号。

2、DNA的随机引物法这种方法是使用寡核苷酸引物和大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段来标记DNA片段。

这种方法可代替缺口平移产生均一的标记探针外，还在许多方面优于缺口平移法，比如标记核苷酸在DNA探针中的掺入率可达50％以上。

由于在反应过程中加入的DNA片段不被降解，故在随机引物反应中加入的DNA可少于200 ng，甚至10 ng也能有效地标记。

DNA片段的大小不影响标记的结果。

标记物沿所加入的全长DNA被均等地掺入。

标记的探针可以直接使用而不需要去除未掺入的核苷酸；单链双链DNA都可作为随机引物标记的模版。

随机引物可用于较小的DNA片段（100~500 bp），而缺口平移法对大DNA片段（>1000 bp）效果最好。

随机引物法的主要缺点是产生的标记探针量比缺口平移的要少些，此外环状DNA不能有效地标记，必须先用限制性内切核酸酶线形化或用碱法或DNA酶Ⅰ产生缺口。

3、RNA的体外转录法体外转录法标记RNA探针可用于商品化转录质粒来制备。

这些质粒中应该包括SP6、T3、或T7 RNA聚合酶的RNA启动位点和，而这些启动位点则与多克隆位点（multiple cloning sites，MCS）相邻。

4、RNA的寡脱氧核苷酸法克隆质粒pSP64、pGEM-3、pGEM-4等含邻近MCS的SP6RNA启动子，可作为从DNA寡核苷酸模版产生RNA探针的基础。

这两种标记方法产生探针量大，而且产生的探针不受载体序列的影响，所需要的线性化的质粒DNA大约1 ug，但需要高纯度的模板。

核酸探针的原理及应用1. 导言核酸探针是一种用于检测和鉴定核酸分子的分子探针。

它通过特异性识别目标核酸序列，可广泛应用于基因组学、生物医学研究、临床诊断等领域。

本文将介绍核酸探针的原理和应用。

2. 核酸探针的原理2.1 核酸杂交原理核酸探针的原理基于核酸的互补配对特性。

当目标核酸序列与探针的互补序列相遇时，它们之间会发生杂交反应。

杂交后，探针会与目标核酸形成稳定的双链结构，从而实现对目标核酸的特异性识别和检测。

2.2 核酸标记技术核酸探针通常需要标记以便于检测。

常用的核酸标记技术包括荧光标记、放射性标记和酶标记等。

这些标记可以通过特定的检测方法，如荧光显微镜、放射性测量和酶反应等，来检测探针与目标核酸之间的杂交情况。

2.3 核酸探针的设计核酸探针的设计需要考虑多个因素，包括目标序列的长度、杂交条件、标记方式等。

探针的长度应足够长以确保与目标序列的特异性结合，同时要避免与非目标序列的杂交。

此外，探针和目标序列的杂交温度、盐浓度等条件也需要进行优化。

3. 核酸探针的应用3.1 基因组学研究核酸探针在基因组学研究中扮演着重要角色。

通过使用特异性的核酸探针，可以对基因组进行定位、定序和变异等研究。

同时，核酸探针也可用于基因表达分析和基因功能研究，例如通过反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）技术检测目标基因的表达水平。

3.2 生物医学研究核酸探针可用于生物医学研究中的疾病诊断和治疗。

例如，在肿瘤学研究中，核酸探针可以用于检测肿瘤相关基因的异常改变，从而实现早期诊断和治疗监测。

此外，核酸探针还可用于检测病毒和细菌感染，诊断遗传性疾病等。

3.3 临床诊断核酸探针在临床诊断中有着广泛应用。

通过对特定的核酸序列进行检测，可以实现对疾病的早期筛查和诊断。

常见的应用包括艾滋病病毒检测、乙肝病毒检测、人类乳头瘤病毒（HPV）检测等。

核酸探针的应用具有高度特异性和灵敏性，可以提供准确的诊断结果。

4. 总结核酸探针作为一种重要的生物技术工具，具有广泛的应用前景。

简述核酸分子探针的分类和标记方法下载提示：该文档是本店铺精心编制而成的，希望大家下载后，能够帮助大家解决实际问题。

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原位杂交(In situ hybridization)一、目的掌握核酸探针原位杂交操作技术，并利用该技术对单细胞的靶目标进行定位，用于细胞生物学基础研究。

二、原理原位杂交技术（in situ hybridization）是分子生物学和组织化学成功结合的产物，是特定标记的已知序列核酸作为探针与细胞或组织切片中核酸进行杂交并对其实行检测的方法。

其基本原理是含互补序列的标记DNA或RNA片段，即探针，在适宜的条件下与细胞内特定的DNA或RNA形成稳定的杂交体。

原位杂交能在成分复杂的组织中进行单一细胞的研究而不受同一组织中其它成分的影响，因此对于那些细胞数量少且散在于其他组织中的细胞内DNA或RNA研究更为方便；由于原位杂交不需要从组织中提取核酸，对于组织中含量极低的靶序列有极高的敏感性，并可完整地保持组织与细胞的形态，更能准确地反映出组织细胞的相互关系及功能状态。

