体外抗氧化实验操作步骤,包括配制试剂

总抗氧化能力（FRAP 法）试剂盒说明书微量法100T/96S 注　意：正式测定之前选择2-3 个预期差异大的样本做预测定。

研究意义：测定对象中各种抗氧化物质和抗氧化酶等构成总抗氧化水平。

在生物学、医学和药学研究中常常检测血浆、血清、唾液、尿液等各种体液，细胞或组织等裂解液、植物或中草药抽提液及各种抗氧化物(antioxidant)溶液的总抗氧化能力。

测定原理：在酸性环境下，抗氧化物质还原Fe3+-三吡啶三吖嗪(Fe3+-TPTZ)产生蓝色的Fe2+-TPTZ 的能力反映了总抗氧化能力。

自备实验用品：恒温水浴锅、低温离心机、酶标仪、96 孔板和蒸馏水。

试剂组成和配制：提取液：液体120mL×1 瓶，使用前预冷。

试剂一：液体20 mL×1 瓶，避光保存。

试剂二：液体2 mL×1 瓶，4℃避光保存。

试剂三：液体2 mL×1 瓶，避光保存。

混合液(现配现用)：将试剂一、试剂二、试剂三按10:1:1 的比例混合，使用前37℃预温。

样品的制备：(1) 血清、血浆、唾液或尿液等液体样品血浆（制备时可以使用肝素或柠檬酸钠抗凝，不宜使用EDTA 抗凝）4℃，5000rpm 离心10min，取上清待测。

血清、唾液或尿液样品直接用于测定，也可以-80℃冻存（不宜超过30 d）后再测定。

(2) 组织样品按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10 的比例（建议称取约0.1g 组织，加入1mL 提取液）进行冰浴匀浆，然后10000g，4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

(3) 细胞样品按照细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1 的比例（建议500 万细胞加入1mL 提取液），冰浴超声波破碎（功率200W，超声3s，间隔10s，重复30 次）；10000g，4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

操作步骤：1、酶标仪预热30min，调节波长至593nm。

红花中黄酮类化合物的分离与体外抗氧化研究采用体外抗氧化活性（包括DPPH自由基清除法、ABTS自由基清除法和FRAP法）为导向，筛选红花抗氧化活性部位，随后对活性部位进行成分分离与抗氧化效应评价。

从红花活性部位水部位中分离得到5个成分，分别鉴定为6-羟基山柰酚-3，6，7-三-O-β-D-葡萄糖苷（1）、6-羟基山柰酚-3-O-β-芸香糖苷-6-O-β-D-葡萄糖苷（2）、6-羟基山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖苷（3）、羟基红花黄色素A（4）和脱水红花黄色素B（5）。

通过对红花不同极性部位和单体成分进行抗氧化效应比较，发现水部位的抗氧化活性较显著，从中分离得到6-羟基山柰酚糖苷类和醌式查尔酮碳苷类主要活性物质。

标签：红花；抗氧化；活性物质；6-羟基山柰酚糖苷；醌式查尔酮碳苷红花为菊科植物红花Carthamus tinctorius L.的干燥花，味辛、微苦，归心、肝经，具有活血通经、散瘀止痛的功效。

红花作为传统活血化瘀中药治疗中风、冠心病和心绞痛已有2 000多年的历史，始载于《开宝本草》[1-2]。

红花水提物制成的红花注射液收载于卫生部药品标准中药成方制剂二十册中，临床上广泛用于心血管疾病的治疗。

迄今从红花中分离得到200多种化合物，包括醌式查尔酮苷类、黄酮类、亚精胺类、生物碱类、倍半萜类、有机酸类、烷基二醇类、多炔类和甾体类等，其中很多的黄酮类和醌式查尔酮苷类成分已报道具有抗氧化和清除自由基的活性[3-4]。

现代研究发现，机体抗氧化能力降低、氧化与抗氧化失衡，会导致自由基和活性氧产生过多，而自由基和活性氧具有损伤细胞结构、氧化抗凝血酶、脂质过氧化等作用，因此抑制自由基反应和活性氧生成是缓解许多心血管疾病的重要途径[5]。

