植物花药培养

3.外植体的预处理 3.外植体的预处理
在花药接种之前，先对其进行预处理往往可以提高诱导 率。适宜的温度和时间处理可改善小抱子代谢活动，并 利于小抱子适应离体后的培养环境，促使大部分的小抱 子得以正常生长。处理时间过长，超过小抱子耐受力， 导致小抱子受伤，细胞核解体，反而降低了材料的出愈 率，影响绿苗分化% 处理时间过短，由于母体与离体培 养条件相差悬殊，小抱子在生理上不适应，同样也会造 成小抱子死亡或发育迟缓。
二、预处理与消毒
1.材料的预处理：最常用的是低温预处理，将
采取的新鲜花药用湿纱布包裹后再用塑料袋套 起，放在冰箱中预处理。不同材料所需的温度 和时间不同。 低温预处理是草莓花培养中的一个重要步骤， 其作用主要是改善花粉的生理状态， 延缓花粉 退化，提高内源激素的水平，启动雄核发育， 能显著提高花药诱导率。
75﹪酒精溶液的制备：
倒取150mL无水乙醇于500mL中，加入50mL的 蒸馏水，用玻璃棒搅拌均匀。
MS培养基（单位：mg/L）
NH4NO3 KNO3 KH2PO4 MgSO4·H2O CaCl2·2H2O FeSO4·7H2O Na2-EDTA MnSO4·4H2O 1650 1900 170 370 440 27.85 37.25 22.3 ZnSO4·7H20 H3BO3 KI Na2MoO4·2H2O CuSO4·5H2O CoCl2·6H20 甘氨酸 盐酸硫胺素 8.6 6.2 0.83 0.25 0.025 0.025 2 0.4 盐酸吡哆醇 盐酸 肌醇 蔗糖 琼脂 PH 0.5 0.5 100 30000 1000 5.8
2.培养
通常每瓶接种花药7-10个，温度控制在25℃左右，不需 要光照。幼小植株形成后才需要光照。 一般经过20-30天培养后，会发现花药开裂，长出愈伤 组织或释放出胚状体。将愈伤组织及时转移到分化培养 基上，以便进一步分化出再生植株。
花药培养过程
6.影响植物花药培养的主要因素
1.培养材料基因型 培养材料基因型 2.花药的发育时期 花药的发育时期 3.外植体的预处理 外植体的预处理 4.培养基成分 培养基成分 5.培养方式与环境 培养方式与环境
2.材料的消毒
1、先用自来水将花药冲洗干净，用纱布轻轻擦干，然后用70%-75%的 酒精浸润10-30s 2、无菌吸水纸吸干花药表面的水分 3、放入质量分数为0.1%的氯化汞溶液中15min （也可质量分数为1% 的次氯酸钙溶液或饱和漂白粉溶液） 4、无菌水冲洗3-5次
用于培养花药，实际上多数未熟，由于它的外面有花萼、 花瓣或颖片保护，通常处于无菌状态，所以只要将整个 花蕾或幼穗消毒即可。
4.培养基成分 4.培养基成分
基本培养基 基本培养基种类及无机盐成分配比的变化对花药离体 培养中愈伤组织的产生有决定性的影响。无机成分中铁 对多种植物花药培养中愈伤组织的产生有重要影响，螯 合铁被认为是必须的。另外，培养基中的有机成分对愈 伤组织的诱导同样具有重要作用。 碳源 在花药培养时，蔗糖是最常用的碳源。蔗糖浓度 在花药诱导单倍体植株过程中起重要作用， 同时它还起着调节培养基渗透势的作用。
试剂 BA 6-苄基氨基嘌呤 （细胞分裂素） NAA 萘乙酸 （生长素） 2,4-D 2,4-氯苯氧乙酸 （生长素） 肌醇、水解酪蛋白、蔗糖、琼脂等
4.试剂（包括培养基） 4.试剂（包括培养基）配制 试剂
0.1﹪升汞溶液的制备：
用电子天平称取0.1g氯化汞，放入装有100mL水 烧杯中，用玻璃棒搅拌，使氯化汞充分溶解。
1.培养材料基因型 1.培养材料基因型
材料的遗传背景对花药培养的影响很大，不同 基因型的材料，花药诱导率不同（愈伤组织的 颜色、结构有差别）。 选择合适的品种常是培养能否成功的关键因素。 例如，茄科的烟草属和曼陀罗属容易培养成功； 水稻种粳稻比籼稻容易培养，前者花粉愈伤组 织诱导率一般可达40-50%，而后者只有1-2%。
2.花粉的发育时期 2.花粉的发育时期
不同植物的花粉对离体培养有其特定的最敏感发育时期， 因此，选择发育到合适时期的花粉是提高花粉植株诱导 频率的重要因素。 例如，烟草和水稻的花粉从单核中期至双核早期都可接 受诱导；而天竺葵则从四分体的花粉得到了最佳的效果。 不过对于多数植物来说，单核期（包括早期、中期、晚 期）的花粉比较容易培养成功。 检查花粉的发育时期常用染色法，如用醋酸洋红等染色 制片，然后在显微镜下观察。
激素 在培养基的各种成分中，激素的水平和配比非常重要, 常对诱发细胞的分裂，生长和分化起决定作用。 附加成分 在花粉培养基中有时也加入种类较多的维生素、氨基 酸和其他有机附加物，合理搭配这些化合物可以在一定 程度上提高花粉植株的诱导频率。
5.培养方式与环境 5.培养方式与环境
光照