三、仪器设备烘箱，切片机，展片机，染色缸，湿盒，原位PCR仪，显微镜、镊子、量筒、烧杯、吸水纸、枪与枪头、载玻片、盖玻片、冰盒等。

四、材料和试剂1．材料：带有病原体的水生动物，如感染WSSV病毒的对虾、感染虹彩病毒的水生动物等。

2．试剂：Davidson’s AFA固定液:330 ml 95％乙醇220 ml 福尔马林（37～39％甲醛水溶液）115 ml 冰醋酸335 ml H2O混匀后封口，室温放置；DIG标记与检测试剂盒（Roche公司）；TNE：50 mmol/L Tris-HCl 6.57 g Tris Base10 mmol/L NaCl 0.58 g NaCl1 mmol/L EDTA 0.37 g EDTAddH2O 900 ml （定容至1L）用HCl调pH至7.4，高压灭菌，4℃保存；0.4% 甲醛：37～39％% 甲醛 5.4 mlddH2O 495 ml；蛋白酶K溶液(Pr.K，10 mg/ml)：10 mg Pr.K 溶于1 ml TNE中（用时现配）；20×SSC：3 mol/L NaCl 175.32 g NaCl0.3 mol/L柠檬酸钠88.23 g 柠檬酸钠ddH2O 900 ml （定容至1L）调pH至7.0，高压灭菌，4℃保存；2×SSC：20×SSC 100 mlddH2O 900 ml0.45 µm 滤膜过滤，4℃保存；20×Denhardt’s溶液：0.4％牛清血蛋白0.4 g牛清血蛋白0.4％聚蔗糖0.4 g聚蔗糖0.4％聚乙烯吡咯烷酮0.4 g聚乙烯吡咯烷酮ddH2O 100 ml0.45 µm 滤膜过滤，4℃保存；25％硫酸葡聚糖：25 g硫酸葡聚糖溶于80 ml ddH2O（定容至100 ml），-20℃保存；杂交液：4×SSC50% 甲酰胺1×Denhardt’s5% 硫酸葡聚糖0.5 mg/ml鲑精DNA4℃保存；BufferI：100 mmol/L Tris-HCl 12.11 g Tris Base150 mmol/L NaCl 8.77 g NaCl用HCl调pH至7.5，定容至1L，高压灭菌，4℃保存，；BufferII：0.5% Blocking agent 0.5 g Blocking agentBufferI 100 ml低温加热溶解，4℃保存一星期；BufferIII：100 mmol/L Tris-HCl 12.11 g Tris Base100 mmol/L NaCl 5.84 g NaCl50 mmol/L MgCl2 10.16 g MgCl2•6H2OddH2O 990 ml（定容至1L）用HCl调pH至9.5，0.45 µm 滤膜过滤，4℃保存；BufferIV：10 mmol/L Tris-HCl, pH8.0, 1 mmol/LEDTA；显色液（NBT/BCIP使用液）：20 µl NBT/BCIP + 1ml BufferIII。

核酸探针技术及应用基因检测技术的发展，使对某些疾病的诊断达到了特异性强、敏感性高及简便快速的目的。

近年来各种血清学方法发展很快，但血清学方法主要是测抗体，是间接的证据随着分子生物学的发展，应用DNA—DNA杂交建立了核酸探针(Probe)技术，该技术是目前基因检测最常用的方法，目前已成为诊断各种感染性疾病，恶性肿瘤，遗传病，检测抗生紊的耐药性，法医学鉴定及从分子水平上研究发病机制与流行病学规律等方面的一种重要手段。

本文主要介绍了核酸探针技术的原理，核酸分子杂交方法及核酸探针的应用等方面。

一、核酸探针技术的原理DNA 或RNA 片段能识别特定序列基因的DNA 片段，能与互补的核苷酸序列特异结合，这种用同位素非同位素标记的单链DNA片段即为核酸探针。

核酸探针技术是将双链DNA 经加热或硷处理，使硷基对间的氢链被破坏而变性，解开成两条互补的单链。

它们在一定温度和中性盐溶液条件下，又可按A—T，G—C碱基配对的原则重新组合成双链为复性。

这种重组合只是在两股DNA是互补(同源)或部分互补(部分同源)的条件下才能实现。

正是由于双链DNA的这种可解离与重组合的性质，才可用一条已知的单链DNA，用放射性同位素或其他方法标记后制备成核酸探针，与另一条固定在硝酸纤维素滤膜上的变性单链DNA进行杂交，(另一条DNA链与核酸探针是配对碱基，称为靶)再用放射自显影或其他显色技术检测，以确定有无与探针DNA (或RNA)同源或部分同源的DNA(或RNA)存在。

因为探针只与靶病原体的DNA或RNA杂交，而不与标本中存在的其他DNA 或RNA 杂交。

二、核酸探针技术的基本方法被检标本用去污剂和酶分解以去除非DNA成分或直接提取DNA，用各种方法处理DNA使其变性，把DNA双螺旋的两条链分开，单链DNA结合于固态基质上，(如滤膜)使其固定。

再加上已制备好的探针进行杂交，探针便可找出已固定的DNA中的互补序列，与之配对结合，然后洗掉未结合部分，由于探针已将放射性同位素掺入，再用x射线敏感的胶片自显影，见黑色影印者即为阳性。