为了深入探讨红花的抗氧化活性物质，本文采用活性追踪的化学成分分离研究模式，先对石油醚、乙酸乙酯和水3个部位进行体外抗氧化效应评价，随后对活性较明显的部位进行化学成分分离及活性评价，旨在筛选获得红花抗氧化活性物质，为揭示红花药效物质与相关作用机制奠定基础。

【最新整理，下载后即可编辑】3.2.5 体外抗氧化实验发酵液的预处理：将摇瓶结束的发酵液装入无菌的10ml 离心管里，在天平上仔细平衡到10g ，在4℃，10000rpm ，离心10min ，小心转移上清液到新管子里标记备用。

（1）对超氧阴离子的清除作用 利用邻苯三酚自氧化体系测定样品对超氧阴离子的清除作用。

取50 mmol·L -1的Tris-HCI 缓冲液3 mL (pH=8.2，含有2 mmol·L -1的Na 2EDTA)，加入l mL 待检样品，于25℃保温10 min ，然后加入25 ℃预温的5 mmol·L -1的邻苯三酚0.3 mL(预先用10 mmol·L -1的盐酸配制)，精确反应4 min ，用0.5 mL 浓盐酸终止反应，测定其在320 nm 下的吸光度。

以10 mmol·L -1的盐酸作为空白调零，按如下公式计算清除率：()%100A A A -A ⨯-=对照样品空白样品对照清除率 (1)式中A 对照为未加待检样品的邻苯三酚反应体系的吸光度（用1mL 10 mmol·L -1的盐酸替代样品）；A 样品为加入待检样品后的邻苯三酚反应体系的吸光度；A 样品空白为加入待检样品后的无邻苯三酚的反应体系的吸光度（用0.3mL 10 mmol·L -1的盐酸替代邻苯三酚溶液）。

注意事项：1、 所用的两个比色皿杯子必须是石英的，上面会写着“Q ”,或“S ”，不得使用玻璃的，玻璃比色皿要么什么都不写，要么写着 “G ”。

2、 测定前要用100g 砝码和天平标定所用的移液枪插上枪头后是否精准，要求误差不超过5‰，不是5％。

3、 测定大量数据前，使用者先配制10g/L 的Vc ，做三个平行测定，精准度达到5%以内再开始正确的测定。

4、 测定时由于每个人有使用习惯和误差，中间不得换人换枪。

（2）对DPPH ·的清除作用DPPH·溶液的配制：准确称取47 mg DPPH·，用无水乙醇溶解并定容至100 mL ，避光保存(0～4℃)，使用时稀释至120 μmol·L -1。

