酶联免疫法(ELISA)测定植物激素含量

植物激素的酶联免疫吸附测定法（ELISA）免疫测定是利用抗原、抗体特异性反应而建立的，根据可视化方法的不同可分为：酶联免疫、放射免疫、荧光免疫、化学发光免疫测定、生物发光免疫测定、浊度免疫测定法等。

由于酶联免疫吸附分析法（Enzyme-linked Immunosorbent Assays, 简称ELISA）具有灵敏性、特异性高，且方便、快速、安全、成本低廉的特点，而日益被广泛应用于植物激素测定。

目前，几大类植物激素IAA,ABA, GA3、GA4、iPA、ZR、DHZR等都建立了相应的ELISA方法并有试剂盒出售。

植物激素的酶联免疫检测方法有两种形式（见下图），一种是在固相载体上直接包被抗体（直接法，先包被二抗，再加一抗），另一种是包被抗原（间接法）。

直接法利用游离抗原和酶标抗原与吸附的抗体进行竞争。

间接法利用游离抗原和吸附抗原与游离抗体进行竞争。

间接法的原理可用下式表示：Ab+H+HP=AbH+AbHP其中Ab表示抗体，H表示游离激素，HP表示吸附在板上的激素－蛋白质复合物。

根据质量作用定律，当该反应体系中Ab及HP的量确定时，游离H越多，结合物AbH形成的就越多，而AbHP形成的就越少，即结合在板上的抗体就越少，通过酶标二抗检测结合物AbHP的多少，就可以确定游离H 量的多少。

材料、试剂及设备1 材料各种新鲜植物材料2 仪器设备研钵，冷冻离心机，台式快速离心浓缩干燥器或氮气吹干装置，酶联免疫分光光度计，吸水纸，恒温箱，冰箱，酶标板（40孔或96孔），可调微量液体加样器（10μl，40μl,200μl,1000μl），带盖瓷盘（内铺湿纱布）。

3 试剂(1) 包被缓冲液：称取１.５g Na2CO3, 2.93g NaHCO3, 0.2g NaN3（可不加）, 用量筒加1 000 ml蒸馏水，pH为9.6.(2) 磷酸盐缓冲液（PBS）：称取8.0g NaCl, 0.2g KH2PO4 , 2.96g Na2HPO4 ·12H2O，用量筒加1 000 ml蒸馏水，pH为7.5。