临床分子生物学选择测试题含参考答案一、单选题（共80题，每题1分，共80分）1、单链构象特异性是A、RFLPB、ASΟC、SSCPD、RT-PCRE、bDNA正确答案：C2、SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳具有A、分子筛效应B、电荷效应C、电渗效应D、浓缩效应E、稀释效应正确答案：A3、用于个体识别最常用的分子生物标志物是A、RFLPB、SNPsC、VNTRD、CNVsE、基因突变正确答案：C4、由线粒体基因编码的ATP酶亚基数目有A、1个B、2个C、7个D、3个E、13个正确答案：B5、关于肿瘤分子诊断的说法正确的是A、肿瘤的分子诊断中根据目的、对象、类型的不同要采取相似的诊断策略与方法B、肿瘤分子诊断就是利用分子生物学原理和技术建立的肿瘤诊断方法C、肿瘤分子诊断的研究成果仅用于临床肿瘤的诊断D、肿瘤分子诊断的核心是基于细胞水平的分子诊断技术E、肿瘤分子诊断的含义主要表现在虽然检测对象众多，但大多数标志物是特异性的肿瘤标志物正确答案：B6、PGS诊断方法主要借助于下列何种技术A、PCRB、CGHC、PGHD、FISHE、基因芯片正确答案：D7、不属于脆性X综合征分子诊断人群的是A、有FraX体格或性格阳性征象者B、没有FraX家族史C、发育迟缓或自闭症的患者D、未诊断的MR家族史E、已明确母亲为携带者的婴儿正确答案：B8、结核分枝杆菌耐呲嗪酰胺的突变基因是A、rrs与rpsLB、pncAC、embBD、gyrAE、rpoB正确答案：B9、BRCA1基因定位于人哪个染色体上A、染色体11q24B、染色体1p32C、染色体9p21D、染色体2p32E、染色体17q21正确答案：E10、Cpn感染的早期诊断需借助于A、病原体分离培养B、血清学检测C、分子生物学检査D、直接涂片镜检E、常规墨汁染色正确答案：C11、结核分枝杆菌耐乙胺丁醇的突变基因是A、rrs与rpsLB、pncAC、embBD、gyrAE、rpoB正确答案：C12、关于APC基因说法不正确的是A、是一种抑癌基因B、定位于染色体5q21上C、通过编码APC蛋白发挥作用D、APC蛋白在细胞周期进程、细胞生长调控及维持自身稳定中起着重要作用E、APC基因在肿瘤发生发展的全过程中并不稳定正确答案：E13、下列何种技术不可用于PGDA、微卫星DNA序列B、变性高效液相色谱分析法C、基因芯片D、基因测序E、Sourthem blot正确答案：E14、关于DNA变性的描述不正确的是A、二级结构破坏B、一级结构破坏C、黏度降低D、生物活性丧失E、浮力密度增加正确答案：B15、HIV-1中最易发生变异的基因是A、envB、polC、tatD、nefE、gag正确答案：A16、关于FISH在白血病的应用中说法正确的是A、主要用于白血病的初诊和复发的检测B、只适用于体液、组织切片标本C、FISH只能检测处于分裂中期的细胞D、FISH的灵敏度高于PCRE、FISH是检测融合基因、确定染色体易位的首选方法正确答案：A17、可以用来检测具有生物活性的蛋白质是A、mative PAGEB、SDS-PAGEC、2-DED、IEFE、Western blotting正确答案：A18、PCR的延伸温度一般为A、94〜95℃B、55℃左右C、75〜80℃D、72℃E、25℃正确答案：D19、检测MELAS综合征、线粒体糖尿病mtDNA突变位点tRNALeu(UUR)，A3243G常用的限制性内切酶是A、BsmAⅠB、MaeⅢC、SsaHⅠD、MvaⅠE、ApaⅠ正确答案：E20、下列符合解脲脲原体基因组结构特征的是A、基因组大于肺炎支原体基因组B、UU为环状染色体C、终止密码子UGA编码赖氨酸D、完全遵循遗传密码的通用性E、G+C含量丰富正确答案：B21、最早发现的Leber遗传性视神经病变mtDNA突变是A、ND1G3460AB、AO4G11778AC、nD6T14484CD、tRNAMetA4435GE、tRNThrAlSQSlG正确答案：B22、提高移植存活率的方法以下不可行的是A、HLA配型B、mH的鉴定C、ABΟ血型鉴定D、移植前输入补体和抗体E、移植前应用免疫抑制剂正确答案：D23、血友病A缺乏的是能够编码血浆凝血活酶的A、FⅧ因子B、FⅨ因子C、FⅪ因子D、FⅩ因子E、FⅣ因子正确答案：A24、基因组中含有线粒体DNA的是A、白假丝酵母菌B、新生隐球菌C、梅毒螺旋体D、沙眼衣原体E、弓形虫正确答案：E25、32p的半衰期是A、8.07天B、67.48天C、14.26天D、5730年E、60.20天正确答案：C26、关于非放射性探针标记，下列描述不正确的是A、灵敏度不如放射性探针B、目前应用的非放射性标志物都是抗原C、对人体危害小D、酶促显色检测最常使用的酶是碱性磷酸酶和辣根过氧化物酶E、可长时间使用正确答案：B27、采用PCR-RFLP检测mtDNA