1还原力的测定样品2ml加到2ml L磷酸盐缓冲液和2ml 1%的铁氰化钾溶液的混合液中;混合物在50℃保温20min,然后在反应混合物中加入2ml 10%的TCA,混合后以3000rpm离心10min,取上清液2ml与2ml蒸馏水以及%氯化铁在反应试管中反应,10min后测定其在700nm处的吸光值;吸光值越大表明还原力越强;注意：建议蛋白浓度以5mg/ml左右变化,例如,5之类变化;但具体情况应根据吸光值大小而定;L 的磷酸盐缓冲液的配制见附表;铁氰化钾溶液应盛装在棕色瓶中;比色皿的用法：可见光>400nm用玻璃比色皿即没有标字母或者标G的比色皿,紫外光时<400nm用石英比色皿即标Q字比色皿;2 DPPH自由基清除活性的测定将样品液添加到含mmol/L DPPH的95％乙醇中,混合,振荡,在室温下放置30min,然后在波长517nm处检测Ai;清除率计算公式为：空白为ml 95%的乙醇加入ml蒸馏水调零;式中：Ac——对照为ml DPPH溶液加上ml蒸馏水在517nm处的吸光值；Aj——样品液加上ml 95%的乙醇在517nm处的吸光值；Ai——样品液加上ml DPPH溶液在517nm处的吸光值；注意：建议酶解液蛋白浓度以2mg/ml 左右变化,如,1,2,之类变化,但是具体情况应视清除率而定,最终结果应有清除率大于50%和小于50%的情况;DPPH样品有毒,需戴口罩和手套进行操作;而且DPPH试剂很昂贵,用时注意节约;mol/L DPPH 乙醇溶液的配制：准确称取,用95%的乙醇溶液溶解并定容到100ml;3 在卵黄磷脂体系中抗氧化能力的测定以卵黄脂蛋白为底物的LPO模型反应体系包括:体积比为1:25稀释的卵黄悬液卵黄用等体积的,LPBS配成,使用前磁力搅拌10min mL、一定浓度的样品溶液、25m moll/LFeSO4溶液,用PBS缓冲液补足至;对照管除不加样液外其他试剂同前;将上述2种试管同时置37℃恒温水浴锅中保温培养1h;取出后,加入20%,静置10 min后,与对照管于3500r/min离心10min,取上清液,分别加入质量分数为%硫代巴比妥酸TBA溶液,加塞于100℃水浴15min,取出冷却;空白管以溶液代替,在532nm下测定吸光度,样品对卵黄脂蛋白LPO的抑制率表示为:SA%=Ac一AS/A C×100式中:Ac一不加样品的吸光度As一加入样品的吸光度注意：卵黄溶液不用时应放置冰箱保存;酶解液蛋白浓度以5mg/ml左右调整,但具体应视清除率大小而定,对酶解液蛋白浓度进行调整;硫代巴比妥酸溶液需放置于棕色瓶内保存;并以50m mol/L NaOH溶液配制;再在50℃水浴溶解;FeSO4溶液应以棕色瓶盛装;4 过氧化值的测定参照本食品学院林华娟等老师主编的食品分析实验讲义一书;5 超氧阴离子自由基清除率的测定邻苯三酚自氧化速率V对照：对照组和空白对照组加入4ml 蒸馏水去离子水和, mol/LTris-HCl缓冲溶液,在25℃水浴20min后,样品组加入或3m Mol/L邻苯三酚溶液,空白组以相同体积蒸馏水去离子水代替;震匀后马上在320nm处测定吸光值;迅速混匀并开始计时,每隔30 s读取吸光值,4 