基因工程重点考点归纳

基因工程重点考点归纳

1. 简述基因工程中的四大要素。

答：基因工程的四大要素是基因、工具酶、载体、宿主细胞。

2. 简述基因工程诞生的基础。

答：基因工程诞生的基础是理论上的三大发现和技术上的三大发明。

1971年，史密斯（Smith H. O.）等人从细菌中分离出的一种限制性酶,酶切病毒DNA分子，标志着DNA重组时代的开始。

1972年伯格（Berg P.）等用限制性酶分别酶切猿猴病毒和噬菌体DNA，将两种DNA 分子用连接酶连接起来,得到新的DNA分子。

1973年，科恩（Cohen S.）等进一步将酶切DNA分子与质DNA连接起来，并将重组质粒转入E.coli细胞中。

理论上的三大发现：（1）DNA是遗传物质

（2）DNA双螺旋模型（Watson/Crick 1953）

（3）确定了遗传信息传递的方式（60年代）

技术上的三大发明：（1）工具酶的使用【Smith 和Wilcox(1970)

流感嗜血杆菌分离纯化了Hind II其它工具酶（如连接酶）等的发现分子剪刀和DNA缝合工具】

（2）基因运载工具—DNA载体的使用(对质粒的认识）【细菌的致育因子—F因子Lederberg 1946抗药性因子(R) 大肠杆菌素因（Col）】

（3）逆转录酶的使用【Baltimomore 和Temin (1970) 各自发现了逆转录酶】

意义：丰富了“中心法则”、真核基因的制备成为可能、构建cDNA 文库成为可能。

第二章

1.简述细菌的限制与修饰系统

答：细胞中存在位点特异性限制酶和特异性甲基化酶，即细胞中有限制—修饰系统(R-M Restriction-modification system)。R-M系统是细菌安内御外的积极措施。根据酶的亚单位组成、识别序列的种类和是否需要辅助因子，限制与修饰系统至少可分为四类。

2.II型限制性内切酶的特点

答：II型限制性内切酶是同源二聚体，由两个彼此按相反方向结合在一起的相同亚单位组成。识别回文对称序列，在回文序列内部或附近切割DNA，产生带3‘- 羟基和5’-磷酸基团的DNA 产物，需Mg2+，相应的修饰酶只需SAM 。其识别序列主要为4-6bp ，或更长且呈二重对称的特殊序列。

3.举例：你使用过的工具酶，用于做什么？应该注意的问题

T4 DNA连接酶。T4 DNA连接酶的分子量为68 kDa，催化DNA5′磷酸基与3′羟基之间形成磷酸二酯键。

应注意的问题是连接反应条件需要ATP，若在16℃反应，大约需4小时；若在4℃反应，则需反应过夜。

1. 简述蓝白斑筛选的原理。如果插入的目标基因较小，仅使用蓝白斑筛选合适吗？对于白色菌落还需要做哪些进一步的鉴定？

答：蓝白斑筛选是重组子筛选的一种方法：是根据载体α-互补的遗传特征筛选重组子。宿主大肠杆菌的DNA的短区段，lacZ△M15 基因: 缺失β-半乳糖苷酶中第11-41 个氨基酸的lacZ 基因，无酶学活性。而载体一般带有lacZ′: N-端140 个氨基酸的lacZ 基因，其产物无酶学活性。在这个编码区中插入了一个多克隆位点（MCS），它并不破坏读框，但可使少数几个氨基酸插入到β-半乳糖苷酶的氨基端而不影响功能，这种载体适用于可编码β-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞。因此，宿主和质粒编码的片段虽都没有酶活性，但它们同时存在时，可形成具有酶学活性的蛋白质。这样，lacZ基因在缺少近操纵基因区段的宿主细胞与带有完整近操纵基因区段的质粒之间实现了互补，称为α-互补。由α-互补而产生的LacZ+细菌在诱导剂IPTG的作用下，在生色底物X-Gal存在时产生蓝色菌落，因而易于识别。然而，当外源DNA插入到质粒的多克隆位点后，由于插入片段较大，几乎不可避免地导致无α-互补能力的氨基端片段，使得带有重组质粒的细菌形成白色菌落。这种重组子的筛选，又称为蓝白斑筛选。 对于较小的基因片段，由于其可能无法完全阻止α-互补，通常会出现假阴性。