A3243G常用的限制性内切酶是A、BsmAⅠB、ApaⅠC、XbaⅠD、BamHⅠE、KpnⅠ正确答案：B28、能够将蛋白质的分离、纯化、酶解和鉴定等步骤结合在一起的技术是A、2-DEB、ESIC、缩微芯片D、蛋白质功能芯片E、ICAT正确答案：C29、下列DNA序列中的胞嗟嚏易发生甲基化修饰的是A、5'-CCCCCT-3'B、5'-GGGGCC-3'C、5'-CGCGCG-3'D、5'-GCACAC-3'E、5'-CTCTCCC-3'正确答案：C30、细胞周期检查点激酶1基因定位于哪个染色体上A、5q21B、2p32C、4q11-12D、11q24E、1p32正确答案：D31、DHPLC检测要求样品片段大小范围是A、<200bpB、>500bpC、200～500bpD、300〜600bpE、100～300bp正确答案：C32、首个被确定的肿瘤抑制基因是A、p21B、p53C、RbD、CyclinE、p16正确答案：C33、微流控芯片技术的主要特点是A、灵敏度高、耗时短、高通量、可定量、标本需求量少、样本来源广泛B、液体流动可控、标本需求量少、分析速度快、整体微型化、自动化、集成化C、选择性高、分析速度快、操作简易、仪器价格低廉D、分离效率髙、分析速度快、分离模式多、标本需求量少、应用广、可自动化E、灵敏度高、准确度高、特异性强、高通量、可自动化、可绝对定量正确答案：B34、DNA P基因可发生YMDD突变的病毒是A、HCVB、HIVC、HBVD、HPVE、流感病毒正确答案：C35、重复序列通常只有1〜6bp，重复10-60次并呈高度多态性的DNA序列称为A、微卫星DNAB、小卫星DNAC、cDNAD、高度重复顺序DNAE、单拷贝顺序DNA正确答案：B36、目前基于MALDI-TOF-MS进行细菌鉴定的主要标志物是A、16SrRNAB、IS6110C、katGD、特异性保守蛋白-核糖体蛋白E、丰度较高的管家基因正确答案：D37、容易造成“负染”的封闭剂是A、HRPB、脱脂奶粉C、血红蛋白D、SDSE、DTT正确答案：C38、不适宜于直接作为第一代测序技术测序的DNA模板是A、双链DNA片段和PCR产物B、单链DNA片段C、克隆于质粒载体的DNA片段D、克隆于真核载体的DNA片段E、提取的染色质DNA正确答案：E39、淋病奈瑟菌耐青霉素的分子机制与以下哪组基因有关A、katG和inhAB、gyrA和parCC、penA和ponAD、gyrA和gyrBE、rrs和rpsL正确答案：C40、可作为器官移植中供受体是否匹配的配型分子是A、HLAB、单拷贝序列C、高表达蛋白D、RFLPE、染色体正确答案：A41、下列哪种病毒在复制过程中可产生RNA-DNA杂交体A、HIVB、HPVC、HBVD、HCVE、流感病毒正确答案：A42、TaqMan探针技术要求扩增片段应在A、250〜300bpB、200〜250bpC、150〜200bpD、300～350bpE、50〜150bp正确答案：E43、MALDI分析生物大分子的过程中，下列不是一个合适基质应具备的是A、吸收能量B、使生物大分子彼此分离C、使被分析的生物大分子离子化D、基质分子与被分析物质间的摩尔比为100:1～50000:1E、烷基化蛋白质所带的自由筑基正确答案：E44、可负性调控抗凋亡基因BCL2的miRNA是A、miR-155B、miR-15a和miR-16-1C、miR-221D、miR-155E、miR-17-92正确答案：B45、关于定量PCR的描述，不正确的是A、可以定量或半定量PCR产物的方法B、定量PCR主要进行基因表达的分析和病原体的核酸检测C、水解探针技术中TaqMan探针的位置位于两条引物之间D、分子信标在自由状态下为发夹结构，荧光信号极低E、定量PCR在封闭状态下进行，有效避免了产物的实验室污染正确答案：A46、存在于浆液性卵巢癌而不存在于黏液性卵巢癌中的是A、CA72-4B、CA12-5C、CA24-2D、CA15-3E、NSE正确答案：B47、下列叙述不正确的是A、F质粒的主要特征是带有耐药性基因B、R质粒又称抗药性质粒C、CoI质粒可产生大肠杆菌素D、F质粒是一种游离基因E、F和CoIE1质粒可以在同一菌株内稳定共存正确答案：A48、T-ALL中最常见的活化癌基因是A、N-rasB、NOTCH1C、NPMD、FLT3E、C-KIT正确答案：B49、组织DNA提取中，EDTA的作用是A、抑制DNaseB、沉淀DNAC、减少液体表面张力D、抑制RNaseE、去除蛋白质正确答案：A50、下列不属于基因突变的类型是A、等位基因B、插入C、同义突变D、无义突变E、错义突变正确答案：A51、引起线粒体糖尿病、MELAS综合征、综合征耳聋的突变位点是A、C3254AB、T3271CC、A1555GD、A3243GE、T3271C正确答案：D52、检测靶分子是DNA的技术是A、Southern印迹杂交B、Western印迹杂交C、Northern印迹杂交D、Eastern印迹杂交E、杂交淋巴瘤正确答案：A53、PCR中的脱氧核昔三磷酸不包括A、dATPB、dTTPC、dCTPD、dGTPE、dUTP正确答案：E54、SELDI-TOF-MS中，质荷比越大的离子在电场中飞行的时间A、越短B、越长C、与质荷比小的离子没有差异D、无法计算E、无法分离正确答案：B55、G-6-PD缺乏时导致机体下列哪些物质增多(↑)或减少(↓)A、H2O2、GSH和NADPH↑B、H2O2和GSH↑，NADPH↓C、H2O2↑，GSH和NADPH↓D、GSH和NADPH↑，H2O2↓E、H2O2和NADPH↑，GSH↓正确答案：C56、启动子预测分析常涉及A、核心启动子，如TATA盒等元件B、近端启动子，如几个调控元件C、远端启动子，如增强子、沉默子等元件D、基因内部区域的特征，如GC含量、CpG比率E、转录因子结合位点正确答案：D57、镰状细胞贫血患者，代替其血红蛋白β链N端第六个氨基酸残基谷氨酸的是A、丙氨酸B、酪氨酸C、苯丙氨酸D、丝氨酸E、缬氨酸正确答案：E58、DCC基因突变的主要方式不包括A、等位基因杂合性缺失B、5'端纯合性缺失C、3'端纯合性缺失D、DCC基因过甲基化E、外显子的点突变正确答案：C59、上述检测方法中，不可用于对核酸片段突变的检测方法是A、基因测序B、Southern