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第5卷 第10期 食品安全质量检测学报 Vol. 5 No. 102014年10月Journal of Food Safety and Quality Oct. , 2014基金项目: 黑龙江省自然科学基金项目(C2011-24)、黑龙江省教育厅科学技术研究项目(12511128)及黑龙江省博士后科研启动基金项目(LBH-Q13098)Fund: Supported by Natural Science Foundation of Heilongjiang Province of China (C2011-24), Science and Technology Research Project of Heilongjiang Province Department of Education (12511128) and Postdoctoral Scientific Research Start-up Fund Project of Heilongjiang Province (LBH-Q13098)*通讯作者: 曲敏, 教授, 主要研究方向为新型植物蛋白及食品添加剂。
E-mail: qumin777@*Corresponding author: QU Min, Professor, Harbin University of Commerce, Tongda Street 138, Daoli District, Harbin 150076, China. E-mail: qumin777@两种检测SOD 酶活性方法的比较曲 敏*, 秦丽楠, 刘羽佳, 范宏臣, 朱 姝, 王金凤(哈尔滨商业大学食品科学与工程省级重点实验室, 哈尔滨 150076)摘 要: 目的 比较邻苯三酚自氧化法和氮蓝四唑(NBT)光还原法分别测定超氧化物歧化酶(SOD)酶活力的差异。
方法 采用两种方法分别测定SOD 标准品、苜蓿和番茄两种植物提取物的不同来源SOD 酶活性, 比较其精确性和灵敏度。
动物血中超氧化物歧化酶的提取和活性测定原理超氧化物岐化酶(Superoxide dismutase，简称SOD)广泛存在于生物体内的含Cu、Zn、Mn、Fe的金属类酶。
它作为生物体内重要的自由基清除剂，可以清除体内多余的超氧阴离子，在防御生物体氧化损伤方面起着重要作用。
离子(02-)是人体氧代谢产物，它在体内过量积累会引起炎症、肿瘤、色斑沉淀、衰老等疾病，超氧阴离子与生物体内许多疾病的发生和形成有关。
由于SOD能专一消除超氧阴离子(O2 -)而起到保护细胞的作用，SOD作为一种药用酶，具有广阔的应用前景，并引起了国内外医药界、生物界和食品界的极大关注。
按金属辅基成分的不同可分成3种类型。
最常见的一种含有铜锌金属辅基(CuZn-SOD)，主要存在于真核细胞的细胞质中，在高等植物的叶绿体基质、类囊体内以及线粒体膜间隙也有存在，CuZn-S0D 酶蛋白的分子量约为3.2×104，纯品呈蓝绿色，每个酶分子由2个亚基通过非共价键的疏水基相互作用缔合成二聚体。
每个亚基(肽链)含有铜、锌原子各一个，活性中心的核心是铜。
第二种含有锰离子(Mn-SOD)，主要存在于真核细胞的线粒体和原核细胞中，在植物的叶绿体基质和类囊体膜上也有存在，纯品呈粉红色，由4条或2条肽链组成。
第三种是Fe-S0D，过去一直认为只存在于原核细胞中，近来发现有一些真核藻类甚至某些高等植物中也有存在。
Fe-SOD纯品呈黄色或黄褐色，由2条肽链组成，多数情况下每一个二聚体中含有一个Fe原子。
l969年，McCord和Fridovich第一次从牛血中提纯到超氧化物岐化酶。
自然界中SOD分布极广，其含量随生物体的不同而不同，即使同一种生物的不同组织或同一组织的不同部位，其SOD的种类和含量也有很大差别。
迄今为止人们已从细菌，真菌、原生动物。
藻类、昆虫、鱼类、植物和动物等各种生物体内分离得到SOD。
为拓宽提取SOD的原料，筛选或基因过程开发产SOD量较高的菌株。
超氧化物歧化酶（SOD ）活性的测定方法
一、试剂
1. 0.1mol/L HCl
2. 10mmol/L HCl
3. 0.1mol/L Tris 标准溶液：12.114g 三羟甲基氨基甲烷溶于蒸馏水，并定容至1000ml.
4. 50mmol/LTris 缓冲溶液：50ml0.1mol/L Tris 标准溶液中加入0.1mol/L HCl 19.9～22.0ml,定容至100ml ，PH 为8.20。
5. 30mmol/L 邻苯三酚盐酸溶液：3.7833g 邻苯三酚溶于10mmol/LHCl 中，并用10mmol/LHCl 定容至1000ml.