有关光照对离体花药培养的影响的研究报道很少。一般 认为愈伤组织诱导期间进行暗培养或散射光培养较好。 对某些烟草品种，连续的光照可以提高单倍体植株形成 的频率； 强光有利于小麦的绿苗分化，但会抑制愈伤 组织的形成。
2.实验器材 实验器材
超净工作台、冰箱、过滤除菌装置、高压 蒸汽灭菌锅、光照培养箱、剪刀、镊子、 酒精灯、培养瓶、培养皿、电子天平、容 量瓶、量筒、烧杯等
3.培养基方案 培养基方案
诱导组织培养基： MS+BA (1.0mg/L)+NAA (0.5mg/L) (1) MS+BA(1.0mg/L)+2,4-D(0.5mg/L) (2) 各加肌醇100mg/L，水解酪蛋白100mg/L，蔗糖30g/L， 琼脂 8g/L，PH5.8。 丛生增值培养基： MS+BA(0.5mg/L)+NAA(0.1mg/L) (3) 诱导生根培养基： 1/2MS+NAA((0.2mg/L) (4) (3)(4)培养基各加0.3%蔗糖，0.8%琼脂，PH5.8。培养温 度250℃，光照强度1200LX，光照时间12h/d。 ℃
培养温度
温度是花药培养的一个重要培养条件，影响花 药培养的效率。早期的一些报道显示花药培养 的温度一般不超过28℃ 。现在发现不少植物 ( 如: 水稻、小麦、曼佗罗等) 在较高的温度 下培养效果更好。
（关注：主要技术、存在问题、解决措施） 关注：主要技术、存在问题、解决措施）
参考文献
[1]殷红.细胞工程[M]. 北京：化学出版社, 2006. [2]谢从华, 柳俊. 植物细胞工程[M]. 北京：高等教育出 版社, 2004. [3]瞿宏杰.草莓花药培养技术[J]. 安徽农学通报, 2005,11(5):42-50 [4]谷延泽, 高瑞彦.草莓的花药培养[J]. 现代农业科技, 2008,(12):29-30 [5]王淑珍, 郑桂珍.草莓花药培养实验[J]. 杭州农业与 科技, 2009,(1):33-34 [6]查中萍, 柳俊, 刘定富.影响草莓花药培养因素的 分析[J]. 安徽农业科学, 2006,34(1):24-28
植物组织培养技术与花药培养技术的异同点
项目 相同点 不同点
植物组织培养技术
花药培养技术
外植体为体细胞， 离体的植物组织经脱分 外植体为体细胞，染色 体数无需加倍。 体数无需加倍。 化形成愈伤组织， 化形成愈伤组织，再分 化成丛芽，诱导出根， 化成丛芽，诱导出根， 然后进行移栽。 然后进行移栽。 取材为花药， 取材为花药，培养的为 单倍体幼苗，植株弱小， 单倍体幼苗，植株弱小， 高度不育， 高度不育，必须用秋水 仙素处理， 仙素处理，使染色体加 倍，恢复正常植株的染 色体数，而且为纯种。 色体数，而且为纯种。
三、接种和培养
1.接种
置于超净工作台无菌纸上剥取花药，并接种于培养基上。 在剥离花药时，要尽量不损伤花药（否则接种后，容易 从受伤部位产生二倍体的愈伤组织），同时还要彻底去 除花丝，因为与花丝相连的花药不利于愈伤组织或胚状 体的形成。 （带有花丝的花药易形成花丝的愈伤组织， 而花药愈伤组织形成受到严重抑制）
植物花药培养技术实施方案
生物化工—孙婉菊 生物化工 孙婉菊
花药培养（anther culture）
是指把发育到一定阶段的花药接种在适宜 培养基上，使其中的花粉发育成单倍体植 株的过程。由于花药培养采用的外植体是 植物的雄性器官，所以属于器官培养范畴。
1.植物花药培养
离体培养花药或将花粉粒从花药中分离出来进行培养， 可以得到单倍体花粉植株（pollen plant），因为单倍 体植株的单套染色体不存在显性基因掩盖隐性基因的问 题，所以在育种时便于正确而快速地进行选择，而且可 方便地经染色体加倍而获得纯合二倍体。 这些特点给育种工作带来了很大的便利，可大大缩短育 种周期，简化选育程序，提高选择效率，花药和花粉培 养已成为一种在植物育种上十分有效的技术。
花药培养意义
花粉粒（1N） 缩短了育 种周期， 为新品种 的选育开 辟了新途 径
单倍体植株花药培养优势
利用花药组培再生植株，主要基于植株在形成性器官、 性细胞时，部分或全部病毒被脱离。其优点是从愈伤组 织形成到分化出茎叶过程中，可以脱除病毒，并且脱毒 率比较高。 国内外研究表明，植物花药培养所获植株不带病毒，其 生长发育表现往往优于母株，可省去病毒鉴定程序，可 以在病毒种类不清和缺乏指示植物鉴定条件下使用。
Thank you !
Over
5、实验操作 、
一、材料的选择
二、预处理与消毒
三、接种和培养
一、材料的选择
1.材料草莓花药取自田间未脱毒苗。选择合适的花粉发育 时期也是提高诱导成功率的重要因素。一般来说，花粉 发育至单核靠边期的花药，花药培养成功率最高。为了 挑选到单核期的花药，选择完全未开放的花蕾。 通常花粉单核靠边期的草莓花蕾形态是:花萼未开放， 花蕾略长于花冠或花冠刚露白，花冠白色或者淡绿且不 松动，花药微黄而充实。