blotC、Western blotD、PCRE、RFLP正确答案：C60、关于RNA探针的描述下列不正确的是A、可用于随机引物标记B、特异性高C、灵敏度高D、可用非同位素标记法标记E、不易降解正确答案：E61、某人核型为46，XY，性腺为睾丸，内外生殖器呈间性，第二性征异常，说明此人为何种患者A、男性假两性畸形B、性逆转综合征C、女性假两性畸形D、性腺发育不全E、真两性畸形正确答案：A62、转座因子是A、质粒B、类核结构C、断裂基因D、可移动基因成分E、基因重叠现象正确答案：D63、作为芯片固相载体的材料描述正确是A、主要有玻片、硅片等实性材料B、不使用硝酸纤维素膜、尼龙膜及聚丙烯膜等膜性材料C、这些载体材料不需要处理，其表面存在活性基团(如羟基或者氨基)D、可以直接固定已经合成的寡核甘酸探针E、不需要对介质表面进行化学预处理——活化正确答案：A64、异种移植的首要障碍是A、超急性排斥反应B、器官大小和功能的匹配C、伦理道德问题D、供器官来源的选择E、人畜共患病正确答案：A65、基因多态性连锁分析中，第一、二、三代遗传标记分别是A、RFLP、SSCP、STRB、RFLP、SNP、STRC、RFLP、STR、SNPD、VNTR、SCCP、SNPE、VNTR、STR、RFLP正确答案：C66、关于mtDNA非编码序列，描述正确的是A、不参与mtDNA的复制、转录等，属“无用”信息B、是高度重复序列C、占整个mtDNA的15%，比例较大D、mtDNA中有两段非编码区E、位于mtDNA的轻链正确答案：D67、关于随机克隆法或称鸟枪法测序策略的叙述不准确的是A、可用于各种大型的测序计划B、是一种完全定向的测序策略C、需将目的DNA大片段随机切割成小片段，并分别进行亚克隆D、可利用通用引物测定亚克隆的序列E、一些区段往往被重复测定正确答案：B68、某临床分子生物学检验项目每2周检测1次，最适用的统计学质控方法是A、Levey-Jennings质控图方法B、6 Sigma质控方法C、Westgard多规则质控方法D、即刻法质控方法E、累积和质控方法正确答案：D69、阳性质控品失控的原因不包括A、扩增产物污染B、核酸提取试剂失效C、扩增仪孔间温度不一致D、Taq酶失活E、提取的核酸残留有抑制物正确答案：A70、构成完整的病毒颗粒的成分是A、核酸B、结构蛋白C、蛋白质与核酸D、糖蛋白E、蛋白质正确答案：C71、最常用的DNA探针标记方法是A、随机引物标记B、切口平移标记C、3'-末端标记D、5'-末端标记E、PCR法正确答案：A72、不仅可以检测DNA样品中是否存在某一特定的基因，而且还可以获得基因片段的大小及酶切位点分布信息的是A、点/狭缝杂交B、菌落杂交C、Southern印迹杂交D、Northern印迹杂交E、原位杂交正确答案：C73、将能识别靶多肽高度特异性的配体放置在芯片上进行检测的是A、蛋白质功能芯片B、缩微芯片C、化学型芯片D、生物化学芯片E、蛋白质检测芯片正确答案：E74、以下不符合沙眼衣原体基因组结构特征的是A、CT染色体为一闭合环状双链DNAB、CT有一个隐蔽性质粒，此质粒与其他生物间没有同源序列C、DNA修复能力较弱D、CT原体和网状体内皆含有DNA和RNA两种核酸E、G+C含量小于A+T正确答案：C75、线粒体基因组编码几种rRNAA、22种B、20种C、18种D、3种E、2种正确答案：E76、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理不正确的是A、SDS是一种阴离子去污剂B、SDS可以与蛋白质的疏水部分相结合，从而使蛋白质获得负电荷C、SDS-PAGE时蛋白质的迁移率与分子大小相关D、SDS-PAGE使具有不同等电点的蛋白质得以分离E、SDS与蛋白质结合后可以屏蔽天然蛋白质的电荷正确答案：D77、用于病毒基因突变检测的技术是A、荧光定量PCR技术B、PCR-RFLP技术C、PCR微卫星检测技术D、原位杂交技术E、cDNA表达芯片技术正确答案：B78、荧光定量PCR检测核酸量的时间段在A、非指数期B、PCR反应的最初阶段C、PCR反应最后的时间段D、指数期的起始阶段E、指数期的终末阶段正确答案：D79、第一个被发现可以预测晚期转移性结直肠癌患者是否能从靶向治疗药物西妥昔单抗中获益的生物标志物是A、K-rasB、EGFR基因C、TTF-1D、CEAE、bcl-2基因正确答案：A80、可用于转录组学筛选分子生物标志物研究的技术方法是A、SAGEB、GWASC、2D-PAGED、GC-MSE、Southern印迹杂交正确答案：A。