min后结束,以空白对照管调零;作吸光度随时间变化的回归方程,其斜率为邻苯三酚自氧化速率V对照;V对照在min~min之间,否则应调整邻苯三酚加入量样品自氧化速率V样品：样品组和空白组均加入一定浓度的样品溶液4ml, mol/LTris-HCl缓冲溶液,在25℃水浴20min后,样品组加入或3m Mol/L邻苯三酚溶液,空白组以相同体积蒸馏水去离子水代替;震匀后马上在320nm处测定吸光值;迅速混匀并开始计时,每隔30 s读取吸光值,4 min后结束,以空白管调零;作吸光度随时间变化的回归方程,其斜率为邻苯三酚自氧化速率V样品,按下式计算样品对超氧阴离子的抑制率：式中：抑制率%=V对照-V样品/V对照×100V对照－对照组邻苯三酚自氧化速率ΔA/minV样品－样品组邻苯三酚自氧化速率ΔA/min动物实验资料：摘自鹰嘴豆:抗氧化剂的抗氧化效果受到多种因素的影响,只有在生物体内具有抗氧化作用的物质才能有效的清除体内产生的自由基,才能表现出一定的生物活性;由于体外抗氧化测定方法容易操作,周期短,因此评价一种物质的抗氧化效果往往首先采用体外抗氧化体系;但体外抗氧化体系往往与人体内的生理环境相差太大,许多研究结果表明采用体外方法评价有效的抗氧化剂进入人体后却表现不出应有的抗氧化效果,因此抗氧化剂的抗氧化效果在采用体外方法进行初步评价后应采用动物实验进行体内评价;人体在正常生理代谢过程中会产生少量的含氧自由基,如超氧阴离子、羟自由基、过氧化氢等,这些自由基通过自然存在于体内的抗氧化酶如超氧化物歧化酶SOD、过氧化氢酶及抗氧化剂如抗坏血酸、维生素E组成的抗氧化系统来消除;因此,在正常状态下,体内自由基维持在一定水平并处于动态平衡中,正常量的自由基对细胞的生长、分裂、解毒等具有有益的作用,在杀菌、免疫调节等方面具有积极而重要的意义;然而,随着增龄或在某些病理状态下以及机体受到创伤时,体内抗氧化酶活性下降,从而导致机体代谢异常而骤然产生大量活性氧自由基；或由于机体抗氧化物质不足,使促氧化剂与抗氧化剂之间的平衡失常,致使自由基与机的一些生物大分子,如蛋白质、核酸、脂质等发生反应,生成大量氧化物或过氧化物,并进一步引起细胞死亡和组织损伤;业已证明,氧化损伤与衰老、肿瘤、糖尿病、动脉硬化、神经退行性病变以及人类免疫缺陷病毒HIV感染等均有密切关系;D-半乳糖诱导的亚急性衰老模型是按照衰老的代谢学说建立的,其机制与糖代谢紊乱6、D-半乳糖醇中毒7和活性氧自由基过剩有关；众多研究表明是生物体内含有半乳糖氧化酶,在催化D-半乳糖时可产生超氧阴离子自由基O2·-和H2O2；如果长期人为地给予过量D-半乳糖,使机体和细胞内自由基产生过量,除了造成组织细胞直接损伤外,还导致抗氧化酶活力下降和过氧化产物积累,从而表现出与人类自然衰老相似的生化变化、免疫功能低下、基因表达与调控异常细胞繁殖力下降及细胞退化性衰变等;有研究表明,D-半乳糖可降低人胚肺二倍体成纤维细胞HBS,从而使该细胞SOD活力降低和过氧化产物MDA增多,从而起到加速细胞老化的作用;本文在前述章节已经表明,鹰嘴豆蛋白酶解物具有体外抗氧化活性,但其在生物体内的作用效果尚不清楚;为此本章采用D-半乳糖诱导致衰老小鼠作为模型,分别以小鼠的血清、肝脏和心脏组织中的丙二醛MDA含量、超氧化物歧化酶SOD、谷胱甘肽过氧化物酶GSH-Px活性作为评价指标,探讨鹰嘴豆蛋白酶解物在生物体内的作用,为揭示鹰嘴豆蛋白酶解物对体内过氧化状态的影响,明确其物质基础和相关机制提供证据;。