二、仪器
1. 紫外分光光度计
2. 酸度计
3. 恒温水浴锅
三、操作方法
1.邻苯三酚自氧化速率测定
在试管中加入4.5ml 50mmol/LTris 缓冲溶液，于25℃保温20min,加入10～20ul 30mmol/L 邻苯三酚，立即计时并摇匀，倾于比色杯内，于325nm 下，每隔1min 测吸光值一次，空白以10mmol/L HCl 代替邻苯三酚，要求自氧化速率控制在0.070 OD/min 左右。
%1004
min 1min 5⨯值值－第第自氧化速率＝OD OD 2.SOD 活性测定
将样液加入到Tris 缓冲溶液中，其余步骤同自氧化速率测定方法。
活力单位定义：将一定条件下使每毫升反应液自氧化速率抑制50%的酶量定义为一个单位（u ）。
样品质量样液体积样品稀释倍数自氧化速率速率自氧化速率－样液氧化＝活力（⨯⨯⨯⨯5.4%50%100)/SOD ml u。
胞外抗氧化酶类酶活力的测定
原理:在碱性条件下,邻苯三酚发生自氧化反应,并产生O2-,在SOD存在下,自氧化反应受到抑制。
参考邻苯三酚测活法(Marklund 法)孙 [66]，按下表加入0.1M Tris-HCl（PH 8.0,内含1mM EDTA）和ddH2O，25℃恒温水浴20 min，加入1 mL 待测液后加入25℃预热的邻苯三酚溶液，摇匀，立即于320nm测吸光值A320，每0.5 min测定一次，持续测到5 min。
邻苯三酚自氧化法测定SOD酶活力
酶活力的定义为：温度25 ℃，pH 8.0，波长320 nm处，在每毫升反应液中，每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达50％的酶量为1个酶活力单位，酶活力按下式计算。
单位菌体SOD酶活力（U/g）=
1
-
50%
A A
V N V A
V W
∆∆
⨯⨯⨯∆
⨯⨯
邻菌
邻
A∆
邻:1分钟邻苯三酚自氧化时A320的变化量；A∆
菌：加入待测液后1分钟邻苯三酚氧化
时A320的变化量；V：待测液总体积；N：待测液稀释倍数；V0：加入的待测液的体积;W:菌体重；V1：反应总体积。
185第11卷 第5期 2009 年 5 月辽宁中医药大学学报JOURNAL OF LIAONING UNIVERSITY OF TCMVol. 11 No. 5 May，2009邻苯三酚法测定3种食用菌超氧化物歧化酶（SOD）活性张中林1，孙宏伟2，郑剑玲1，李 岩1，王美惠1，段 薇1（1.辽宁中医药大学职业技术学院，辽宁 沈阳 110101；2.辽宁中医药大学，辽宁 沈阳 110032）摘 要：目的：比较3种食用菌中超氧化物歧化酶（SOD）活性。
方法：选取辽宁省农科院食用真菌研究所提供的3种鲜菌菇，采用邻苯三酚法对食用菌进行SOD 活性的测定。
结果：3种食用菌中SOD 酶活性均为阳性。
结论：3种食用菌SOD 酶活性依次递增顺序为鲜金针菇、滑子菇、草菇。
关键词：超氧化物歧化酶；邻苯三酚；食用菌中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1673-842X (2009)05- 0185- 02Determination of the Superoxide Dismutase in Three Typesof Edible Fungi by Hepatocyes Autoxidation ZHANG Zhong-lin 1, SUN Hong-wei 2，ZHENG Jian-ling 1, LI Yan 1，WANG Mei-hui 1，DUAN Wei 1（1.Vocational and Technical Education College of Liaoning University of TraditionalChinese Medicine ,Shenyang 110101, Liaoning,China；2. Liaoning University ofTraditional Chinese Medicine，Shenyang 110032, Liaoning, China）Abstract：Objective :To compare the superoxide dismutase （SOD ）activities of the three types of edible fungi. Methods : Fresh edible fungi were chosen from edible fungi institute liaoning academy of agricutural sciences. The SOD activities were determined by hepatocytes autoxidation. Results : It was showed that SOD activities were fond in three types of edible fungi. Conclusion : The SOD activities increases by a golden needle mushroom, pear mushroom, straw mushroom.Key words：SOD; Hepatocytes Autoxidation ; Edible Fungi 收稿日期：2008-12-02作者简介：张中林 (1963-) ，女，辽宁沈阳人，实验师，学士，主要从事免疫生化工作。
3经验交流3邻苯三酚自氧化法测定SOD活性中测定波长的选择孙雪奇,陈齐英,别小琳(四川省药品检验所,四川成都610034)提要:用岛津UV-240型、260型和T-1901紫外可见分光光度计进行实验,确定邻苯三酚自氧化法测定S OD活性的最适波长非文献使用的420nm和325nm,而应为320nm。
关键词:邻苯三酚自氧化法;S OD活性;波长中图分类号:R917文献标识码:B文章编号:1006-0103(2004)05-0404-02 超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,S OD)为体内自由基的清除剂,在生物体的正常代谢中起重要作用,其活性测定常用邻苯三酚自氧化法[1]。
该方法主要是通过测定邻苯三酚自氧化前4min内, S OD对自氧化初始中间产物增加的抑制作用来测定S OD活性。
文献报道的测定波长主要有420nm[1]和325nm[2]。
为探讨初始中间产物的吸收峰位置,进而确定测定波长,特对此进行了研究。
1 实验部分111 仪器与试剂 UV-260和UV-240紫外可见分光光度计(日本岛津公司);T-1901紫外可见分光光度计(上海科学仪器厂)。
试剂均为国产分析纯。
112 方法 吸取4.5ml100mm ol・L-1的T ris-HCl缓冲液(pH812)和4146ml蒸馏水,混匀后置25℃水浴中20min,立即加入在25℃预热的30mm ol・L-1邻苯三酚40μl(10mm ol・L-1的HCl溶液配制),立即混匀,迅速倒入比色池中,以10mm ol・L-1的HCl溶液为空白,分别用上述3种型号的紫外可见分光光度计测定邻苯三酚自氧化中间产物的吸光度。
113 结果 UV-240紫外可见分光光度计测定可知,邻苯三酚自氧化初始中间产物的吸收峰在320～319nm 处。
T-1901和UV-260紫外可见分光光度计两种仪器测得的λmax均出现在320nm波长处,此时在420nm处吸光度还很小,到5min时吸光度<011,可见420nm处吸光度的变化不能反映中间产物的积累,因此,用420nm进行S OD酶活性测定是不正确的。
大蒜中超氧化物歧化酶的提取及其酶活力测定一、实验目的：⒈掌握SOD酶的提取、分离、检测一般步骤。
⒉了解酶在提取过程中的两个参数：回收率、纯化倍数。
⒊掌握离心机的使用。
二、实验原理：邻苯三酚在碱性条件下可迅速自氧化,释放出O2-,生成带色的中间产物,在420nm有最大吸收峰。
邻苯三酚自氧化产生的中间产物在40s-3min这段时间，生成物与时间有较好的线性关系。
颜色深→SOD逐渐增多→颜色浅，即酶活力越大，颜色越浅。
三、实验材料及试剂：大蒜、磷酸缓冲液（PH7.8, 0.05mol/l）、氯仿—乙醇混合液、冷丙酮、邻苯三酚（45mmoL/L）(焦性没食子酸)、浓盐酸四、操作步骤：1、SOD提取：称取5g大蒜蒜瓣,加入石英砂研磨破碎细胞，加入15ml的PH7.8 0.05mol/L的磷酸缓冲液，研磨搅拌20分钟，使SOD充分溶解，6000rpm 离心，弃去沉淀，得上清液。
(留出1ml备用,准确量取剩余上清液体积,记录)2、除杂蛋白：提取液加入1/4体积的氯仿－乙醇混合液搅拌10分钟，6000rpm 离心15min去沉淀，得粗酶液。