植物激素的测定方法植物激素是一类由植物自身合成并参与生长发育调控的活性物质，对植物的生长发育起着重要作用。

因此，准确测定植物激素的含量对于研究植物生长发育调控机制具有重要意义。

本文将介绍几种常用的植物激素测定方法。

一、高效液相色谱法（HPLC）高效液相色谱法是目前应用最广泛的植物激素测定方法之一。

该方法基于植物激素在高效液相色谱柱上的保留时间和峰面积，通过与已知浓度的标准品比较，可以计算出待测样品中植物激素的含量。

高效液相色谱法具有分离效果好、分析速度快、准确度高的优点，但需要专用的仪器设备，操作较为复杂。

二、气相色谱法（GC）气相色谱法是另一种常用的植物激素测定方法。

该方法通过将待测样品中的植物激素转化为易挥发的衍生物，然后在气相色谱柱上进行分离和定量分析。

气相色谱法具有测定灵敏度高、分离效果好的特点，但需要对样品进行预处理，并且对仪器的稳定性要求较高。

三、酶联免疫吸附法（ELISA）酶联免疫吸附法是一种常用的免疫学测定方法，也可以用于测定植物激素的含量。

该方法通过将植物激素与特异性抗体结合，然后再用酶标记的二抗进行检测，最后通过比色反应或发光反应来测定植物激素的含量。

酶联免疫吸附法具有操作简便、成本较低的优点，但需要特异性较好的抗体。

四、放射免疫测定法（RIA）放射免疫测定法是一种使用放射性同位素标记的植物激素进行测定的方法。

该方法通过将放射性同位素标记的植物激素与待测样品中的植物激素结合，然后通过放射性计数来测定植物激素的含量。

放射免疫测定法具有灵敏度高、测定范围广的特点，但需要使用放射性同位素，存在辐射危险。

五、质谱法（MS）质谱法是一种高灵敏度的分析方法，可以用于测定微量的植物激素。

该方法通过将待测样品中的植物激素通过质谱仪进行分子质量分析，从而测定植物激素的含量。

质谱法具有高灵敏度、高分辨率的特点，但需要专用的仪器设备和较高的技术水平。

植物激素测定方法有高效液相色谱法、气相色谱法、酶联免疫吸附法、放射免疫测定法和质谱法等。

化学发光法elisaELISA（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay）是一种常用的生物化学分析方法，通过检测化学发光信号来定量分析样品中的目标物质。

