植物激素的酶联免疫吸附测定法(ELISA)

植物激素的酶联免疫吸附测定法（ELISA）免疫测定是利用抗原、抗体特异性反应而建立的，根据可视化方法的不同可分为：酶联免疫、放射免疫、荧光免疫、化学发光免疫测定、生物发光免疫测定、浊度免疫测定法等。

由于酶联免疫吸附分析法（Enzyme-linked Immunosorbent Assays, 简称ELISA）具有灵敏性、特异性高，且方便、快速、安全、成本低廉的特点，而日益被广泛应用于植物激素测定。

目前，几大类植物激素IAA,ABA, GA3、GA4、iPA、ZR、DHZR等都建立了相应的ELISA方法并有试剂盒出售。

植物激素的酶联免疫检测方法有两种形式（见下图），一种是在固相载体上直接包被抗体（直接法，先包被二抗，再加一抗），另一种是包被抗原（间接法）。

直接法利用游离抗原和酶标抗原与吸附的抗体进行竞争。

间接法利用游离抗原和吸附抗原与游离抗体进行竞争。

间接法的原理可用下式表示：Ab+H+HP=AbH+AbHP其中Ab表示抗体，H表示游离激素，HP表示吸附在板上的激素－蛋白质复合物。

根据质量作用定律，当该反应体系中Ab及HP的量确定时，游离H越多，结合物AbH形成的就越多，而AbHP形成的就越少，即结合在板上的抗体就越少，通过酶标二抗检测结合物AbHP的多少，就可以确定游离H 量的多少。

材料、试剂及设备1 材料各种新鲜植物材料2 仪器设备研钵，冷冻离心机，台式快速离心浓缩干燥器或氮气吹干装置，酶联免疫分光光度计，吸水纸，恒温箱，冰箱，酶标板（40孔或96孔），可调微量液体加样器（10μl，40μl,200μl,1000μl），带盖瓷盘（内铺湿纱布）。

3 试剂(1) 包被缓冲液：称取１.５g Na2CO3, 2.93g NaHCO3, 0.2g NaN3（可不加）, 用量筒加1 000 ml蒸馏水，pH为9.6.(2) 磷酸盐缓冲液（PBS）：称取8.0g NaCl, 0.2g KH2PO4 , 2.96g Na2HPO4 ·12H2O，用量筒加1 000 ml蒸馏水，pH为7.5。

