花药离体培养final

（二）材料的消毒
1、花蕾用V/V为70%的酒精浸泡 秒 、花蕾用 的酒精浸泡 为 的酒精浸泡30秒 2、无菌水清洗 、 3、无菌吸水纸吸干花蕾表面的水分 、 4、放入质量分数为 质量分数为0.1%的氯化汞溶液中 的氯化汞溶液中 、放入质量分数为 的氯化汞 2~4分钟（也可质量分数为 的次氯酸 分钟（ 质量分数为1%的次氯酸 分钟 也可质量分数为 钙溶液或饱和漂白粉溶液） 钙溶液或饱和漂白粉溶液） 5、无菌水冲洗 、无菌水冲洗3~5次 次 用于培养花药，实际上多数未熟， 用于培养花药，实际上多数未熟，由 于它的外面有花萼、花瓣或颖片保护， 于它的外面有花萼、花瓣或颖片保护， 通常处于无菌状态， 通常处于无菌状态，所以只要将整个花 蕾或幼穗消毒即可。 蕾或幼穗消毒即可。
（三）接种和培养
灭菌后花蕾，要在无菌条件下除去萼片和花瓣， 灭菌后花蕾，要在无菌条件下除去萼片和花瓣， 并立即将花药接种到培养基上。在剥离花药时， 并立即将花药接种到培养基上。在剥离花药时，要尽 量不损伤花药（否则接种后， 量不损伤花药（否则接种后，容易从受伤部位产生二 倍体的愈伤组织），同时还要彻底去除花丝， ），同时还要彻底去除花丝 倍体的愈伤组织），同时还要彻底去除花丝，因为与 花丝相连的花药不利于愈伤组织或胚状体的形成。 花丝相连的花药不利于愈伤组织或胚状体的形成。 通常每瓶接种花药7 10个 温度控制在25℃左右， 25℃左右 通常每瓶接种花药7-10个，温度控制在25℃左右， 不需要光照。幼小植株形成后才需要光照。 不需要光照。幼小植株形成后才需要光照。 一般经过20 30天培养后 会发现花药开裂， 20- 天培养后， 一般经过20-30天培养后，会发现花药开裂，长 出愈伤组织或释放出胚状体。 出愈伤组织或释放出胚状体。将愈伤组织及时转移到 分化培养基上，以便进一步分化出再生植株。 分化培养基上，以便进一步分化出再生植株。
材料的选择： 材料的选择： 花期早期时的花药比后期的更容易产生花 粉植株。一般， 粉植株。一般，月季的花药培养时间选在五月 初到五月中旬，即月季的初花期。 初到五月中旬，即月季的初花期。 选择合适的花粉发育时期也是提高诱导成 功率的重要因素。一般来说，在单核期， 功率的重要因素。一般来说，在单核期，细胞 核由中央移向细胞一侧的时期，花药培养成功 核由中央移向细胞一侧的时期， 率最高。 率最高。 为了挑选到单核期的花药， 为了挑选到单核期的花药，通常选择完全 未开放的花蕾。 未开放的花蕾。
• 一、课题目标 • 说出被子植物花粉发育的过程及花药培养 产生花粉植株的两种途径， 产生花粉植株的两种途径，说出影响花药 培养的因素，学习花药培养的基本技术， 培养的因素，学习花药培养的基本技术， 尝试用月季或其他植物的花药进行培养。 尝试用月季或其他植物的花药进行培养。 • 二、课题重点与难点 • 课题重点：选取适宜的培养材料和培养基。 课题重点：选取适宜的培养材料和培养基。 • 课题难点：选取适宜的培养材料和培养基。 课题难点：选取适宜的培养材料和培养基。
• 为什么花瓣松动会给材料 的消毒带来困难？ 的消毒带来困难？ • 答：花瓣松动后，微生物 花瓣松动后， 就可能侵入到花药， 就可能侵入到花药，给材 料的消毒带来困难。 料的消毒带来困难。
实验操作
