基因工程复习重点

基因⼯程复习重点

《基因⼯程》复习重点

第⼀章绪论1.克隆：当它作为名词使⽤时，是指从⼀个祖先通过⽆性繁殖⽅式产⽣的后代，或具有相同遗传性状的DNA分⼦、细胞或个体所组成的特殊的⽣命群体；当它作为动词使⽤时，是指从同⼀祖先⽣产这类同⼀的DNA分⼦群或细胞群的过程。因此，基因⼯程也可称为基因克隆或DNA分⼦克隆。2.基因⼯程诞⽣于1973年。

3.在现代分⼦⽣物学研究领域中，理论上的三⼤发现及技术上的三⼤发明对基因⼯程的诞⽣起到了决定性的作⽤。

1）理论上的三⼤发现

（1）40年代发现了⽣物的遗传物质是DNA⽽不是蛋⽩质。

（2）50年代明确了DNA的双螺旋结构和半保留复制机理。

（3）60年代确定了遗传信息的传递⽅式，即中⼼法则的建⽴和遗传密码⼦的破译。2）技术上的三⼤发明

（1）利⽤限制酶和连接酶体外切割和连接DNA⽚段。

（2）质粒改造成载体以携带DNA⽚段克隆。

（3）逆转录酶的使⽤打开真核⽣物基因⼯程的⼀条通路。4.基因⼯程：对不同⽣物的遗传物质--基因，在体外进⾏剪切、组合和拼接，使遗传物质重新组合，然后通过载体(质粒、噬菌体、病毒等)转⼊微⽣物、植物或动物细胞内，进⾏⽆性繁殖，并使所需要的基因在细胞中表达，产⽣出⼈类所需要的产物或组建成新的⽣物类型。五个⽅⾯的⼯程技术系统（基因、细胞、酶、微⽣物发酵、⽣化⼯程）是相互依赖、相辅相成的，但系统中基因⼯程占主导地位。5.基因⼯程研究内容包括以下⼏个主要步骤：

（1）从现有的⽣物有机体基因组中，经过酶切消化或PCR扩增等⽅法，获得带有⽬的基因的DNA⽚段。

（2）在体外，将带有⽬的基因的外源DNA⽚段连接到具有选择标记的载体分⼦上，形成能够⾃主复制的重组DNA分⼦。

（3）将重组DNA分⼦转移到适宜的受体细胞，并使其⼀起增殖。

（4）从⼤量的细胞繁殖群体中，筛选出获得了重组DNA分⼦的受体细胞克隆。

（5）由筛选出来的受体细胞克隆，提取出已经得到扩增的⽬的基因，供进⼀步分析研究使⽤。

（6）将分离到的⽬的基因克隆到表达载体上，导⼊受体细胞，使之在新的遗传背景下实现功能表达，产⽣出⼈类所需要的物质。6.基因⼯程的四⼤要素：⽬的基因、⼯具酶、载体、受体。

7.1976年6⽉23⽇，美国国⽴卫⽣研究院（NIH）正式公布了“重组DNA研究的安全准则”。

8.我国的基因⼯程相关法规：

1990年制定《基因⼯程产品质量控制标准》；1993年发布《基因⼯程安全管理办法》；

1996年发布《农业⽣物基因⼯程安全管理实施办法》；2001年发布《农业转基因⽣物安全管理条例》

第⼆章基因⼯程的理论基础与基本技术1.操纵⼦：由⼏个功能相关的结构基因成簇排列⽽组成的⼀个基因表达的协同单位，称为操纵⼦。如：调节基因、启动⼦、操纵基因、结构基因共同组成⼀个操作⼦。2.内含⼦：是⼀个基因中⾮编码DNA⽚段，它分开相邻的外显⼦。

3.外显⼦：是⼀个基因中编码蛋⽩序列。严格地说，外显⼦是指保留在初级mRNA中不被剪切掉的区域，包括5’⾮翻译区(5’UTR)、编码序列和3’⾮翻译区(3’ UTR)。

4.GT-AG法则：序列分析表明，⼏乎每个内含⼦5’端起始的两个碱基都是GT，3’端最后两个碱基总是AG，由于这两个碱基的⾼度保守性和存在的⼴泛性，有⼈把它称为GT-AG法则，即5’ GT … AG 3’。5.卫星DNA：真核⽣物基因组中⾼度重复的DNA，有⼀些20～30bp的极短序列，且以数千个拷贝的串连⽅式排列，这种序列称为卫星DNA。（在染⾊体DNA⽚段的氯化铯密度梯度离⼼中，由于浮⼒密度的不同，这种重复序列在主带DNA附近出现的卫星带，因此称之为卫星DNA。）6.Poly（A）尾巴在基因⼯程操作中的作⽤：