植物激素的测定方法植物激素是一类由植物自身合成并参与生长发育调控的活性物质，对植物的生长发育起着重要作用。

因此，准确测定植物激素的含量对于研究植物生长发育调控机制具有重要意义。

本文将介绍几种常用的植物激素测定方法。

一、高效液相色谱法（HPLC）高效液相色谱法是目前应用最广泛的植物激素测定方法之一。

该方法基于植物激素在高效液相色谱柱上的保留时间和峰面积，通过与已知浓度的标准品比较，可以计算出待测样品中植物激素的含量。

高效液相色谱法具有分离效果好、分析速度快、准确度高的优点，但需要专用的仪器设备，操作较为复杂。

二、气相色谱法（GC）气相色谱法是另一种常用的植物激素测定方法。

该方法通过将待测样品中的植物激素转化为易挥发的衍生物，然后在气相色谱柱上进行分离和定量分析。

气相色谱法具有测定灵敏度高、分离效果好的特点，但需要对样品进行预处理，并且对仪器的稳定性要求较高。

三、酶联免疫吸附法（ELISA）酶联免疫吸附法是一种常用的免疫学测定方法，也可以用于测定植物激素的含量。

该方法通过将植物激素与特异性抗体结合，然后再用酶标记的二抗进行检测，最后通过比色反应或发光反应来测定植物激素的含量。

酶联免疫吸附法具有操作简便、成本较低的优点，但需要特异性较好的抗体。

四、放射免疫测定法（RIA）放射免疫测定法是一种使用放射性同位素标记的植物激素进行测定的方法。

该方法通过将放射性同位素标记的植物激素与待测样品中的植物激素结合，然后通过放射性计数来测定植物激素的含量。

放射免疫测定法具有灵敏度高、测定范围广的特点，但需要使用放射性同位素，存在辐射危险。

五、质谱法（MS）质谱法是一种高灵敏度的分析方法，可以用于测定微量的植物激素。

该方法通过将待测样品中的植物激素通过质谱仪进行分子质量分析，从而测定植物激素的含量。

质谱法具有高灵敏度、高分辨率的特点，但需要专用的仪器设备和较高的技术水平。

植物激素测定方法有高效液相色谱法、气相色谱法、酶联免疫吸附法、放射免疫测定法和质谱法等。

植物NADPH酶联免疫分析（ELISA）试剂盒使用说明书本试剂仅供研究使用目的：本试剂盒用于测定植物组织，细胞及其它相关样本中植物NADPH含量。

实验原理：本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中植物NADPH水平。

用纯化的植物NADPH抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入植物NADPH，再与HRP标记的NADPH抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。

TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。

颜色的深浅和样品中的植物NADPH呈正相关。

用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中植物NADPH浓度。

标本要求：1．标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。

若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融2．不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。

操作步骤：1.标准品的稀释与加样：在酶标包被板上设标准品孔10孔，在第一、第二孔中分别加标准品100μl，然后在第一、第二孔中加标准品稀释液50μl，混匀；然后从第一孔、第二孔中各取100μl分别加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分别加标准品稀释液50μl，混匀；然后在第三孔和第四孔中先各取50μl弃掉，再各取50μl分别加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分别加标准品稀释液50ul，混匀；混匀后从第五、第六孔中各取50μl分别加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第七、第八孔中分别取50μl加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第九第十孔中各取50μl弃掉。

（稀释后各孔加样量都为50μl，浓度分别为120U/L，80U/L ，40U/L，20U/L，10U/L）。

2.加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、待测样品孔。

酶联免疫法（ELISA）测定植物激素含量姓名：李希东专业：植物学学号：200808201 日期：09.5.10 成绩：一、实验目的：掌握间接法测定植物激素的原理和方法；了解逆境对玉米根系ABA和IAA含量的影响。

二、实验原理：酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immuno sorbert assay，简称ELISA)是在免疫酶技术(immuno enzymite technique)的基础上发展起来免疫测定技术。

其建立在两个重要的生物化学反应基础之上的，即①抗原抗体反应的高度专一性和敏感性；②酶的高效催化特性。

ELISA把这二者有机地结合在一起，即被分析物先与其相应的抗体或抗原反应，然后再检测抗体或抗原上酶标记物的活性，从而达到定性或定量测定的目的。

间接法是将过量的与蛋白质连接的待测植物激素(实验前将该激素与牛血清白蛋白等蛋白质连接成[激素一蛋白质复合物])吸附在固相支持物上，然后加入待测植物激素和相应抗体，使抗体与待测植物激素及激素蛋白质复合物结合，再加入酶标抗体(标记酶与非特异第二抗体的复合物)，就形成〔蛋白质·激素·第一抗体·第二抗体·酶复合物〕，加入底物后就生成有色产物，测定其吸光率，可计算待测抗原的量。

如果抗体、激素一蛋白质复合物和酶标抗体的量一定，并且[激素·蛋白质复合物]和待测激素的总量超过抗体的量，那么生成的[蛋白质·激素·第一抗体·第二抗体·酶复合物]的量就受待测激素含量的限制，因此待测抗原的量将与吸光率成反比。

图A表示间接酶联免疫方法的基本原理：A.间接酶联免疫原理示意图示反应板（固相载体）示激素特异抗体（一抗）示激素（抗原）示非特异二抗示蛋白质·激素复合物示标记酶本实验所采取的方法，则是利用游离抗原和吸附抗原与游离抗体的竞争性结合反应，它的原理可用下式表示:Ab十H十HP=AbH十AbHP其中Ab表示抗体，H表示游离激素，HP表示吸附在板上的激素一蛋白质复合物。

酶联免疫吸附法elisa
酶联免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）是一种常用的实验技术，用于检测生物样本中特定分子（例如蛋白质、抗原、抗体等）的存在和浓度。

