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基因工程重点

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4.DNA聚合酶类

DNA聚合酶1 ：5’-3‘聚合酶活性

：5’-3‘外切酶活性

：3’-5‘外切酶活性

主要用于切口平移制DNA探针用于核酸分子杂交

Klenow酶： 5’-3‘聚合酶活性

3’-5‘外切酶活性

主要用于随机引物法标记DNA探针

末端终止法（双脱氧）测序

cDNA第二链的合成

补平3’凹端

逆转录酶：5‘-3’聚合酶活性

5‘-3’外切酶活性

3‘-5’外切酶活性

RNase H活性

末端转移酶活性。MMLV在加上3个C

主要用于：以mRNA为模板合成目的基因

构建cDNA文库

逆转录PCR和荧光定量PCR

5.碱性磷酸酶

把5’-P变成5‘-OH

主要用于: 防止载体自连

获得5’标记的DNA或RNA探针

6.末端转移酶

Mg离子加在突出末端上

Co离子加在平末端上

7.其他工具酶

T4多核苷酸激酶： 催化r-磷酸从ATP分子转移给DNA或RNA的5-OH末端。与碱性磷酸酶连用， 获得5’标记的DNA或RNA探针

S1单链核酸酶： 特异性降解单链DNA或RNA。常被用于除去DNA双链或杂交双链中的单链发卡结构

8.载体

名： 载体 是指运载外源DNA有效进入受体细胞的工具。载体同外源DNA在体外重组成DNA重组分子。在进入受体后形成一个复制子， 即形成在细胞内能独自进行自我复制的遗传因子。

9. 载体三个条件

具备复制起点

具有筛选标记

多克隆位点， 每种限制性内切酶最好只有一个切点

具备较高的拷贝数

（载体的发展目标：具有较大的外源DNA片段的装载容量， 又不影响本身的复制）

载体类型 定义 装载能力

质粒 5-8kb

噬菌体 <20kb

Cos质粒 人工构建的由入噬菌体的cos序列、质粒复制子序列及抗生素的抗性基因序列组成的一类特殊的质粒载体 30-40kb

人工微小染色体 利用真核生物染色体或原核生物基因组功能元件构建的能克隆大于50kb的人工载体 50-200kb

10. 表达载体

名：要使克隆基因在宿主细胞中表达， 就要将它放入带有基因表达所需要的各种调控元件的载体中，这种载体就称为表达载体

11. （名）T7噬菌体启动子： 它是来自T7噬菌体的启动子， 具有高度的特异性， 只有T7 RNA聚合酶才能使其启动， 故可以使克隆在载体上的基因独立于宿主细菌基因组之外得到表达。T7RNA聚合酶的效率比大肠杆菌RNA聚合酶高5倍左右。

T7噬菌体启动子系统的优点

1）T7噬菌体RNA聚合酶合成RNA的速度高于大肠杆菌5倍；

2）T7噬菌体RNA聚合酶只识别自己的启动子序列，不启动大肠杆菌DNA任何序列的转录；

3）T7噬菌体RNA聚合酶对抑制大肠杆菌RNA聚合酶的抗生素有抗性；

4）T7噬菌体RNA聚合酶/启动子系统在一定条件下，基因表达产物可占细胞总蛋白的25％以上。

12. （名）融合表达载体：蛋白质融合表达是指外源基因与载体已有的担体蛋白的编码基因拼接在一起，并作为一个新的开放阅读框进行表达。

融合蛋白表达的优缺点： 与高表达的担体蛋白共同表达，可以保证目的蛋白表达率高，稳定性好；

② 担体蛋白常常是结构和功能研究得比较清楚的蛋白质，利用免疫亲和层析很容易对担体蛋白进行分离和纯化；

③ 某些担体蛋白能很成功地生成折叠正确、有生物活性的蛋白质，可以帮助目的蛋白形成正确的空间结构。

④ 通过化学裂解和蛋白酶很容易将担体蛋白从目的蛋白中裂解出来。

13. （名）分泌表达是指周质蛋白、细胞内膜与外膜蛋白等以带有N端信号肽的前体形式首先在细胞质中合成，随后穿膜运送到周质或定位到内、外膜上的分泌过程。穿膜过程中，信号肽被信号肽酶切除。将目的蛋白的基因置于原核蛋白信号肽的序列的下游可能实现分泌型表达。