（取1ml粗酶液备用,精确测量剩余粗酶液体积）3、SOD酶的沉淀分离：剩余的粗酶液中加入等体积的冷丙酮，搅拌15min，6000rpm 离心15min，得到SOD酶沉淀。
将沉淀每管先加2ml磷酸缓冲液，溶解后在加3ml 混匀。
6000rpm离心15min，取上清得到SOD酶液。
取1ml备用，其余量取体积。
4、粗酶液活性测定（邻苯三酚法）提取液、粗酶液、酶液中SOD活力检测，具体步骤如下。
加入邻苯三酚后迅速混匀,准确计时4min,加一滴浓盐酸停止反应,420nm测吸光值.5、溶液中可溶性蛋白含量测定：分别从1ml 备用的提取液、粗酶液、酶液各取0.3ml按以下倍数稀释,260nm/280nm测定吸光值,按公式计算蛋白质浓度.提取液稀释:50 ×粗酶液稀释:20 ×酶液稀释:10 ×蛋白质浓度(mg/ml)=(1.45A280 –0.74A260) ×稀释倍数6、计算：酶活力单位U/ml=2（OD1-OD2）×5/0.1(1ml反应液中,每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达到80%时的酶量)总活力U=活力单位×总体积比活力U/mg=活力单位/蛋白质浓度纯化倍数=粗酶液(酶液)比活力/提取液比活力回收率=粗酶液(酶液)总活力/提取液总活力五、实验数据记录及结果计算：1、提取液、粗酶液、酶液体积记录(除去留下的1ml)2、420nm吸光值测定：3、稀释后的SOD提取液280nm\260nm吸光值：4、按公式计算蛋白质浓度：稀释提取液中蛋白质浓度：（1.45×0.055－0.74×0.082）×50=0.9535mg/ml 稀释粗酶液中蛋白质浓度：（1.45×0.098－0.74×0.144）×20=0.7108mg/ml 稀释酶液中蛋白质浓度：（1.45×0.030－0.74×0.040）×10=4.054mg/ml5、酶活力单位、总活力、比活力计算：6、粗酶液：纯化倍数=粗酶液比活力/提取液比活力=35.9595/15.1023=2.3811回收率=粗酶液总活力/提取液总活力=25.56/14.4×100%=177.5%酶液：纯化倍数=酶液比活力/提取液比活力=5.6167/15.1023=0.3719回收率=酶液总活力/提取液总活力=22.77/14.4×100%=158.1%。
邻苯三酚自氧化法测定超氧化物歧化酶活性的研究
摘要：目前超氧化物歧化酶(SOD)活性测定结果混乱，为提高测定结果的可比性, 对邻苯三酚自氧化法测定SOD 活性的方法进行了研究，就该活力测定体系中缓冲溶液的介质组成、浓度、pH 及所含的EDTA 量等因素对测定结果的影
响进行了探讨，根据实验结果，提出了新的改良方法.
超氧化物歧化酶(SOD)是一种特殊的金属酶, 它能催化超氧阴离子自由基(O2—)发生歧化反应, 从而能有效清除机体内超氧阴离子自由基(O2—), 是生物体重要的细胞防御系统之一, 具有防御氧毒、抗辐射、防衰老以及防治肿瘤和抗炎等药用功效[1]，超氧化物歧化酶(SOD)这一独特的生理功能使其在医药领域具有良好的应用前景,激起了人们广泛的研究热情. 自1969 年McCord 等首次发现具有活性的超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase简称SOD) 以来，众多测定SOD的方法已逐步建立起来，其中以化学法最为常用. 经典的邻苯三酚法是Marklund等[2]于1974 年发表的一种通过比色测定SOD 的简便方法. 此后，邻苯三酚法在国内外得以广泛应用. 与其他方法相比，邻苯三酚自氧化法具有操作简便，快速，试剂便宜且用量小，重复性好等优点；但文献报道的邻苯三酚自氧化法测定超氧化物歧化酶活性的测定条件各不相同，这就造成了测定结果的混乱和缺乏可比性. 为此我们对邻苯三酚自氧化法测定SOD 活性的方法进行了研究，就该测活体系中缓冲溶液的介质组成、浓度、pH
及所含的EDTA 量等因素对测定结果的影响进行了探讨.
1 原理
在碱性条件下, 邻苯三酚迅速氧化释放出超氧化物阴离子，生成有色中间产物，吸光度随之增加，使吸光度值与反应时间呈良好的线性关系. SOD 加入邻苯三酚自氧化反应体系后，催化超氧化物阴离子生成过氧化氢，使有色中间产物的生成受阻，导致吸光值下降，邻苯三酚自氧化速率降低，可作为测定SOD 活性的理论依据.