脐橙黄酮体外的抗氧化作用摘要:加入不同浓度的脐橙(Citrus sinensis Osbeck)黄酮,研究脐橙黄酮体外清除活性氧自由基邻苯三酚的作用,并与维生素C､体积分数为50%的乙醇的作用进行比较｡结果表明,脐橙黄酮浓度为3.01 mg/mL时对邻苯三酚的清除率与1 mg/mL维生素C相比无显著差异(P>0.05),与体积分数为50%的乙醇及去离子水相比差异极显著(P<0.01)｡脐橙黄酮具有较强地清除体外活性氧自由基的作用｡关键词:脐橙(Citrus sinensis Osbeck);黄酮;抗氧化;活性氧自由基Study on in vitro Antioxidation of Navel Orange FlavonoidsAbstract: The in vitro reactive oxygen species scavenging activity of navel orange(Citrus sinensis Osbeck) flavonoids was studied by determining the autoxidation rate of pyrogallol after different concentration of navel oranges flavonoids was added. Vitamin C and 50% alcohol was used as compare. The results revealed no significant difference (P>0.05) between the antioxidation of 1 mg/mL vitamin C and 3.01 mg/mL navel oranges flavonoids; however, the antioxidation of navel oranges flavonoids was very significantly different(P<0.01) from that of 50% ethanol and CK, indicating that navel oranges flavonoids had strong in vitro ability in scavenging reactive oxygen species.Key words: navel oranges; flavonoids; antioxidation; superoxide radical赣南脐橙(Citrus sinensis Osbeck)营养丰富,含有人体所必需的各类营养成分｡赣南气候温暖,雨水充沛,昼夜温差大,具有得天独厚的气候资源优势,非常适宜种植脐橙,脐橙皮中含有丰富的天然黄酮类化合物[1]｡研究表明黄酮类化合物具有降脂､抗血栓､抗氧化､抗衰老､抗心率失常等作用,因而广泛用于医药､食品等行业,具有极广的开发应用前景[2-4]｡研究通过比较维生素C､乙醇和脐橙黄酮对邻苯三酚的清除率,并研究不同浓度脐橙黄酮清除活性氧自由基的作用,旨在为更加深入地研究脐橙黄酮的作用提供一定的依据｡1 材料与方法1.1 材料1.1.1 主要仪器UV-1601紫外可见分光光度计购自日本岛津公司,EYELAN-1001旋转蒸发仪购自上海爱明仪器有限公司,SHZ-JIIA型循环水式真空泵购自西安波意尔精密仪器有限公司｡1.1.2 原料与试剂橙皮粉为市售赣南脐橙果皮在50 ℃恒温烘干后粉碎过50目筛所得,纯度为99.0%的橙皮苷标准品购于中国药品生物制品检定所,三羟甲基氨基甲烷(Tris)､乙二胺四乙酸(EDTA)､邻苯三酚､维生素C､无水乙醇､NaOH､HCl 均为分析纯｡1.2 方法1.2.1 试剂的配制0.2 mol/L Tris:称取2.423 g Tris,以去离子水溶解定容至100 mL;Tris-HCI-EDTA缓冲液:50 mL 0.2 mol/L Tris与46 mL 0.1 mol/L HCl混合,内含1 mmol/L EDTA,pH 8.2,定容至100 mL;45 mmol/L邻苯三酚:称取567.5 mg 邻苯三酚,用0.01 mol/L HCI溶解定容至100 mL,溶液须临用前现配;1 mg/mL维生素C:称取50 mg维生素C,用去离子水溶解定容至50 mL｡1.2.2 样品的处理准确称取5 g样品放入圆底烧瓶中,加入100 mL体积分数为50%的乙醇,于70 ℃提取3 h,抽滤,从滤液回收乙醇,使浓缩液pH 5,静置过夜,待黄酮全部沉淀析出,离心,得黄酮[5]｡1.2.3 橙皮苷标准曲线的绘制准确称量2.238 mg纯度为99.0%的橙皮苷标准品,用含1 g/L NaOH的体积分数为75%的乙醇溶液溶解并定容于25 mL容量瓶中,摇匀,得浓度为89.52 μg/mL标准品溶液｡