它是一种高灵敏度、高特异性的实验技术，广泛应用于医学、生物学、环境科学等领域。

化学发光法ELISA的原理是利用酶标记抗体与待测物质结合，然后通过酶催化反应产生化学发光信号。

ELISA分为直接ELISA、间接ELISA、竞争ELISA等多种类型，根据实验需要选择不同的方法。

在ELISA实验中，首先需要将待测物质固定在试验板上，然后加入酶标记抗体与待测物质结合。

接着，加入底物溶液，底物与酶催化反应产生化学发光信号。

最后，使用专用的发光仪器测量发光强度，根据发光强度的大小可以定量分析样品中的目标物质含量。

化学发光法ELISA具有许多优点。

首先，ELISA方法具有高灵敏度，可以检测到非常低浓度的目标物质。

其次，ELISA方法具有高特异性，可以准确地区分目标物质与其他物质的结合。

此外，ELISA方法操作简单、快速，可以同时处理多个样品，提高实验效率。

最重要的是，ELISA方法可以应用于多种样品类型，包括血清、尿液、细胞培养液等，具有广泛的应用前景。

化学发光法ELISA在医学领域有着重要的应用。

例如，ELISA可以用于检测血液中的病原体抗体，如HIV、乙肝病毒等。

ELISA还可以用于检测肿瘤标志物，帮助早期发现肿瘤并进行治疗。

此外，ELISA还可以用于检测药物浓度，指导药物治疗的调整。

除了医学领域，化学发光法ELISA在生物学、环境科学等领域也有广泛的应用。

例如，ELISA可以用于检测植物中的激素含量，研究植物生长发育的调控机制。

ELISA还可以用于检测环境中的污染物，如重金属、农药等，评估环境质量。

尽管化学发光法ELISA具有许多优点，但也存在一些局限性。

首先，ELISA方法对样品的处理要求较高，需要进行样品预处理、稀释等步骤，增加了实验的复杂性。

一、实验目的1. 探究玉米在不同生长阶段的主要生理生化特性。

2. 分析玉米光合作用、呼吸作用、水分利用效率等生理指标。

3. 通过实验了解玉米种子萌发、幼苗生长及植株发育过程中的生理生化变化。

二、实验材料与方法1. 实验材料：玉米种子（品种：郑单958）、生长培养基、蒸馏水、NaOH溶液、碘液、斐林试剂等。

2. 实验方法：（1）种子萌发实验：将玉米种子浸泡在蒸馏水中，置于恒温培养箱中，定期观察种子萌发情况，并记录萌发率。

（2）幼苗生长实验：将萌发的玉米幼苗移栽至生长培养基中，定期测量幼苗株高、叶面积等生长指标。

（3）生理生化指标测定：a. 光合作用：利用光合仪测定玉米叶片的光合速率、蒸腾速率等指标。

b. 呼吸作用：利用呼吸仪测定玉米叶片的呼吸速率。

c. 水分利用效率：通过测定玉米植株的水分含量和光合速率，计算水分利用效率。

d. 植物激素含量：利用酶联免疫吸附法（ELISA）测定玉米叶片中的生长素、细胞分裂素等植物激素含量。

e. 酶活性测定：利用比色法测定玉米叶片中过氧化物酶、超氧化物歧化酶等酶活性。

三、实验结果与分析1. 种子萌发实验：- 种子萌发率随浸泡时间延长而增加，浸泡时间为24小时时，种子萌发率最高。

- 种子萌发过程中，呼吸速率和水分含量逐渐增加，表明种子在萌发过程中需要消耗大量能量和水分。

2. 幼苗生长实验：- 玉米幼苗在生长培养基中生长良好，株高、叶面积等生长指标随培养时间延长而逐渐增加。

- 幼苗生长过程中，叶片颜色逐渐由黄绿色转变为绿色，表明光合作用逐渐增强。

3. 生理生化指标测定：- 光合作用：玉米叶片的光合速率和蒸腾速率随光照强度增加而增加，表明玉米具有较强的光合作用能力。

- 呼吸作用：玉米叶片的呼吸速率随温度升高而增加，表明玉米在较高温度下呼吸作用较强。

- 水分利用效率：玉米水分利用效率较高，表明玉米具有较强的水分利用能力。

- 植物激素含量：玉米叶片中生长素和细胞分裂素含量较高，表明玉米具有较强的生长调节能力。

酶联免疫法（ELISA）测定植物激素含量姓名：李希东专业：植物学学号：200808201 日期：09.5.10 成绩：一、实验目的：掌握间接法测定植物激素的原理和方法；了解逆境对玉米根系ABA和IAA含量的影响。

二、实验原理：酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immuno sorbert assay，简称ELISA)是在免疫酶技术(immuno enzymite technique)的基础上发展起来免疫测定技术。

其建立在两个重要的生物化学反应基础之上的，即①抗原抗体反应的高度专一性和敏感性；②酶的高效催化特性。

ELISA把这二者有机地结合在一起，即被分析物先与其相应的抗体或抗原反应，然后再检测抗体或抗原上酶标记物的活性，从而达到定性或定量测定的目的。

间接法是将过量的与蛋白质连接的待测植物激素(实验前将该激素与牛血清白蛋白等蛋白质连接成[激素一蛋白质复合物])吸附在固相支持物上，然后加入待测植物激素和相应抗体，使抗体与待测植物激素及激素蛋白质复合物结合，再加入酶标抗体(标记酶与非特异第二抗体的复合物)，就形成〔蛋白质·激素·第一抗体·第二抗体·酶复合物〕，加入底物后就生成有色产物，测定其吸光率，可计算待测抗原的量。

如果抗体、激素一蛋白质复合物和酶标抗体的量一定，并且[激素·蛋白质复合物]和待测激素的总量超过抗体的量，那么生成的[蛋白质·激素·第一抗体·第二抗体·酶复合物]的量就受待测激素含量的限制，因此待测抗原的量将与吸光率成反比。

图A表示间接酶联免疫方法的基本原理：A.间接酶联免疫原理示意图示反应板（固相载体）示激素特异抗体（一抗）示激素（抗原）示非特异二抗示蛋白质·激素复合物示标记酶本实验所采取的方法，则是利用游离抗原和吸附抗原与游离抗体的竞争性结合反应，它的原理可用下式表示:Ab十H十HP=AbH十AbHP其中Ab表示抗体，H表示游离激素，HP表示吸附在板上的激素一蛋白质复合物。

植物激素脱落酸(ABA)快速检测试剂盒试剂盒使用说明书产品编号：CSB-E09159Pl检测范围：3.12 pmol/ml-200 pmol/ml最低检测限：0.78 pmol/ml特异性：本试剂盒可用于快速检测植物样本中ABA含量。