分泌表达的优点：

①信号肽被切除后的蛋白质N末端的氨基酸序列与天然蛋白是一致的

②周质空间中的蛋白酶活性比细胞质中的要低，从而使蛋白质较稳定地存在于周质中

③周质中只有少量的细菌蛋白，使分离纯化更容易

④周质空间存在一个氧化的环境，使得二硫键更容易形成

14：（名）基因组文库：把某种生物的基因组DNA切成适当大小，分别与载体结合，导入宿主细胞，形成克隆。这样的克隆片段的总汇，叫基因组文库.基因组文库应包含基因组中的各种DNA顺序，每种顺序至少有一份代表。

流程

1. 基因组DNA的制备

2. 基因组DNA的切割

3.载体和受体的选择

4. 基因文库的完备性

5.基因文库的保存

6、基因组文库的筛选

15.(名)cDNA文库：以生物细胞的总mRNA为模板，用逆转录酶合成互补的双链cDNA，然后连接到载体上，转化宿主细胞后构建的基因文库，就是cDNA文库。

作用：cDNA序列只与基因的编码序列有关， 不能反映基因的内含子、转录启动子、终止子甚至核糖体识别序列等信息，但由于文库的复杂性低，非常适合于真核生物的特异基因的分离与筛选，而且从cDNA文库中筛选分离的目的基因可直接用于表达。

cDNA 文库的优越性

• cDNA基因文库的筛选比较简单易行。一个完整的cDNA基因文库要比一个完整的基因组文库所包含的克隆数少很多，从而大大简化了筛选特定目的基因序列克隆的工作量。

• 真核生物cDNA基因文库可用于在原核细胞中表达的克隆，直接用于基因工程操作。因为原核细胞缺乏对真核生物基因组基因表达的mRNA进行加工剪切和修饰的系统，因此用cDNA基因作为真核生物的目的基因具有优越性。

• cDNA基因文库还可用于真核细胞mRNA的结构和功能研究。一种特异的mRNA在细胞中往往仅占很小的比例，难以直接研究其序列、结构和功能。而相应的cDNA则可方便地进行序列分析，初步确定mRNA的起始、编码、转录与翻译的终止序列。

16.PCR

(名)PCR叫多聚酶链式反应，是利用碱基互补配对的原则，经过模板DNA的高温变性、低温复性以及DNA聚合酶的子链延伸等多次循环，在体外快速扩增合成DNA的一种方法。