地高辛标记核酸探针的标记方法地高辛标记核酸探针的标记方法核酸探针已被广泛用于筛选重组克隆、基因多样性的种性检测和真菌种群内及种群之间的系统发育关系评价。

最早使用的放射性同位素标记核酸探针具有敏感性高、特异性好、分辨力强的特点，但放射性同位素标记也存在着一系列令人困扰的问题,如成本高、探针半衰期短、放射性物质危害人体健康等。

而且在进行放射性同位素标记实验时,需要有专门的实验室及相应的实验保护设施，还需要由经过培训的专业人员来操作,因而限制了在普通实验室进行分子生物学实验。

近几年发展起来的非放射性核酸探针大多通过酶促、光化学和化学手段掺入一种报道基团,这种报道基团可通过高灵敏度的冷光、荧光或金属沉淀等检测系统检测。

另外,应用pH电极或感应器技术的电化学检测系统也有报道。

在这些检测系统中,灵敏度最高的是生物素- 亲合素检测系统和半抗原-抗半抗原地高辛检测系统。

由于生物样品中常含有内源性生物素及生物结合蛋白，生物素标记的核酸探针会发生一些非特异性结合，从而影响实验效果。

与生物素-亲合素系统同样具有高灵敏度，却减少了非特异性结合的地高辛检测系统，已为人们所接受,并得到广泛的应用。

地高辛(Digoxigenin ,DIG) 又称异羟基洋地黄毒甙元，是一种类固醇半抗原分子。

其化学结构如图1 所示。

采用人工方法可以将地高辛的线型间隔臂与dUTP 连接起来,形成DIG-11-dUTP，通过随机引物法或PCR法将其掺入到DNA探针中。

RNA探针的标记是使用噬菌体信息编码的RNA聚合酶，通过体外转录将DIG-11-dUTP掺入到RNA探针中。

寡核苷酸探针的标记则是通过末端转移酶催化，在3,末端加上DIG-11-dUTP/dATP 或DIG-11-ddUTP 尾巴。

对于目的DNA 或RNA 来说，分子杂交后,杂交部分可通过ELISA 实验程序加以检测，即加入一种结合有碱性磷酸酶的地高辛-特异性抗体，它与地高辛半抗原分子形成酶联抗体-半抗原(DIG) 复合物，再加入相应的显色底物，使杂交部分得以显示。