准确吸取该标准品溶液0.5､1.0､1.5､2.0､2.5､3.0 mL分别置于10 mL比色管中,用含1 g/L NaOH的体积分数为75%的乙醇溶液定容至刻度｡标准品溶解1 h后,以含1 g/L NaOH的体积分数为75%的乙醇溶液为空白,在360 nm波长处测定这一系列溶液的吸光度,以吸光度(y)为纵坐标､橙皮苷浓度(x)为横坐标作标准曲线[6],该标准曲线的回归方程=0.018 1x-0.069 2,r=0.999 7｡1.2.4 样品中黄酮含量的测定将通过方法1.2.2所得的黄酮用含1 g/L NaOH的体积分数为75%的乙醇溶液溶解并定容于50 mL容量瓶中,摇匀,用移液管精确移取0.1 mL于10 mL比色管中,用方法1.2.3测定其在360 nm 的吸光度,然后按照下述公式计算赣南脐橙皮中的黄酮得率:黄酮得率=[(y+0.069 2)×5 000×10-6/(0.018 1×5)]×100%｡式中,y为黄酮溶液在360 nm处的吸光度;5 000为黄酮的稀释倍数;10-6为μg与g之间的单位换算;5为样品质量(g)｡计算得黄酮得率为3.01%,黄酮浓度为3.01 mg/mL｡1.2.5 试验设计1)不同清除剂对邻苯三酚的清除率｡取4个试管标记为1､2､3､4,每组中分别加入4.5 mL pH 8.2的Tris-HCI-EDTA缓冲液,于25 ℃水浴预热20 min,然后在1､2､3､4号管中分别加入3.01 mg/mL脐橙黄酮､1 mg/mL维生素C､体积分数为50%的乙醇和去离子水各0.1 mL,再各加入邻苯三酚0.4 mL,摇匀,于321 nm处测定作用1､2､4､6､8､10 min时的吸光度,3次重复｡清除率d=[(A空白-A样品)/A空白]×100%｡2)不同浓度脐橙黄酮对邻苯三酚的清除率｡将通过方法1.2.2所得的黄酮用含1 g/L NaOH的体积分数为75%的乙醇溶液溶解并定容于50 mL容量瓶中,摇匀;分别精密量取该溶液,用含1 g/L NaOH的体积分数为75%的乙醇溶液稀释制成0.3､0.6､0.9､1.2､1.5､1.8､2.1､2.4､2.7和3.0 mg/mL的脐橙黄酮溶液｡仿前述“不同清除剂对邻苯三酚的清除率”的研究方法,研究不同浓度脐橙黄酮对邻苯三酚的清除率｡1.2.6 统计学处理数据使用SPSS 11.5软件统计｡2 结果与分析2.1 不同清除剂对邻苯三酚的清除率由表1可知,作用l､2､4､6､8､10 min后,3.01 mg/mL脐橙黄酮对邻苯三酚的清除率分别为39.93%､45.47%､34.96%､28.95%､24.73%､19.92%,随着作用时间的延长,清除率先升后降,平均清除率为32.33%±9.60%,1 mg/mL维生素C和体积分数为50%的乙醇对邻苯三酚的平均清除率分别为39.07%±4.78%和7.99%±4.22%｡3.01 mg/mL脐橙黄酮对邻苯三酚的清除率与体积分数为50%的乙醇及去离子水(对照)相比差异极显著(P<0.01),与1 mg/mL维生素C间无显著差异(P>0.05)｡2.2 不同浓度脐橙黄酮对邻苯三酚的清除率由图1可知,随着脐橙黄酮浓度的增大,对邻苯三酚的清除率提高,当脐橙黄酮浓度为0.3 mg/mL时,对邻苯三酚的清除率低于10%,说明提取物对邻苯三酚的清除率与脐橙黄酮浓度有关｡3 结论与讨论上述结果表明,脐橙皮提取物有类似超氧化物歧化酶(SOD)的作用,能较强地清除活性氧自由基(O2-·),作用效果随着浓度的增加而增强,呈非线性的剂量关系｡橙皮苷是柑橘黄酮中最重要的一种,抗氧化活性较低,需要在较高浓度下才表现出一定的抗氧化活性｡试验中脐橙黄酮和维生素C都有很强的体外清除活性氧自由基的作用,可应用于抗氧化保健食品中｡脐橙黄酮浓度为3.01 mg/mL时对邻苯三酚的清除率与1 mg/mL维生素C相比无显著差异(P>0.05),说明脐橙黄酮浓度比维生素C浓度大才达到相似的清除率｡因此,脐橙作为赣南地区的特产,它将是一种有应用前景的活性氧自由基清除剂,其药用价值可被大力开发利用｡参考文献:[1] 蔡定建,谢志鹏,罗六保,等. 脐橙皮中黄酮类化合物与果胶的分离和提取研究[J]. 分析测试技术与仪器,2006,12(4):239-242.[2] 刘成伦. 黄酮类化合物抗氧化性质的研究进展[J]. 食品研究与开发,2006,27(5):158-168.[3] 张玉萌. 黄酮类化合物抗肿瘤作用分子机制研究进展[J]. 中国药物应用与监测,2006(6):50-53.[4] 王玮,王琳. 黄酮类化合物的研究进展[J]. 沈阳医学院学报,2002,4(2):115-119.[5] 张国文,杨佳,何力,等. 醇法提取赣南脐橙皮中黄酮类化合物的工艺研究[J].南昌大学学报(工科版),2009,31(3):205-209.[6] 卢静华,王亚娟,于玲. 陈皮中橙皮苷超声提取工艺研究[J]. 时珍国医国药,2006,17(4):604-607.。