体系：

模板DNA

• 一对引物

• dNTPs

• Taq酶

• 缓冲液

• Mg2+

• 超纯水

应用：从供体基因组DNA扩增获取目的基因

目的基因的筛选与鉴定

基因诊断

反向PCR：原理：

作用：扩增已知序列两侧的未知序列。

RTPCR：原理：

作用：1.从mRNA出发获得目的基因。

2.研究基因的表达情况

实时荧光定量PCR

原理：通过荧光染料或荧光标记的特异性探针， 对PCR产物进行标记跟踪，实时在

线监控反应过程，结合相应的软件可以对每一轮PCR产物进行分析，从而精确

定量计算待测样品的初始模板量的方法。

（标记方式：SYBR荧光染料、水解TaqMan探针、发夹型杂交探针）

作用：SYBR荧光染料：定量起始模板浓度、基因型分析、产物鉴定

TaqMan探针：定量起始模板浓度、基因型分析、产物鉴定以及SNP

分析。

发卡型杂交探针：定量起始模板浓度、基因型分析、产物鉴定以及

SNP分析。

RACE-PCR原理：

作用：获取全长或完整的末端序列。

多重PCR 原理：反应体系中使用一对以上的引物对同一模板进行扩增

作用：鉴定所含相似基因的种类

食品污染检测

亲子鉴定

原位PCR原理：将PCR于原位杂交技术相结合（直接原位法、间接原位法）

作用：在原位检测组织细胞内特定的DNA/RNA序列。

17.蛋白质工程

概念：

基因功能研究

表达谱研究方法

1.胚胎原位杂交：利用碱基互补配对原则，将标记的目的DNA或RNA核酸探针与胚胎或组织内的mRNA直接杂交，通过荧光显微镜或酶促底物显色技术显示，确定目的基因mRNA的存在于定位。

流程：1杂交前准备（探针制备，取材，固定，玻片和组织处理，增加探针穿透力，降低背景）2杂交3杂交后处理4杂交信号检测，即荧光观察，放射自显影和非放射性标记的显色技术。

2.荧光定量PCR

3.RT-PCR

4.Western blot

5.Northern blot

6.基因芯片：将cDNA或RNA固定在玻片或塑料片上，呈点状分布形成矩阵排列，用同位素或荧光素标记的CDA或ODA探针与之杂交，通过放射自显影或荧光扫描仪检测杂交信号。从而确定不同组织表达情况。

7.胚胎抗体染色技术：利用固定剂将组织或胚胎固定，用特异的一抗与目的蛋白结合，再与酶或者荧光标记的二抗反应，最后通过放射自显影或荧光扫描仪检测杂交信号，从而确定目的基因在胚胎组织内的表达情况。

8.蛋白质组学：蛋白质组是指一个细胞或组织或有机体内所有蛋白质的集合体。蛋白质组学是指研究特定时间或条件下这些蛋白表达情况的科学。

基因芯片：

原理：1首先将含有人类各种基因表达的cDNA分子库通过微量点样技术固定于芯片上，使每一点含有特异的cDNA分子，作为杂交探针分子。2.分别提取正常组织和病变组织的mRNA进行反转录得到相应的cDNA文库。3将正常组织的cDNA用绿色荧光标记，病变组织cDNA用红色荧光标记，将不同荧光标记的两组探针分子同时与芯片杂交，通过洗涤和荧光信号检测，在芯片上看到的双色荧光杂交确定的阳性结果。由此确定相关基因在相应组织的表达情况。

类型：CDA用微量点样技术制作的cDNA芯片，中等密度，约10000个点阵；片段长度500-5000bp，用于比较分析

ODA芯片上就位合成寡核苷酸点阵芯片。高密度，约40万个点阵列，片段大小小于25个核苷酸，用于检验点突变。

特点：高度的并行性、多样性、微型性、自动化

应用：高通量测序，差异表达析，snp分析，突变位点检测，新药筛选。

基因敲除：

概念：利用外源已突变的基因通过同源重组的方法替换掉内源性的正常同源基因，从而使内源基因失活而表现出突变体的性状的技术或方法。

流程：

建立靶标载体-导入ES细胞-ES细胞导入囊胚-囊胚移植入假孕母鼠-后代回交-杂合体自交-鉴定纯和体表型。确定基因功能。

正负筛选标记：PNS，PNS载体含有两个筛选标记，正基因多位neo基因，其对新霉素具有抗性，其还可使靶基因突变失活。负选择标记基因常为胸苷激酶tk基因， 其表达产物可将细胞杀死，故称为负选择标记。（tk基因在靶基因同源区之外，在发生同源重组时tk会被