.第二章核酸杂交技术（一）名词解释1．原位杂交2．核酸分子杂交技术3．探针4．反向点杂交5．缺口平移标记法6．随机引物标记法7．末端标记法8．Southern blot杂交9．荧光原位杂交10．菌落杂交（二）选择题【A型题】1．DNA链的Tm值主要取决于核酸分子的（）A G－C含量B A－T含量C A－G含量D A－C含量E T－G含量2．液相杂交是下列哪一种（）A Southem印迹杂交B Northem印迹杂交C Dot印迹杂交D Slot印迹杂交E RPA实验3．研究得最早的核酸分子杂交种类是（）A 菌落杂交B Southern杂交C Northern杂交D 液相杂交E 原位杂交4．Southern杂交通常是指（）A DNA和RNA杂交B DNA和DNA杂交C RNA和RNA杂交D 蛋白质和蛋白质杂交E DNA和蛋白质杂交5．最容易降解的核酸探针是( )A cDNA探针B dsDNA探针C ssDNA探针D gDNA探针E: RNA6．探针基因芯片技术的本质就是（）A 核酸分子杂交技术B 蛋白质分子杂交技术C 聚合酶链反应技术D 基因重组技术E 酶切技术7．DNA探针的长度通常为( )A 1000 ～ 2000个碱基B 500 ～ 1000个碱基C 400 ～ 500个碱基D 100 ～ 400个碱基E. <100个碱基8．寡核苷酸探针的最大的优势是（）A 杂化分子稳定B 可以区分仅仅一个碱基差别的靶序列C 易标记D 易合成E 易分解9．在Southern印迹中常用的核酸变性剂是( ) A 甲醛B 乙醛C 氢氧化钠D 碳酸钠E 盐酸10．盐酸硝酸纤维素膜最大的优点是（）A 脆性大B 本底低C 共价键结合D 非共价键结合E 高结合力11．最常用的DNA探针标记方法是( )A 随机引物B 切口平移C 3′ -末端标记D 5′ -末端标记E PCR法12．为了除去探针，重复使用滤膜，以下哪种情况不可以发生（）A 探针在预杂交与除去探针之间的过程中曾经干燥过B 探针在预杂交与除去探针之间的过程中曾经湿润过C 探针在预杂交与除去探针之间的过程中曾经温浴过D 探针在预杂交与除去探针之间的过程中曾经漂洗过E 探针在预杂交与除去探针之间的过程中曾经标记过13．5′一末端的DNA探针标记主要依靠的酶是( )A T4多聚核苷酸激酶B 末端转移酶C AKPD DNA polⅡE DNA pol14．血友病是一种（）A 染色体病B X连锁遗传病C 先天性代谢缺陷病D 先天畸形E 常染色体隠性遗传病15．预杂交中最常用的封闭剂是( )A Denhavdt's溶液B 5×TBEC 1×TBED 1×TAEE 1×TPE16．检测目标是RNA的技术是（）A Southern杂交B Western杂交C Northern杂交D Eastern杂交E 杂交淋巴瘤17．检测靶序列是DNA的技术是（）A Southern杂交B Western杂交C Northern杂交D Eastern杂交E 杂交淋巴瘤18．DNA双螺旋之间氢键断裂，双螺旋解开，DNA 分子成为单链，这一过程称（）A 变性B 复性C 复杂性D 杂交E 探针19．具有碱基互补区域的单链又可以重新结合形成双链，这一过程称（）A 变性B 复性C 复杂性D 杂交E 探针20．一种标记核酸与另一种核酸单链进行配对形成异源核酸分子的双链，这一过程称（）A 变性B 复性C 复杂性D 杂交E 探针21．点/狭缝杂交可以用于（）A 快速确定是否存在目的基因B 不仅可以检测DNA样品中是否存在某一特定的基因，而且还可以获得基因片段的大小及酶切位点分布的信息C 用于基因定位分析D 阳性菌落的筛选E 蛋白水平的检测22．放射自显影时反射光产生的潜影在低温下较稳定，最适温度是( )A -70℃B -30℃C -20℃D -10℃E 4℃23．Southern印迹杂交可以用于（）A 不仅可以检测DNA样品中是否存在某一特定的基因，而且还可以获得基因片段的大小及酶切位点分布的信息B 检测的目标是RNAC 用于基因定位分析D 阳性菌落的筛选E 蛋白水平的检测24．寡核苷酸探针的Tm简单计算公式为( )A Tm=4(G+C)+2(A+T)B Tm=2(G+C)+4(A+T)C Tm=6(G+C)+4(A+T)D Tm=2(G+C)+6(A+T)E Tm=6(G+C)+2(A+T)25．Northern印迹杂交可以用于（）A 快速确定是否存在目的基因B 不仅可以检测DNA样品中是否存在某一特定的基因，而且还可以获得基因片段的大小及酶切位点分布的信息C 检测的目标是RNAD 用于基因定位分析E 阳性菌落的筛选2626．荧光原位杂交可以用于（）A 快速确定是否存在目的基因B 检测的目标是RNAC 用于基因定位分析D 阳性菌落的筛选E 蛋白水平的检测27．以等位基因特异的寡核苷酸探针杂交法诊断某常染色体隐性遗传病时，若能与突变探针及正常探针接合，则该样本为（）A 正常人B 杂合体患者C 纯合体患者D 携带者E 不能确定28．在pH为下述何种范围时，Tm值变化不明显( )A pH为3～5B pH为4～5C pH为5～6D pH为5～9E pH为8～1129．一般来说，设计的寡核苷酸探针的长度为（）A 2-10bpB 17-50bpC 60-100bpD 100-200bpE 200-300bp30．变性剂可使核酸的Tm值降低，常用的变性剂是( )A 甲酰胺B 氢氧化钠C 浓盐酸D 稀盐酸E 甲醇31．下列有关cDNA探针的描述不正确的为（）A 利用mRNA通过RT-PCR在体外反转录可制备大量的cDNA探针B cDNA探针不包含内含子C cDNA探针不包含大量的高度重复序列D 由于cDNA探针自身所携带的poly（dT），有可能产生非特异性杂交的问题E cDNA探针合成方便，成为探针的重要来源32．一般来说核酸杂交的温度低于其Tm值的多少度进行( )A 15～25℃B 10～15℃C 5～10℃D 30～40℃E 40～50℃33．对于寡核苷酸探针，杂交温度一般般低于其Tm 值( )A 30～40℃B 20～30℃C 15～30℃D 10～15℃E 5℃34．一般情况下，不含变性剂甲酰胺时，杂交反应常在多少℃下进行( )A 90B 80C 75D 68E 5835．在含50%甲酰胺时，杂交反应在多少℃进行( )A 70B 65C 55D 42E 3536．杂交时的温度与错配率有关，错配率每增加1%，则Tm值下降( )A 0.5℃B 1～1.5℃C 2～2.5℃D 3～3. S℃E 4～4.5℃37．RNA/RNA的杂交体的Tm值一般应增加( )A 1～5℃B 5～10℃C 10～15℃D 15～20℃E 20～25℃38．杂交的时间一般为Cot1/2的( )A l倍B 1～3倍C 3 ～5倍D 5～8倍E 10倍以上39．为封闭非特异性杂交位点，可在预杂交液中加入( )A ssDNAB 1×SSCC 10×SSCD 5×TBECE 50×TAE40．随机引物法标记探针常用的A、G、C、T聚合体的数目是( )A 4个B 6个C 8个D 10个E 12个【X型题】41．下列哪些是影响DNA复性的因素( )A DNA浓度B DNA的分子量C 温度D 碱基组成E DNA的来源42． DNA探针的优点有（）A 制备方法简单B DNA探针易降解C DNA探针的标记方法成熟，有多种方法可以选择D 克隆在质粒载体中，可以无限繁殖，取之不尽E 单链，不存在竞争性的自身复性43．以下哪些方法可以用于探针的全程标记（）A DNA加尾法B DNA切口平移标记法C 随机引物标记法D 末端标记E 尾端标记44．关于DNA变性的描述正确的是( )A 二级结构破B 一级结构破坏C 黏度降低D 生物活性丧失E 浮力密度增加45．以下哪些因素可以使DNA变性（）A 增加溶液的浓度B 加热C 改变溶液的pH值D 有机溶剂E 冷藏46．预杂交中，下列能起封闭作用的是( )A ssDNAB BSAC 小牛胸腺DNAD 脱脂奶粉E DTT47．变性的DNA会发生哪些理化性质的变化（）A 粘度下降B 沉降速度增加C 浮力下降D 紫外光吸收增加E 紫外光吸收减少48.下列物质适于非放射性探针标记的是( )A AKPB ACPC 生物素D 地高辛E 荧光素49．关于人工合成的寡核苷酸探针，下列描述正确的是( )A 特异性高B 可依赖氨基酸序列推测其序列C 分子量小D 可用于相似基因顺序差异性分析E 可用末端转移酶进行5′端标记50．通过哪些措施可以提高杂交反应的速度（）A 采用大片段探针B 少量的反应体积C 高反应温度D 不断的振摇E 大量的反应体积51．关于切口平移法下述正确的是( )A 可标记线性DNAB 可标记松散螺旋DNAC 可标记超螺旋DNAD 可标记存在缺口的双链DNAE 可标记随机引物52．以下哪些方法可以用于从凝胶上转移DNA（）A 毛细转移B 真空转移C 负压转移D 电泳转移E 冷冻转移53．关于随机引物法标记探针下述正确的是( )A 可标记单链DNAB 可标记双链RNAC 可标记单链RNAD 比活性高达108cpm／µg DNA以上E 常经过SephadexG-50纯化才可使用54．可以采用哪些方法来标记探针（）A 杂交标记法B 切口平移标记法C 5’-末端的标记D 3’-末端的标记E 化学法延长标记55．整个杂交反应主要以下哪些步骤组成（）A 预杂交B 杂交C 洗脱D 固定E 转移56．放射自显影可以被分为（）A 直接放射自显影B 氧化显影C 封闭显影D 间接放射自显影E 固定显影57．关于电转移下列描述正确的是( )A 快速、高效B 需要特殊设备C 缓冲液用TAE或TBED 可产生高温E 常用NC膜作为支持介质58．预杂交的主要目的是（）A 平衡滤膜B 封闭非特异性杂交的位置C 提高杂交信号的检测效率D 便于从滤膜上除去探针E 清除用于杂交反应检测的显色物质59.关于非放射性探针标记，下列描述正确的是( )A 对人体危害小B 需要特殊设备C 可长时间使用D 灵敏度不如放射性探针E 重新杂交新探比较容易60．对于改变DNA片段长度的突变，可以由于缺失或插入产生，或由于限制性酶切位点改变而导致限制性片段长度改变。