2 材料与方法（1）
2.1 试剂和主要仪器
一.试剂
0.1mol/L Tris-HCl 缓冲液(pH8.2，内含2mmol/L EDTA)：0.2mol/L Tris(内含4mmol/L EDTA)100ml 与0.2mol/L HCl44.76ml 混合，加双蒸水至200ml，调pH8.2±0.01;邻苯三酚(45mmol/L)：以10mmol/LHCl 配制成6mmol/L 溶液，存放于冰箱备用; 所用试剂均为国产分析纯; 实验用水为自制双蒸水;
二、仪器:
721型分光光度计(上海第三分析仪器厂)
操作方法
2.2 方法
2.2.1 邻苯三酚自氧化速率的测定
在试管中按表1加入缓冲液和双蒸水，于25℃恒温20min后加入25℃预热过的邻苯三酚(对照管用10mmol/L盐酸代替)，迅速摇匀，立即倾入比色杯中，在波长325nm 处每30s 测定一次吸光值A0
2.2.2 SOD 活力的测定
SOD 活性测定法按上述表1 操作，加入邻苯三酚前，先加入一定量SOD，并减少同体积双蒸水，其它操作均与上述2.2.1 相同，所测吸光度为
方法2：
一、试剂及其配制:
1.pH8.2，100mM三羟甲基氨基甲烷一二甲胂酸钠缓冲液(内含2mM二乙基三氮基五乙酸)。
以加200mM三羟甲基氨甲烷-二甲胂酸钠50ml(内含4mM二乙基三氮基五乙酸)加200mN盐酸2
2.38ml，然后用双蒸水稀释至100ml。
2.10mN盐酸
3.6mM邻苯三酚，用10mN盐酸配制，4℃保存。
4.实验用水均应用玻璃双蒸水
二、仪器:
721型分光光度计(上海第三分析仪器厂)
操作方法
1.邻苯三酚自氧化速率的测定:在试管中按表l加入缓冲液和双蒸水，25℃保温劝分钟，然后加入25℃预温的邻苯三酚(对照管用10mMHCI代替)，迅速摇匀，倒入比色杯中，在4加nm的分光光度计中，每隔半分钟测一次OD值，要求自氧化速率控制在0.060OD/分。
2.SOD或粗醉抽提液的活性浏定:
测定时按表2加样，测定步骤与测邻苯三酚的自氧化速率同。
酶活力单位定义:在1ml反应液中，每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达50%时的酶量定为一个活力单位，即420nm0.030D/分为一个活力单位。
若自氧化速率在36~65%，通常可按比例计算，不在此范围内的数值应增减样液量。
邻苯三酚自氧化的机理极为复杂，从实验来看，邻苯三酚在碱性条件下，能迅速自氧
化，释放出O易一，生成带色的中间产物。
反应开始后溶液先变成黄棕色，几分钟后遂转绿，几小时后又转变成黄色，这是因为生成的中间物不断氧化的结果。
我们测定的是邻苯三酚自氧化过程中的初始阶段，在这阶段，中间物的积累在滞后30~45秒后，就与时间成线性关系，一般线性时间维持在4，~411511。
中间产物在4幼nm时有强烈的光吸收，在有超氧物岐化酶存在时由于它能催化O玉一与H十结合生成O:和HZO:，从而阻止了中间产物的积累，因此通过计算就可求出SOD的活性。
邻苯三酚自氧化结果见图1.
邻苯三酚在碱性条件下能迅速自氧化，而在酸性环境中却相当稳定。
为了尽可能使缓冲液的pH维持恒定，要求加样量尽可能少些，因为PH变化对自氧化速率有较大的影响，见图2
实验表明:不同pH对滞后时间和线性维持时间影响不大，而对线性速率影响很大。
实验还表明，降低pH要比升高pH对速率影响更大。
测定时，要求将反应液pH严格控制在8.2，误差不得超过士0.01。
二、不同的邻苯三酚浓度对自氧化速率
的影响:图3和图4都表明:不同的邻苯三酚浓度对自氧化速率有影响。
在一定的范围内，线性速率随邻苯三酚浓度的增加而增加，见图3，这是本法的优点之一。
这样，我们就可在较大范围内选用邻苯三酚的浓度，以便更显著地
观察邻苯三酚被SOD抑制的情况。
根据图4的关系表明在温度和pH不变情况下，可以灵敏地检测贮存的邻苯三酚溶液的自氧化程度，以便决定要否新鲜配制。
三、温度对邻苯三酚自氧化的影响
实验表明，温度对邻苯三酚自氧化速率的影响远比pH要小得多。
特别在25一27.5℃时，其影响差别小于4%，基本上不变化。
这对测定带来方便。
本法测定的灵敏度与经典的黄嗓吟氧化酶法基本相同。