A、⽤Poly（T）作为合成cDNA第⼀链的引物；

B、⽤Poly（T）纯化柱从总RNA中分离mRNA。

7.可诱导调节是指⼀些基因在特殊的代谢物或化合物的作⽤下，由原来关闭的状态转变为⼯作状态，即在某些物质的诱导下使基因活化。

可阻遏调节是指基因平时都是开启的，处在产⽣蛋⽩质和酶的⼯作过程中，但由于⼀些特殊代谢物或化合物的积累将其关闭，阻遏了基因的表达，所以称为可阻遏基因。8.基因⼯程操作中应注意的真核⽣物与原核⽣物的差异

①基因结构的差异

②启动⼦和RNA聚合酶的差异

③蛋⽩质的翻译后修饰加⼯（前体切割、⼆硫键、糖基化、甲基化、羰基化、磷酸化、⼄酰化、硫酸化、丙烯酸化、⾖冠酸化、软脂化）

④基因表达的调节（表达量）

⑤载体的差异

⑥蛋⽩质的纯化⽅便

9.结构基因是可以转录成为各种RNA(如rRNA、tRNA、snRNA)直接⾏使功能，或者转录成信使RNA(mRNA)然后翻译成多肽链，最终形成各种功能蛋⽩质和酶。

从⼴义上讲，任何⼀种能够调节或限制其他基因活性的基因都可叫做调节基因，⼀般情况下则是指基因产物参与调节别的基因活性的基因(如阻遏基因等)。⾸先转录成mRNA，然后由mRNA翻译成阻遏蛋⽩质或激活蛋⽩质，通常也称为转录因⼦或反式作⽤因⼦。它们通常结合到结构基因的⾮编码区的顺式元件上起调控作⽤。10.具有相同遗传信息的个体细胞间其所利⽤的基因并不相同，有的基因活动是维持细胞基本代谢所必需的，⽽有的基因则在⼀些分化细胞或受到外界刺激的细胞中活动。前者称为管家基因，如编码核糖体蛋⽩、线粒体蛋⽩、糖酵解酶等的基因；⽽后者被称为奢侈基因。11.假基因是多基因家族中的成员，因其碱基顺序发⽣某些突变⽽失去功能，不能表达或表达异常，⽣成⽆⽣物活性的多肽。

12.基因组是指⼀个⽣物体、细胞器或病毒的全部基因。原核⽣物基因组仅由⼀条环状的双链DNA分⼦组成，含有⼀个复制起点，它的基因组就是它的整个染⾊体。但对于⼆倍体的⾼等⽣物，能维持配⼦体正常功能的最低数⽬的⼀套染⾊体构成的⼀个基因组。对于植物细胞⽽⾔，则有3个基因组，即染⾊体基因组(核基因组)、线粒体基因组和叶绿体基因组。13.碱抽提法提取质粒DNA

（1）原理DNA双链在强碱条件下变性为DNA单链，⽽单链在中性条件下⼜可复性为双链。

闭合环状的质粒DNA，在变性后不会分离，复性快；染⾊体线性DNA和（或）有缺⼝的质粒DNA变性后双链分离，难以复性⽽形成缠绕的结构，与蛋⽩质—SDS复合物结合在⼀起，在离⼼的时候沉淀下去。

（2）所⽤试剂

①溶菌酶【在碱性条件（pH>8）下有活性。】：能⽔解菌体细胞壁的主要化学成分肽聚糖中的 -1，4糖苷键。

②葡萄糖：增加溶液的粘度，维持渗透压，防⽌DNA受机械⼒（震荡）的作⽤⽽降解。③EDTA：Mg2+、Ca 2+的螯合剂，可抑制DNA酶的活性，防⽌DNA被酶降解。

④NaOH-SDS

NaOH：强碱，提供pH>12的碱性条件，使DNA双链变性。

SDS：溶解细胞膜蛋⽩和细胞内蛋⽩，并结合成“蛋⽩—SDS”复合物，使蛋⽩质（包括DNA 酶）变性沉淀。

⑤NaAc-HAc缓冲液（冰醋酸把醋酸钠溶液的pH调到4.8）：⽤来中和NaOH变性液，使DNA复性。【⾼浓度的NaAc有利于变性的⼤分⼦（蛋⽩质、DNA、RNA等）沉淀。】

⑥⼄醇：⽤于沉淀DNA。（DNA分⼦以⽔合状态“溶于”⽔⾥，⼄醇能夺去DNA分⼦的⽔环境。）

⑦RNase A：降解RNA，以免提取后的DNA中含有⼩分⼦的RNA。

⑧TE缓冲液：DNA保存液。由Tris-HCl和EDTA配制。【Tris-HCl不含⾦属离⼦（不同于磷酸缓冲液或硼酸缓冲液），有利于以后操作；EDTA抑制DNA酶，防⽌DNA被酶降解。】⑨酚-氯仿: 蛋⽩变性剂，进⼀步抽提DNA溶液中的蛋⽩质，使蛋⽩质沉淀。但苯酚会残留在DNA溶液中。