• • • • • （一）材料的选取 染色镜检 （二）材料的消毒 酒精、氯化汞、 酒精、氯化汞、次氯酸钙 （三）接种和培养
结果分析与评价
（一）材料的选取
选择花药时， 选择花药时，一般通过镜检来确定其 中的花粉是否处于适宜的发育期。 中的花粉是否处于适宜的发育期。 最常用的方法有醋酸洋红法 但是， 醋酸洋红法。 最常用的方法有醋酸洋红法。但是， 某些植物的花粉细胞核不易着色， 某些植物的花粉细胞核不易着色，需采用 焙花青-铬矾法，这种方法能将花粉细胞核 焙花青 铬矾法， 铬矾法 染成蓝黑色 蓝黑色。 染成蓝黑色。
基础知识 • （一）被子植物的花粉发育
• 被子植物的花的结构是怎样的？ 被子植物的花的结构是怎样的？ • 观察下图，和减数分裂比较，你能指出对应 观察下图，和减数分裂比较， 的时期吗？又有何特点？ 的时期吗？又有何特点？
被子植物的花粉Βιβλιοθήκη 育 花丝雌蕊： 雌蕊花药：囊状结构， 花药：囊状结构，内有很多花粉粒 花粉是小孢子母细胞经过减数分裂而形成 花粉是小孢子母细胞经过减数分裂而形成 因此，花粉是单倍体的生殖细胞。 的，因此，花粉是单倍体的生殖细胞。 花粉的发育要经历：四分体时期、单核期、 花粉的发育要经历：四分体时期、单核期、 双核期
• 练习 练习1.
• 答：F2代紫色甜玉米的基因型组成可能为 代紫色甜玉米的基因型组成可能为 Aasusu或AAsusu。如果运用常规育种方法， 或 。如果运用常规育种方法， 将F2代中的紫色甜玉米与白色甜玉米 代中的紫色甜玉米与白色甜玉米 （aasusu）进行测交，可以选择出基因型为 ）进行测交， AAsusu纯种紫色甜玉米 AAsusu纯种紫色甜玉米。但这种方法比较 纯种紫色甜玉米。 繁琐，耗时也较长， 繁琐，耗时也较长，需要至少三年的选种和 育种时间。如果利用花药培养的技术，在F1 育种时间。如果利用花药培养的技术， 代产生的花粉中就可能有Asu的组合，再将 的组合， 代产生的花粉中就可能有 的组合 花粉植株进行染色体加倍， 花粉植株进行染色体加倍，就可以直接得到 紫色甜玉米的纯合体（ ）。这种方 紫色甜玉米的纯合体（AAsusu）。这种方 ）。 法可以大大缩短育种周期。 法可以大大缩短育种周期。
• （二）产生花粉植株的两种途径 • 有哪两种途径？原因是什么？ 有哪两种途径？原因是什么？
花药中 的花粉 花药中 的花粉
胚状体
丛芽 生根 移栽
愈伤组织
丛芽
花药培养产生花粉植株的两种途径
• （三）影响花药培养的因素
• • • • • 1、材料的选择 、 不同植物 花期早期－初花期） 同一植物的不同生理状况（花期早期－初花期） 单核居中期与靠边期之间） 合适的花粉发育期（单核居中期与靠边期之间） 此外，植株生长条件、材料低温预处理、 此外，植株生长条件、材料低温预处理、接 种密度等 • 2、培养基的组成 、
④1花粉母细胞 花粉母细胞
减数
4个小孢子 个小孢子
有丝
4个花粉管细胞核 个花粉管细胞核 4个生殖细胞核 个生殖细胞核
有丝
8个精子 个精子
人工种子
又称人造种子、合成种子或无性种子， 又称人造种子、合成种子或无性种子， 就是将组织培养所产生的体细胞胚 体细胞胚、 就是将组织培养所产生的体细胞胚、不定 顶芽、腋芽或小鳞茎等繁殖体， 芽、顶芽、腋芽或小鳞茎等繁殖体，包裹 在能提供营养的胶囊（人造胚乳） 在能提供营养的胶囊（人造胚乳）里，再 在外面包上一层具有保护功能和防止机械 损伤的外膜（人造种皮）， ），造成一种类似 损伤的外膜（人造种皮），造成一种类似 种子的结构，能在一定的条件下萌发生长， 种子的结构，能在一定的条件下萌发生长， 形成完整植株。 形成完整植株。