ELISA技术基于免疫学原理，结合酶与底物的相互作用，通过测量酶的活性来间接或直接检测目标分子。

ELISA通常分为直接ELISA、间接ELISA、竞争ELISA和夹心ELISA 等不同类型。

直接ELISA是将待测样本直接加入包含特异性抗体的微孔板孔中，使目标分子与固相抗体形成复合物，然后添加特异性酶标记的二抗，使其与复合物结合。

最后加入底物，通过酶催化反应产生可量化的信号。

间接ELISA首先将待测样本加入包含特异性抗原的微孔板孔中，使目标分子与固相抗原形成复合物，然后添加特异性酶标记的二抗，使其与复合物结合。

最后加入底物，通过酶催化反应产生可量化的信号。

竞争ELISA是将已知浓度的抗原与待测样本中的抗原竞争结合到固相抗体上，然后添加酶标记的二抗，通过测量酶活性来判断待测样本中的抗原浓度。

夹心ELISA先将特异性抗体固定在微孔板孔上，待测样本中的抗原结合到固相抗体上，然后再加入酶标记的二抗，使其与抗原形成复合物，最后加入底物，通过酶催化反应产生可量化的信号。

ELISA技术广泛应用于医学、生物学、疫苗研发、食品安全等领
域，可以快速、准确地检测目标分子的存在和浓度，具有灵敏度高、特异性强、操作简便等优点。

酶联免疫吸附测定法基本步骤酶联免疫吸附测定法（enzyme-linked immunosorbent assay，简称ELISA）是一种常用的生物化学分析方法，用于检测和定量测定抗原或抗体。

一、准备工作在进行酶联免疫吸附测定法之前，首先需要准备好实验所需的试剂和设备。

试剂包括抗原、抗体、酶标记物、底物和缓冲液等。

设备包括酶标仪、洗板机、离心机和显微镜等。

二、涂布抗原将待测的抗原溶液均匀涂布在免疫平板的孔中，然后放置在4℃的冰箱中过夜，使抗原能够牢固地吸附在孔中。

三、孔的处理将免疫平板从冰箱中取出，倒掉孔中的液体，并用洗涤缓冲液洗涤孔3次，以去除未被吸附的抗原。

四、加入待测样品将待测样品加入免疫平板的孔中，与抗原结合。

然后，将免疫平板放置在室温下孵育一段时间，使待测样品中的抗体与抗原结合。

五、孔的处理将免疫平板从孵育箱中取出，倒掉孔中的液体，并用洗涤缓冲液洗涤孔3次，以去除未结合的抗体。

六、加入酶标记抗体将酶标记抗体加入免疫平板的孔中，与待测样品中的抗原结合。

然后，将免疫平板放置在室温下孵育一段时间，使酶标记抗体与待测样品中的抗原结合。

七、孔的处理将免疫平板从孵育箱中取出，倒掉孔中的液体，并用洗涤缓冲液洗涤孔3次，以去除未结合的酶标记抗体。

八、加入底物将底物加入免疫平板的孔中，与酶标记抗体结合。

底物与酶标记抗体结合后产生颜色反应，这个颜色反应的强度与待测样品中的抗原浓度成正比。

九、停止反应通过加入停止溶液，停止底物与酶标记物的反应。

停止溶液会改变底物的颜色，使其停止变化。

十、测定结果将免疫平板放入酶标仪中进行测定，测定底物的吸光度。

通过比较吸光度值，可以对待测样品中的抗原浓度进行定量分析。

酶联免疫吸附测定法的基本步骤如上所述。

它的优点是灵敏度高、特异性强、重复性好，可以用来检测各种类型的抗原和抗体。

因此，酶联免疫吸附测定法在医学、生物学和疾病诊断等领域具有广泛的应用前景。

实验17 酶联免疫吸附检测法（ELISA）测定植物激素含量一、原理植物激素（planthormone）免疫定量主要有放射免疫分析（RIA）和酶联吸附免疫分析（ELISA），由于前者操作上欠安全等原因，目前常采用后一种类型。

在ELISA中，抗原抗体反应的检测依靠酶标记物来实现，常用的酶有辣根过氧化物酶和碱性磷酸酯酶。

酶可直接标记激素分子，称为酶标植物激素，也可标记于第二抗体（识别抗激素抗体Fc片段的抗体或金黄色葡萄球菌A蛋白），称为酶标二抗。

这两类标记物分别用于固相抗体型和固相抗原型ELISA。

A.固相抗体型ELISA：将抗激素的单克隆抗体（Mab）与已吸附于固相载体上的兔抗鼠Ig抗体（RAMIG）结合，然后加入激素标准品或待测样品，使其与固相化的Mab结合，再加入辣根过氧化物酶（HRP）标记激素（酶标激素）。