（现多⽤各种商品化的层析柱纯化DNA)。14.计算DNA浓度：

ssDNA：[ssDNA]=33×（OD260—OD310）×稀释倍数

dsDNA：[dsDNA]=50×（OD260—OD310）×稀释倍数

ssRNA：[ssRNA]=40×（OD260—OD310）×稀释倍数

15.衡量提取DNA 的纯度

OD260/OD280＞1.8 可能有RNA污染

OD260/OD280＜1.8 可能有蛋⽩质污染

16.带电荷的分⼦在电场中会以⼀定的速率向与其电荷性质相反的电极移动，速度称为电泳

迁移率。17.琼脂糖凝胶电泳的原理：溴化⼄锭（EB）是扁平分⼦，能插⼊DNA碱基之间，300nm

紫外光照射下能发红⾊荧光。与已知浓度的DNA电泳带荧光强度对⽐，就可以估计出DNA含量。18.相同分⼦量的DNA：闭合环状卷曲超螺旋迁移最快，线性分⼦次之，伸展开环状最慢。

19.琼脂糖凝胶的分辨⼒：空隙⼤⼩决定其分辨分⼦⼤⼩的能⼒。

空隙⼩，分辨率⾼：⼩分⼦较易通过，⽽⼤分⼦难通过；

空隙⼤，分辨率低：⼤⼩分⼦⼏乎以同等速率通过。20.影响DNA琼脂糖凝胶电泳迁移率的因素有哪些？

（1）DNA分⼦的⼤⼩。

（2）DNA的构象。

（3）琼脂糖浓度。

（4）溴化⼄锭使DNA迁移率下降15%。

（5）电压。

（6）电泳缓冲液的成分及浓度。21.聚丙烯酰胺凝胶电泳的优点是⽐琼脂糖凝胶的分辨率⾼的多。

（琼脂糖凝胶电泳：分离300—50000bp ；

聚丙烯酰胺凝胶电泳：分离1—1000bp ）22.核酸的分⼦杂交：

Southern blot--⽤DNA （或RNA ）探针检测DNA 样品。

Northern blot--⽤DNA （或RNA ）探针检测RNA 样品。

原位杂交--对应的菌斑或噬菌斑位置不变，可以直接找出阳性菌落。

Polymerase Chain Reaction ）技术是利⽤酶促反应在体外指导特定DNA 序列扩增的⽅法，以热变性的双链DNA 分⼦为模板，利⽤引物和四种脱氧核苷三磷酸（dNTPs ）为原料在DNA 聚合酶的作⽤下⼤量扩增了特定的DNA ⽚段。1986年 H.A. Erilish 从嗜热⽔⽣菌分离出耐⾼温的Taq DNA 聚合酶，代替⼤肠杆菌DNA 聚合酶Klenow ⽚段（37℃)，PCR技术才进⼊实⽤阶段。1988年 R.K. Saiki 把Taq DNA 聚合酶⽤到PCR 反应中，使PCR ⾃动循环仪成为可能。PCR 技术的原理：

引物：⼈⼯合成的单链DNA ⼩⽚段，碱基顺序分别与所要扩增的模板DNA 双链的5’端相

同。

引物为什么优先与模板互补配对？（浓度⾼，配对序列短）PCR 的特点：

（1）特异性强

（2）敏感性⾼

（3）快速

（4）简便

（5）可以扩增mRNATaq DNA 聚合酶的特点：

（1）热稳定性，最适温度⾼（为75-80℃）；

（2）具有5’→3’聚合酶活性和5’→3’外切酶活性，但没有3’→5’外切酶活性；（因此不能修

复错误的碱基配对！）

（3）Taq 的PCR 产物3’端往往带有⼀个A ；

（4）Taq DNA 聚合酶的激活剂，⾦属离⼦敏感（尤其是Mg 2+）。Pfu DNA Polymerase ：有3 ’→5’的外切酶活性，5’ →3’外切酶活性。是⽬前已发现的所有耐

⾼温DNA 聚合酶中出错率最低的。但PCR 产物为平端！

影响 PCR 的因素：

（1）DNA 聚合酶活性

（2）引物 （3）模板（纯度、模板的量）

（4）dNTPs

模板DNA 变性

引物DNA 复性 引物DNA 延伸

（5）Mg 2+的浓度

引物设计应注意的问题有：1）引物的位置：与待扩增的模板DNA区段的两3’端序列互补（5’端相同）；