抗氧化酶测定实验方法抗氧化酶是一类能够抵御细胞对氧自由基的毒性的酶。

抗氧化酶包括超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）等。

这些酶在细胞内能够将有害的氧自由基转化为无害的化合物，从而起到保护细胞免受氧自由基反应的毒性作用。

因此，测定抗氧化酶的活性能够反映细胞对氧自由基的抵御能力，对研究氧化应激、疾病发生机制等具有重要意义。

以下是一种常用的抗氧化酶测定方法的详细步骤：实验材料和试剂：1.组织样本或细胞培养物2.生理盐水（PBS）3. 超氧化物歧化酶(Abfrontier, LF-MA0011, 200U/mg, 冻干粉)4. 过氧化氢酶(Sigma, P2927, ≥2,000,000 units/mg protein, 溶于水)5. 谷胱甘肽过氧化物酶(Sigma, G5911, ≥300 units/mg protein,冻干粉)6. 过硫酸铵（Sigma, A9294）7.磷酸盐缓冲液(pH7.4，0.1M)8.丙酮9. 硫酸(Sigma, 1.84 M)10. 精氨酸(Sigma, A8094)11. 苯胂(Sigma, A8731)12. 硝基蓝色素(Sigma, N-5511)14. 高锰酸钾(Sigma, S2547)16. 硝基咪唑(NBT，Solarbio, S8190)17. EDTA二钠(Sigma, E6635)18. BSA(Sigma, A7906)19. 氯化三联氨(Sigma, A2251)20. Tris缓冲液(pH 8.0，0.1M)21. 高吉人(ABClonal, HRP-6002，5,000 IU/mg, 冻干粉)23.氯仿24.醋酸乙酯26.乙酸钠28. 脑磷脂(纯度≥98%，Shenggong, 1003J)30.SDS-试剂盒步骤：1.制备样本：将组织样本或细胞培养物均匀取样，使用PBS洗涤并平均分配到多个离心管中。

13份样品抗氧化实验第二部分：实验方法一：DPPH 自由基清除能力的测定[参考文献] 【Shcherba, V. V., Babitskaia, V. G., Kurchenko, V. P., Ikonnikova, N. V. and Kukukianskaia, T. A. Antioxidant features of fungal melanin pigments [J]. Prikl Biokhim Mikrobiol, 2000, 36: 569~574.】1：试剂配制：0.1mM DPPH-甲醇溶液200毫升。

DPPH的质量=0.2*0.1*0.001*394.42*1000=7.8884毫克；0.05 mol/L Tris-HCl 缓冲液(pH 7.4) ：Tris的质量=0.1*50*0.001*121.14=605.7毫克，加入0.1mol/L的盐酸42毫升再加水到100毫升并用广范PH试纸测得PH=7.4 。

二：对羟自由基清除能力的测定[参考文献]【Smironff N,Cumbes Q J.Hyroxyl radical scavenging activity of compatible solutes[J].Phytochemistry, 1989,28（3）:1057-1060】1：试剂配制配制7.5毫摩尔每升硫酸亚铁溶液40毫升，硫酸亚铁的质量=7.5*0.001*40*0.001*278=83.4毫克；配制7.5 mmol/L 的邻二氮菲溶液40毫升。

邻二氮菲的质量的磷酸盐缓冲溶液200毫升；0.1%的H2O2溶液60毫升，（市售过氧化氢含量为质量体积百分比30% ），吸取市售过氧化氢0.2毫升滴入到60毫升的纯净水中。

第三部分：相关数据检测及作图Compounds (mg)S c a v e n g i n g c a p a c i t y （%/m g ）。

抗氧化剂的测定人工合成的抗氧化剂有：（1） BHT 2，6-二叔丁基对甲酚（2） BHA 叔丁基对羟基茴醚（3）PG 没食子酸丙酯近几年也合成了一些新的抗氧化剂如TBHQ, DBHA等还有一些新的天然抗氧化剂，但投入使用的不多。