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基因工程教案

基因工程教案

基因工程教案

基因工程教案

一、教学目标：

1. 了解基因工程的基本概念和发展历程；

2. 了解基因工程在农业、医学、环境等领域的应用；

3. 学习基因工程的基本原理和技术；

4. 培养学生的科学研究和实践能力。

二、教学重点：

1. 基因工程的基本概念和发展历程；

2. 基因工程在农业、医学、环境等领域的应用；

3. 基因工程的基本原理和技术。

三、教学难点：

1. 基因工程的基本原理和技术；

2. 基因工程在农业、医学、环境等领域的应用。

四、教学方法：

1. 教师讲授相结合的教学方法；

2. 实验操作和实践活动相结合的教学方法；

3. 讨论和小组合作学习的教学方法。

五、教学过程：

1. 创设情境：

教师先引导学生回顾遗传学的相关知识，如基因的定义、结构和功能，然后通过引入基因工程的概念，告诉学生基因工程是一种技术手段，通过改变生物体的基因组成来达到改变其性状的目的。

2. 概念讲解：

教师通过投影仪或幻灯片，讲解基因工程的基本概念和发展历程，让学生了解基因工程的研究历史和重要里程碑。

3. 应用探究：

教师将基因工程在农业、医学、环境等领域的应用案例呈现给学生，引导学生进行讨论和思考，了解基因工程的实际应用和其对人类和社会的影响。

4. 实验操作：

教师组织学生进行基因工程实验操作，如基因转导、PCR、酶切等实验操作，让学生亲自体验基因工程的基本原理和技术。

5. 实践活动：

教师组织学生进行基因工程相关的实践活动，如基因改造植物的种植、基因检测和诊断等活动，培养学生的科学研究和实践能力。

6. 总结回顾：

教师引导学生对基因工程学习进行总结回顾，梳理所学内容，并对基因工程的前景和问题进行探讨。

六、教学评价：

1. 观察学生对基因工程的理解和应用的能力；

2. 对学生进行实验和实践活动的评价；

3. 考试、作业和讨论等形式的评价。

七、教学资源：

1. 教学投影仪或幻灯片；

2. 基因工程实验器材和试剂；

基因工程重点考点归纳

基因工程重点考点归纳

第一章

1. 简述基因工程中的四大要素。

答：基因工程的四大要素是基因、工具酶、载体、宿主细胞。

2. 简述基因工程诞生的基础。

答：基因工程诞生的基础是理论上的三大发现和技术上的三大发明。

1971年，史密斯（Smith H. O.）等人从细菌中分离出的一种限制性酶,酶切病毒DNA分子，标志着DNA重组时代的开始。

 1972年伯格（Berg P.）等用限制性酶分别酶切猿猴病毒和噬菌体DNA，将两种DNA分子用连接酶连接起来,得到新的DNA分子。

 1973年，科恩（Cohen S.）等进一步将酶切DNA分子与质DNA连接起来，并将重组质粒转入E.coli细胞中。

理论上的三大发现：（1）DNA是遗传物质

（2）DNA双螺旋模型（Watson/Crick 1953）

（3）确定了遗传信息传递的方式（60年代）

技术上的三大发明：（1）工具酶的使用【Smith 和Wilcox(1970) 流感嗜血杆菌分离纯化了Hind II其它工具酶（如连接酶）等的发现分子剪刀和DNA缝合工具】

（2）基因运载工具—DNA载体的使用(对质粒的认识）【细菌的致育因子—F因子Lederberg 1946抗药性因子(R) 大肠杆菌素因（Col）】

（3）逆转录酶的使用【Baltimomore 和Temin (1970) 各自发现了逆转录酶】

意义：丰富了“中心法则”、真核基因的制备成为可能、构建cDNA 文库成为可能。

第二章

1.简述细菌的限制与修饰系统

答：细胞中存在位点特异性限制酶和特异性甲基化酶，即细胞中有限制—修饰系统(R-M

Restriction-modification system)。R-M系统是细菌安内御外的积极措施。根据酶的亚单位组成、识别序列的种类和是否需要辅助因子，限制与修饰系统至少可分为四类。