如果花药开裂释放出胚状体，则 如果花药开裂释放出胚状体， 一个花药内就会产生大量幼小植株， 一个花药内就会产生大量幼小植株， 必须在花药开裂后尽快将幼小植株 分开，分别移植到新的培养基上， 分开，分别移植到新的培养基上， 否则这些植株将很难分开。 否则这些植株将很难分开。 在花药培养中，特别是通过愈伤 在花药培养中， 组织形成的花粉植株，常常会出现 组织形成的花粉植株， 染色体倍性的变化。（主要原因是 染色体倍性的变化。（主要原因是 。（ 营养核和生殖核融合造成的。） 营养核和生殖核融合造成的。） 造成的
注意： 注意：
①二核花粉粒：成熟的花粉粒中，只含花粉管细胞核和生殖细胞 二核花粉粒：成熟的花粉粒中， 。（精子在花粉管中形成 精子在花粉管中形成） 核。（精子在花粉管中形成） ②三核花粉粒：有些植物的花粉，在成熟前，生殖细胞进行一次 三核花粉粒：有些植物的花粉，在成熟前， 有丝分裂，形成两个精子，这样的花粉在成熟时， 有丝分裂，形成两个精子，这样的花粉在成熟时，含有一个营养 核和两个精子。 核和两个精子。 ③两个精子和一个营养核的基因型相同。 两个精子和一个营养核的基因型相同。
• 练习 练习2. • 答：植物组织培养技术与花药培养技术 的相同之处是：培养基配制方法、 的相同之处是：培养基配制方法、无菌 技术及接种操作等基本相同。 技术及接种操作等基本相同。 • 两者的不同之处在于：花药培养的选材 两者的不同之处在于： 非常重要，需事先摸索时期适宜的花蕾； 非常重要，需事先摸索时期适宜的花蕾； 花药裂开后释放出的愈伤组织或胚状体 也要及时更换培养基；花药培养对培养 也要及时更换培养基； 基配方的要求更为严格。 基配方的要求更为严格。这些都使花药 培养的难度大为增加。 培养的难度大为增加。
植物组织培养技术与花药培养技术的异同点
项目 相同点 不同点
外植体为体细胞， 植物组织培养 离体的植物组织经 外植体为体细胞， 技术 脱分化形成愈伤组 染色体数无需加 倍 再分化成丛芽， 织，再分化成丛芽， 。 诱导出根，然后进 诱导出根， 取材为花药， 取材为花药，培养 花药培养技术 行移栽。 行移栽。
的为单倍体幼苗， 的为单倍体幼苗， 植株弱小， 植株弱小，高度不 育，必须用秋水仙 素处理，使染色体 素处理， 加倍， 加倍，恢复正常植 株的染色体数， 株的染色体数，而 且为纯种。 且为纯种。
• 三、课题背景分析 • 课题背景介绍了花药培养的历史以及花药培养 在育种工作上的意义。 在育种工作上的意义。有条件的话可以 尝试某 种植物的花药培养。 种植物的花药培养。 • 被子植物的花粉发育 • 知识要点：1.花粉是单倍体生殖细胞；2.花粉 知识要点： 花粉是单倍体生殖细胞 花粉是单倍体生殖细胞； 花粉 的发育要经历不同的时期。 的发育要经历不同的时期。 • 产生花粉植株的两种途径 • 知识要点：花药培养产生花粉植株的两种途径。 知识要点：花药培养产生花粉植株的两种途径。 • 影响花药培养的因素 • 知识要点：选取适宜的材料和培养基组成是花 知识要点： 粉植株诱导成功的关键。 粉植株诱导成功的关键。