如要进一步确认，可对白斑提取质粒，再对质粒进行双酶切，电泳以确定，所取白斑的菌中含有目的基因。

2.作为克隆载体应具备哪些条件？比较pBR322, pUC19和pUC119相同和不同点？

答：克隆载体应具备的条件：(1) 具有复制起点(2) 具有抗菌素抗生基因（3）具若干限制酶单一识别位点（4）具有较小的分子量和较高的拷贝数。

pBR322与pUC19相比：

共同点：pUC19和pUC119从pBR322改造得来的，它们含有相同的ori和氨苄青霉素抗性基因；pUC119由pUC18/19增加了一些功能片段改造而来。

不同点：（1）pUC19抗性基因的DNA核苷酸序列已经发生了变化，不再含有原来的核酸内切限制酶的单识别位点，（2）pUC19含有大肠杆菌β-半乳糖酶基因（lacZ）的启动子及其编码α-肽链的DNA序列，此结构特称为lacZ′基因（3）pUC19含有位于lacZ′基因中的靠近5′-端的一段多克隆位点（MCS）区段，但它并不破坏该基因的功能。（4）pUC19的分子量比pBR322小的多，只有2686bp（5）pBR322还含有四环素抗性基因。

pUC19与pUC119相比，pUC119多了M13噬菌体DNA合成的起始与终止以及包装进入噬菌体颗粒所必须的顺式序列（IG）。

3.为什么在辅助噬菌体M13K07帮助下可以有效地制备ssDNA?

答：M13K07的突变基因Ⅱ产物优先与克隆于噬菌粒pUCll8和pUCll9中的病毒复制起点的作用，这就使噬菌粒正链DNA能够优先合成，以确保在细胞所产生的病毒颗粒中来自噬菌粒的单链DNA能够占据优势。

第四章&第五章

1.对比下列各组概念：

（1）克隆载体、表达载体和穿梭载体 （2）plasmid, phagemid and cosmid

（3）PAC, BAC and Y AC

答:（1）克隆载体:以扩增或保存DNA片段为目的的载体，一般具有复制起点，抗菌素抗生基因，若干限制酶单一识别位点和较小的分子量和较高的拷贝数。表达载体是在常规克隆载体的基础上衍生而来，主要增添了增强子，以及有利于表达产物分泌、分离或纯化的原件，进行DNA重组的目的是要获得表达产物。相对于克隆载体来说增加了表达元件，基本骨架是最简单的质粒克隆载体中的复制起点和氨苄青霉素抗性基因，表达形式主要是融合蛋白的形式，表达载体除了提供复制属性外，主要是形成一种表达所必须的环境。穿梭载体能够在两类不同宿主中复制、增殖和选择的载体，主要为质粒载体，相对与克隆载体和表达载体而言，穿梭载体至少含有两套复制单元和两套选择标记，相当于两个载体的联合。穿梭载体一般在大肠杆菌中保藏、扩增，然后将其转到目标宿主中。

（2）plasmid:质粒，指的是染色体外能进行自我复制的双链闭合环状DNA分子，通常一个质粒含有一个Ori以及与此相关的顺式作用元件，复制方式分为严谨型和松弛型且具有不相容性和转移性。phagemid是噬菌粒，指的是带有丝状噬菌体大间隔区的质粒载体，是集质粒和丝状噬菌体的特征于一身的载体，具有ColE1复制起点及抗生素抗性选择标记，以及丝状体噬菌体的间隔区，由于基因Ⅱ蛋白存在有利于产生ssDNA，带有这种质粒的细菌被M13丝状噬菌体感染后，在基因Ⅱ蛋白影响下质粒复制方式发生改变。Cosmid是黏粒，指的是质粒的衍生物，是带有cos序列的质粒，组成包括质粒的复制起点、抗性基因、cos位点，可以像质粒一样转化和增殖。