基因工程复习重点

基因工程复习重点

幻灯片1

考 试 题 型

一、填空（共10题 10分）

二、单项选择题（共20题 20分）

三、英文名词解释（共8题 32分）

四、简答题（共6题 30分）

五、综合题（共1题 8分）

幻灯片2

第一章

1、名词解释：

Gene Engineering HGP（Human Genome Project）

Gene Therapy 基因诊断

2、简述重组DNA操作一般步骤。

3、了解基因工程发展史上的重大事件。

4、了解基因工程研究内容。

5、简述基因工程的主要操作内容。

6、请举两个基因工程应用的具体例子并加以说明。

幻灯片3

第二章 第三章 第四章

1、名词解释：

载体（Vector）、质粒 （Plasmid）、穿梭载体（shuttle vector）、质粒的不相容性、多克隆位点（multiple cloning sites，MCS）、a-互补、 粘性末端、 cos位点、考斯质粒（Cosmid） 、穿梭载体（Shuttle vector） 、pBR322、pSC101、噬菌粒（phagemid or phasmid）、人造染色体载体、细菌人造染色体（BAC）、酵母人造染色体（YAC）、工具酶、限制修饰系统（R-M System）、同位酶、同尾 酶、同裂酶、星星活性(Star activity)、 Klenow酶、T-载体

幻灯片4

2、载体的功能及其应具备的条件。

3、质粒的基本特征是什么？质粒的不相容性的分子机制是什么？

4、在构建质粒载体时，对天然质粒进行修饰改造？

5、正选择标记lacZ′ 的显色原理（ a-互补的原理）是什么，有何应用？

6、 λ 噬菌体的包装限制是什么？

7、核酸限制性内切酶类型及主要特性是什么？

8、限制性内切酶如何命名？命名原则是什么?

9、限制性内切酶基本特征是什么？

基因工程 重点复习

基因工程 重点复习

阿忧专利 拒绝盗版

阿忧专利 拒绝盗版

质粒拷贝数即一个细胞内质粒的数量与染色体数量之比。每种质粒在相应的宿主细胞内保持相对稳定的拷贝数。根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质粒可分为两大复制类型：

严谨型质粒：分子量大，低拷贝数，1－3拷贝

松弛型质粒：分子量小，高拷贝数，10－60拷贝

天然存在的野生型质粒由于分子量大、拷贝数低、单一酶切位点少、遗传标记不理想等缺陷，不能满足克隆载体的要求，因此往往需要以多种野生型质粒为基础进行人工构建。

理想的载体应该有两种抗菌素抗性基因。

穿梭质粒载体;人工构建的、具有两种不同复制起点和选择标记、可以在两种不同的寄主细胞中存活和复制的质粒载体。

优点; ① 利用大肠杆菌进行基因克隆、表达

② 也能利用其它细胞系统（酵母、枯草杆菌、哺乳动物细胞等）进行基因表达。

③ 可以自如地在两种不同寄主细胞之间来回转移基因。

蓝白斑筛选的机理

由α-互补产生的Lac+ 细菌较易识别，它在生色底物X-gal(5-溴-4氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)下存在下被IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)诱导形成蓝色菌落。当外源片段插入到载体的多克隆位点上后会导致读码框架改变, 表达蛋白失活, 产生的氨基酸片段失去α-互补能力, 因此在同样条件下含重组质粒的转化子在生色诱导培养基上只能形成白色菌落。

在麦康凯培养基上，α-互补产生的Lac+细菌由于含β-半乳糖苷酶，能分解麦康凯培养基中的乳糖，产生乳酸，使pH下降，因而产生红色菌落，而当外源片段插入后，失去α-互补能力，因而不产生β-半乳糖苷酶，无法分解培养基中的乳糖，菌落呈白色。

这样，LacZ基因上缺失近操纵基因区段的突变株与带有完整近操纵基因区段的β-半乳糖苷酶阴性的不同突变株之间实现互补，这种互补现象叫做-互补

蛋白质分离纯化的一般程序可分为以下几个步骤：（一）材料的预处理及细胞破碎

分离提纯某一种蛋白质时，首先要把蛋白质从组织或细胞中释放出来并保持原来的天然状态，不丧失活性。所以要采用适当的方法将组织和细胞破碎。常用的破碎组织细胞的方法有：1.