1．核素标记物放射性核素是目前应用最多的一类探针标记物。

放射性核素的灵敏度极高，可以检测到10-14～10-18克的物质，在最适条件下可以测出样品中少于1000个分子的核酸含量。

常用标记核酸探针的核素有32P、3H、35S，在Southern印迹杂交中以“P最常用。

还应根据标记方法的不同选择相应标记方位的核素，一般情况下，大多数标记方法需要的是a—32P，而5，末端标记必须是r-32P。

2．非放射性标记物多年来，科学家们致力于寻找一些安全、可靠、灵敏度高的物质代替放射性核素用于核酸分子杂交，并取得了一定的进展，部分非放射性标记物已在国内外逐步推广使用。

其优点是无放射性污染，可以较长时间存放，从而更便于临床诊断等方面的应用。

但此类非放射性标记物的缺点是灵敏度及特异性都不太高。

根据其检测方法，非核素标记物可分为以下4类。

(1)半抗原：生物素(biotin)和地高辛(DIG)都是半抗原，可以利用这些半抗原的抗体进行免疫学检测，根据显色反应检测杂交信号。

这两种物质是目前使用较普遍的非核素标记物。

(2)配体：生物素不仅是半抗原，故可用生物素与亲和素反应进行杂交信号的检测。

(3)荧光素：如FITC、罗丹明类等，可以发出紫荧光进行观察，主要适用于细胞原位杂交。

(4)化学发光探针：一些标记物可与某种物质反应产生化学发光现象，通过化学发光可以像核素一样直接使X线胶片上的乳胶颗粒感光。

化学发光探针可能是今后非核素标记物研究的主要方向。

三、标记方法体内标记法：将核素标记的化合物作为合成代谢的底物，在细胞合成代谢时使核素掺入到新合成的核酸分子中，如3H-胸苷可掺入到DNA中，3H-尿苷可掺入到RNA中体外标记法：化学标记法：标记物分子上的活性基因与探针分子上的某些基因反应，标记物直接结合到探针分子上酶促标记法：标记物预先标记核苷酸，然后利用酶促法将标记的核苷酸掺入到探针上酶促标记法(一)切口平移法(nick translation)1、利用DNaseI在DNA双链上造成单链切口2、利用大肠杆菌DNA聚合酶I的5′→3′核酸外切酶活性在切口处将旧链从5′末端逐步切除3、在DNA聚合酶I的5′→3′聚合酶催化下，以互补的DNA单链为模板依次将dNTP 连接到切口的3′末端-OH上，合成新的DNA链，同时将标记的核苷酸掺入到新的DNA 链中(二) 随机引物法其原理是随机引物能与各种单链DNA模板结合，作为合成新链的引物，在DNA聚合酶的催化下，按5′→3′方向合成一新的DNA链，其核苷酸序列与模板DNA完全互补。

生物素标记核酸方法引言：生物素标记核酸方法是一种常用的实验技术，通过将生物素与核酸分子结合，可以追踪和检测特定的核酸序列。

本文将介绍生物素标记核酸的原理、方法以及应用领域。

一、原理生物素是一种小分子有机物，具有很强的亲和力。

生物素标记核酸方法利用生物素与亲和剂亲和结合的特性，将生物素连接到核酸分子上。

通常采用二亚甲基双亲和剂（EDC）或过氧化物酶（H2O2）等化学试剂进行反应，将生物素共价地连接到核酸分子上。

二、方法1. 生物素标记DNA方法（1）制备DNA探针：将需要标记的DNA序列与生物素探针连接，通常采用连接试剂进行反应，生成生物素标记的DNA探针。

（2）标记DNA探针：将连接了生物素的DNA探针与目标DNA 序列进行杂交反应，使生物素与目标DNA结合。

（3）检测信号：通过酶标法、荧光染料或放射性同位素等方法，将生物素标记的DNA探针检测出来。

2. 生物素标记RNA方法（1）制备RNA探针：将需要标记的RNA序列与生物素探针连接，通常采用连接试剂进行反应，生成生物素标记的RNA探针。

（2）标记RNA探针：将连接了生物素的RNA探针与目标RNA序列进行杂交反应，使生物素与目标RNA结合。

（3）检测信号：通过酶标法、荧光染料或放射性同位素等方法，将生物素标记的RNA探针检测出来。

三、应用领域1. 基因表达分析：生物素标记核酸方法可以用于研究基因的表达水平，通过标记mRNA或miRNA等核酸分子，可以检测它们在细胞或组织中的表达情况。

2. 分子诊断：生物素标记核酸方法可以用于检测病原体的核酸序列，如病毒、细菌等，用于疾病的诊断和监测。

3. 分子遗传学研究：生物素标记核酸方法可以用于研究基因的遗传变异、突变等，从而揭示基因与表型之间的关系。

4. 蛋白质相互作用研究：生物素标记核酸方法可以用于研究蛋白质与核酸的相互作用，通过标记DNA或RNA分子，可以检测它们与特定蛋白质的结合情况。

结论：生物素标记核酸方法是一种重要的实验技术，可以用于追踪和检测特定的核酸序列。