（3）YAC（酵母人工染色体载体）: 结构上能够模拟真正酵母染色体的线状DNA分子，其工作状态是线状的，Y AC载体以环状的形式存在，增加了大肠杆菌质粒载体的复制元件和选择标记，以便保存和增殖。其中复制元件是其核心组成成分，有ARS、TEL、CEN，选择标记主要是采用营养缺陷型基因。BAC（细菌人工染色体载体）:其与常规克隆载体的核心区别在于其复制单元的特殊性，BAC复制单元来自F质粒，其载体的低拷贝数可以避免嵌合体的产生，减少外源基因的表达产物对宿主细胞的毒副作用，其标记基因是氯霉素抗性基因。PAC（P1人工染色体载体）：PAC载体结合了P1载体和BAC载体的最佳特性，相当于P1噬菌体的改进载体。

2. 简述用YAC为载体时，重组菌的筛选方法。

答：Y AC载体的选择标记主要是采用营养缺陷型基因，如色氨酸、亮氨酸和组氨酸合成缺陷基因trp1、leu2和his3,尿嘧啶合成缺陷型基因ura3，以及赭石突变抑制基因sup4。其宿主酵母菌的胸腺嘧啶合成基因带有一个赭石突变ade2-1。赭石突变酵母菌在基本培养基上形成红色菌落，当带有赭石突变抑制基因sup4的载体存在于细胞中时，可抑制ade2-1基因的突变效应，形成正常的白色菌落。第一步筛选：营养互补筛选，第二步筛选：看颜色改变是否表现出插入抑制基因致其失活。

3. 简述pET表达系统，如何控制外源基因的表达？

答：有两套系统可控制外源基因的严谨表达，一套是通过宿主控制T7 RNA聚合酶的量来实现的，即在宿主细胞中引入一个带有T7噬菌体的溶菌酶编码基因的质粒，如pLysS或pLysE，它们分别低量和高量表达T7噬菌体的溶菌酶。该溶菌酶可抑制T7 RNA聚合酶的活性，从而减少在未诱导情况下外源基因的表达。另一套是使启动子的控制效应更严谨，在pET载体上装载acⅠ基因，提高阻抑物的浓度。同时也可利用T7-lac启动子（在T7启动子序列下游装入一个由25bp组成的lacO操纵子序列），当阻抑物结合在lacO位点时，即使存在T7

RNA聚合酶，外源基因也无法表达。只有当诱导物存在时，才能解开T7 RNA聚合酶基因和外源基因表达的双重阻遏。

4. 为什么采用增加融合标签的技术，表达外源基因？

答：因为当蛋白表达以后，有效的分离纯化或分泌就成为获得目的蛋白的关键因素。通过融合蛋白的形式表达，并利用载体编码的蛋白或多肽的特殊性质，可对目的蛋白进行分离和纯化。用作分离的载体蛋白被称为标签蛋白或标签多肽（Tag），常用的有谷胱甘肽S转移酶、六聚组氨酸肽、蛋白质A和纤维素结合域等，其主要是因为这样可以分离纯化目的蛋白。

第五次

1.比较各组概念：（1）琼脂糖电泳、PAGE、PFGE

（2）southern blotting、northern blotting、western

blotting

（3）RT-PCR DD-RT-PCR Real time PCR

答：（1）琼脂糖电泳：用于DNA的分离、检测和纯化。检测DNA是否真的存在、是否有降解现象，以及DNA经限制性内切酶酶切后其产物的大小如何。对0.8-10kb的DNA分离效果最佳。

PAGE：即聚丙烯酰胺凝胶电泳。检测小分子核酸的大小（如小相对分子量RNA、寡核苷酸、DNA序列分析等），或在同位素标记的情况下分析单链核酸（如分离寡核苷酸探针和DNA测序等）。对100

bp-1kb 的核酸分离效果最佳。

PFGE：即脉冲场凝胶电泳。分离大相对分子质量的DNA的片段。原理是用一种交替变化电场方向的电泳，以一定的角度并以一定的时间变换电场方向，使DNA分子在微观上按“Z”字形向前泳动，从而达到分离大相对分子质量的DNA片段的目的。针对50kb 或100kb以上，甚至Mb级的大片段DNA。