有效期：6个月预期应用：ELISA法定量测定植物组织样本中的ABA含量。

说明1．试剂盒保存：-20℃（较长时间不用时）；2-8℃（频繁使用时）。

2．浓洗涤液低温保存会有盐析出，稀释时可在水浴中加温助溶。

3．中、英文说明书可能会有不一致之处，请以英文说明书为准。

4．刚开启的酶联板孔中可能会含有少许水样物质，此为正常现象，不会对实验结果造成任何影响。

实验原理本试剂盒采用酶联免疫间接竞争法检测ABA。

微孔板上包被有ABA偶联物。

加入ABA抗体和ABA标准品或样品，游离ABA与微量反应板上的ABA结合物竞争结合抗ABA抗体，没有结合的抗体被洗去，再向微孔中加辣根过氧化物酶标记二抗，与结合在反应板上的抗体作用一定时间，洗去多余的辣根过氧化物酶标记二抗。

再向反应孔中加入相应反应底物TMB，作用一定时间后，结合的酶结合物将TMB转化为蓝色，转化成最终的黄色。

颜色的深浅和样品中的ABA 呈负相关。

用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。

试剂盒组成及试剂配制1.已包被ABA偶联物的酶联板(Assay plate )：一块（96孔）。

2.标准品（Standard）：2×250ul/瓶。

3.样品稀释液(Sample Diluent)：2×20ml/瓶。

4.ABA单克隆抗体：1×60μl/瓶（1：100）5.辣根过氧化物酶标记二抗（HRP-anti-antibody ）：1×120μl/瓶（1：100）6.底物溶液（TMB Substrate）：1×10ml/瓶。

7.浓洗涤液（W ash Buffer）：1×20ml/瓶，使用时每瓶用蒸馏水稀释25倍。

植物激素检测⽅法植物激素是植物体内合成的⽤于调控植物⽣成发育的⼩分⼦化合物。

⽬前，被公认的植物激素有6⼤类：细胞分裂素类（CK）、⾚霉素类（GAs）、⽣长素类（Auxins）、脱落酸类（ABA）、⼄烯和油菜素甾醇类（BRs）。

以下介绍⼏种常⽤的植物激素检测⽅法。

1. ⽣物检测法利⽤植物激素作⽤于植物组织或离体器官后产⽣的特异性反应，从⽽间接对植物激素的含量进⾏检测。

然⽽，不同结构的⾚霉素、⽣长素或激动素对不同⽣物检测法的响应有差异，因此有时可能⽆法测出。

由于⽣物检测法可以检测植物激素的活性，常⽤于植物激素的定性分析，也常与其他检测⽅法结合使⽤。

2. ⽓相⾊谱法通过与标准样品共⾊层分离来鉴定样品中植物激素的含量，但由于⽆法排除杂质与标准品的共⾊层分离，所以不能准确检测植物激素含量。

待测样品必须形成易挥发的甲基化和三甲基硅烷化衍⽣物才可以运⽤⽓相⾊谱法检测，所以在⼄烯的测定种，⽓相⾊谱法⽐较常⽤。

3. 酶联免疫法（ELISA法）将抗原或抗体与酶结合形成酶标抗原或抗体，加⼊酶反应的底物后，底物被酶催化⽣成有⾊产物，通过颜⾊反应的深浅来进⾏定性或定量分析。

酶联免疫吸附法的主要缺点在于抗体的制备复杂，且检测中难以排除交叉反应，⽆法保证植物激素检测的准确性。

4. ⾼效液相⾊谱法⾼效液相⾊谱法与不同检测器结合，能直接分析多种植物激素，是⽬前应⽤较⼴泛的植物激素检测⽅法之⼀。

除⼄烯外的其它植物激素均可以采⽤⾼效液相⾊谱法进⾏检测。

5. 质谱法液质联⽤（LC-MS）和⽓质联⽤（GC-MS）克服了⾼效液相⾊谱和⽓相⾊谱的在植物激素定性和定量⽅⾯的局限性，成为普遍接受和认可的植物激素检测⽅法。

GC-MS具有选择性好、专⼀性强、灵敏度⾼等特点，不⾜之处在于对样品的纯化要求很⾼，且样品需要衍⽣化处理。

不同于GC-MS，LC-MS不需要衍⽣化处理，简化了操作步骤，缩短了检测时间。

因此LC-MS更适⽤于植物激素的检测（除⼄烯外）。