通过测定酶标激素的被结合量，可换算出未知样品中激素的数量。

B.固相抗原型ELISA：将“激素-蛋白”复合物（该蛋白应不同于免疫原中的载体蛋白）包被于固相载体，加入待测激素（样品或标准品）和抗IAA多克隆抗体（Pab）反应，进行竞争反应。

然后让HRP标记羊抗兔Ig抗体（HRP-GARIG）与结合在固相上的Pab反应，通过测定与固相结合的酶量，换算出未知样品中激素的含量。

二、材料、仪器设备及试剂（一）材料：高等植物、真菌、藻类等组织或器官。

（二）仪器设备：1. 酶联免疫检测仪；2. 高速冷冻离心机；3. 恒温箱；4. 连续进样器；5. 涡旋仪；6. 96孔微孔板；7. 离心管；8. 研钵或匀浆器；9. 试管。

（三）试剂1. 洗涤缓冲液：0.01mol/L pH7.4磷酸缓冲液（PBS），含0.05％Tween-0；2. RAMIG 溶液，或“激素-蛋白”复合物；3. 0.1％封闭蛋白（该蛋白应不同于免疫原中的载体蛋白）；4. 抗激素Mab，或Pab；5. 激素标准品母液，及参比系列溶液（按双倍或四倍系列稀释）；6. HRP标记激素，或HRP-GA RIG；7. 邻苯二胺（OPD）基质液：5mgOPD溶于12.5ml0.01mol/L pH5.0PBS，用前加入30％H2O212.5μl。

植物激素检测⽅法植物激素是植物体内合成的⽤于调控植物⽣成发育的⼩分⼦化合物。

⽬前，被公认的植物激素有6⼤类：细胞分裂素类（CK）、⾚霉素类（GAs）、⽣长素类（Auxins）、脱落酸类（ABA）、⼄烯和油菜素甾醇类（BRs）。

以下介绍⼏种常⽤的植物激素检测⽅法。

1. ⽣物检测法利⽤植物激素作⽤于植物组织或离体器官后产⽣的特异性反应，从⽽间接对植物激素的含量进⾏检测。

然⽽，不同结构的⾚霉素、⽣长素或激动素对不同⽣物检测法的响应有差异，因此有时可能⽆法测出。

由于⽣物检测法可以检测植物激素的活性，常⽤于植物激素的定性分析，也常与其他检测⽅法结合使⽤。

2. ⽓相⾊谱法通过与标准样品共⾊层分离来鉴定样品中植物激素的含量，但由于⽆法排除杂质与标准品的共⾊层分离，所以不能准确检测植物激素含量。

待测样品必须形成易挥发的甲基化和三甲基硅烷化衍⽣物才可以运⽤⽓相⾊谱法检测，所以在⼄烯的测定种，⽓相⾊谱法⽐较常⽤。

3. 酶联免疫法（ELISA法）将抗原或抗体与酶结合形成酶标抗原或抗体，加⼊酶反应的底物后，底物被酶催化⽣成有⾊产物，通过颜⾊反应的深浅来进⾏定性或定量分析。

酶联免疫吸附法的主要缺点在于抗体的制备复杂，且检测中难以排除交叉反应，⽆法保证植物激素检测的准确性。

4. ⾼效液相⾊谱法⾼效液相⾊谱法与不同检测器结合，能直接分析多种植物激素，是⽬前应⽤较⼴泛的植物激素检测⽅法之⼀。

除⼄烯外的其它植物激素均可以采⽤⾼效液相⾊谱法进⾏检测。

5. 质谱法液质联⽤（LC-MS）和⽓质联⽤（GC-MS）克服了⾼效液相⾊谱和⽓相⾊谱的在植物激素定性和定量⽅⾯的局限性，成为普遍接受和认可的植物激素检测⽅法。

GC-MS具有选择性好、专⼀性强、灵敏度⾼等特点，不⾜之处在于对样品的纯化要求很⾼，且样品需要衍⽣化处理。

不同于GC-MS，LC-MS不需要衍⽣化处理，简化了操作步骤，缩短了检测时间。

因此LC-MS更适⽤于植物激素的检测（除⼄烯外）。