⑴叔丁基对羟基茴香醚结构特点：1）对热稳定2）在弱碱性中不破坏（作为焙烤食品用的抗氧化剂）这种抗氧化剂在日本是禁止的⑵ 2，6-二叔丁基对甲酚结构特点：（1）抗氧化性强于BHA；（2）毒性大于BHA这种抗氧化剂在美国是禁止使用的⑶没食子酸丙酯结构特点：（1）耐热性强；（2）溶于油脂，酒精等有机溶剂中以上三种人工合成抗氧化剂我国都在使用，抗氧化性最强是混合使用，二种抗氧化剂混合使用效果最好，但要加增效剂，常用的增效剂有柠檬酸，抗败血酸，磷酸等可以提高抗氧化剂的作用。

而增效剂主要是络合重金属离子，使氧化性获得新生。

我们从以上三种氧化剂结构中可以看出，它们都有苯酚，所以我们要找抗氧化剂必须找酚类衍生物，我们要了解抗氧化剂的机理，它们怎样阻止氧化。

抗氧化剂的抗氧化机理。

油脂氧化机制（1）链引发；（2）链传播；（3）终止从RH代替脂肪或者脂肪酸第一步： RH→R*.+H*第二步：脂肪RH受热或光金属第三步：R*+O2→ROO* RO2*+RH→ROOH+R*第四步 R*+ R*→R-R R*+ RO2*→RO2R第二步脂肪RH受热或光金属催化剂等分解成不稳定的游离基R和H, 游离基当与空气中的O2时生成过氧化物游离基过氧化物，游离基在于脂肪RH生成氢过氧化物和游离基R，产生的游离基与游离基相互结合，使反应终止，随着反应的进行，更多脂肪分子转变成氢过氧化物，氢过氧化物进一步变化，产生更多的游离基和稳定的终产物，这些就导致了油脂完全的变质的酸败味的形成和种种的反应生成。

抗氧剂的机制（以AH代表抗氧剂）AH+ R*→RH+A*抗氧化剂的作用机制是遇到游离基后将游离基破坏，也就是说反映关键是把R*，RO2*作用掉，这样就终止了链传播，延长了酸败。

1. 供试液的制备：将纯化后的黄酮用蒸馏水（可加SDS 促溶）稀释后，分别配制10、20、30、40、50、60、70 μg/mL 溶液，4℃保存备用。

（根据实际情况调整浓度）2. 总黄酮的测定：标准曲线的绘制：称取芦丁10.00 mg 至50 mL 容量瓶，加60%乙醇使之溶解定容至刻度，摇匀，即得芦丁标准溶液（0.2 mg/mL ）。

准确吸取芦丁标准溶液0、0.5、1.0、1.25、1.5、2.0 mL （相当于芦丁0、0.1、0.2、0.25、0.3、0.4 mg ），并用相应60%乙醇溶液相应补足2.0 mL ，移入10 mL 刻度比色管中，加5%亚硝酸钠溶液0.2 mL ，振摇后放置6 min ，加入10%硝酸铝溶液0.2 mL 摇匀后放置6 min ，加1.0 mol/L 氢氧化钠溶液2.0 mL 。

摇匀，放置15 min ，于510 nm 波长处测定吸光度，以芦丁含量（mg ）为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制标准曲线。

样品测定：吸取适当稀释的待测液2.0 mL ，按标准曲线制备操作步骤于510nm 处进行吸光度的测定（样液如有沉淀，应过滤后测定）。

结果计算：根据标准工作曲线，求出相当于样品吸光度的芦丁含量，按下式求出总黄酮含量：100103121⨯⨯⨯⨯=V m V m X 式中：X ——样品中总黄酮含量，g/100g ；m 1——根据标准曲线计算出待测液中黄酮的量，mg ；m ——样品质量，g ；V 1——样品提取液测定用体积，mL ；V 2——样品提取液总体积，mL 。

3. 还原能力的测定：于试管中加入1.0 mL 样液(不同质量浓度的待测物溶液)或蒸馏水，再分别加入1.0 mL 磷酸缓冲溶液（0.2 mol/L, pH6.6）及1.0 mL 铁氰化钾水溶液(1%)，50℃水浴20 min 后取出快速冷却，加入1.0 mL 三氯乙酸水溶液(10%)，摇匀，5000 rpm/min 离心5 min 。