细菌耐药表型的检测（一）
1. 葡萄球菌
1.1 对β-内酰胺类药物
1.1.1 耐药机制
葡萄球菌对β-内酰胺类药物的耐药至少有三种不同的机制。①产生添加的青霉素结合蛋白PBP2a；②大量产生灭活药物的β-内酰胺酶；③内源性的PBP被修饰（modified intrinsic PBPs，MOD-SA）降低了与药物的亲和力。PBP2a由mecA基因编码，这个基因可能源自枯草杆菌，它所编码的PBP2a不但不与β-内酰胺类药物结合，而且能替代几种PBPs的功能，在细胞壁的合成中发挥转肽酶作用。带有mecA基因的菌株可以是同质性的，在体外药敏试验中均表现耐药；也可以是异质性的，在体外试验中仅1/104-108个菌表现耐药。大量产生β-内酰胺酶引起的耐药，是由于酶打开药物中的β-内酰胺环，使药物失去了与靶位（PBP）结合的能力，也称做药物被灭活。MOD-SA型耐药是由于葡萄球菌原有的PBP1、2、4被修饰后降低了β-内酰胺类药物的亲和力。
表13-1 耐β-内酰胺类药物的葡萄球菌的苯唑西林表型分类
苯唑西林mecA基因机制borderlinea耐药抑制剂作用β-内酰胺类交叉耐药其它药物交叉耐药
R(同质性) + PBP2a - - + +
R(异质性) + PBP2a ±- + +
S - 产生β-内酰胺酶增加+ + - -
R/S - PBP1、2、4被修饰+ - - -
a：borderline耐药表型：稀释法中，苯唑西林MIC在2-8ug/ml之间，无明确终点；扩散法抑菌圈直径10-13mm，边缘不整齐。
b：表示可以有例外情况
1.1.2 实验室检测
β-内酰胺酶检测采用酸法、碘法和头孢噻吩（nitrocefin）法3种方法任一种均可。
苯唑西林耐药性检测NCCLS推荐用琼脂筛选法。我们的具体方法是配制含40g/L NaCl 的MH琼脂（加水量为应加量的9/10），高压灭菌后分装试管每管9ml，加盖无菌橡皮胶塞后4℃保存。配制60μg/ml苯唑西林贮存液过滤除菌后分装，每管1ml，-20℃保存（冰箱结冰室-18℃左右亦可）半年内有效。临床用前将MH琼脂隔水煮沸溶化，冷至50℃以下，先将苯唑西林贮存液加入70mm直径的平皿，再倒入MH琼脂轻晃摇匀。将待测的金黄色葡萄球菌，调至0.5麦氏单位，点种琼脂后30℃～35℃（不可超过35℃）孵育24小时，有任何生长现象即为耐药。本法目前只适用金黄色葡萄球菌。
纸片扩散法检测苯唑西林的耐药性，方法同常规方法基本相同。不同处为：MH琼脂中NaCl浓度为40g/L，金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径判断标准≥13mm为敏感，11～13mm为中介，≤10mm为耐药；凝固酶阴性的葡萄球菌：≥18mm为敏感，≤17mm为耐药，注意要将平皿对着光线检查抑菌圈内是否有菌落生长。稀释法也是在MH中加入40g/L NaCl，金黄色葡萄球菌：MIC≤2μg/ml为敏感，≥4μg/ml为耐药；凝固酶阴性的葡萄球菌，MIC ≤0.25μg/ml为敏感，≥0.5μg/ml为耐药。
1.1.3 试验药物的选择和预报性
在常规工作中，葡萄球菌对β-内酰胺类药物的药敏试验，可以只检测青霉素、苯唑西林和氨苄西林/舒巴坦来判断，如果能用硝噻吩法检测快速β-内酰胺酶最好。青霉素敏感的菌株表示对所有不耐酶的青霉素类药物如氨苄西林、阿莫西林、羧苄西林、哌拉西林、替卡西林等均敏感，β-内酰胺酶阳性或青霉素耐药、氨苄西林/舒巴坦和苯唑西林敏感，表示对耐酶青霉素类药物或青霉素类/酶抑制剂的复合制剂敏感。苯唑西林耐药的葡萄球菌即目前被称为MRS（耐甲氧西林的葡萄球菌）菌株，这种耐药类型的细菌表示对所有的β-内酰胺类药物包括青霉素类、头孢菌素类、β-内酰胺类/酶抑制剂复合制剂、卡巴配能类均耐药。而这些药物在体外试验中可显示有活性，如果被误报给临床，可能会误导临床用药。同时苯唑西林耐药的葡萄球菌常常对红霉素、氯林可霉素、氯霉素、四环素、复方新诺明、旧喹诺酮或氨基糖苷类耐药。此外，苯唑西林敏感，而上述抗菌药物出现较多交叉耐药的菌株，也要考虑MOD-SA型的耐药，提示临床慎用表型为β-内酰胺类敏感的药物。
1.2 对氨基糖苷类药物
1.2.1耐药机制
细菌可以产生多种酶灭活氨基糖苷类药物，这种灭活作用非常复杂，它们主要分为三大类：乙酰转移酶（AAC）、核苷转移酶（ANC）和磷酸转移酶（APH）。每一类酶中又有许多亚类可以修饰不同位置上的羟基或氨基，导致不同的耐药表型，在葡萄球菌中（也发现在肠球菌中）最重要的是aac(6’)-Ie基因，编码产生双功能酶AAC（6’）加APH（2”）。其APH（2”）部分可以修饰庆大霉素、妥布霉素和卡那霉素，AAC（6’）部分可以修饰妥布霉素、奈替米星、卡那霉素和阿米卡星。因此这种双功能酶实际使细菌对除链霉素以外的所有氨基糖苷类药物耐药。有些酶能催化修饰不同的氨基糖苷类药物，但是由于酶对不同底物（药物）的米氏常数（Km）不同，其催化效率的高低使试验结果显现不同的表型。如APH （3’）-III可以修饰卡那霉素、奈替米星和阿米卡星，但在常规药敏试验中却表现为对阿米卡星敏感，显现错误的表型，除了产生灭活酶外，在金黄色葡萄球菌中也发现由于核糖体被修饰后导致的对链霉素的耐药。（同肠球菌详见本章2.2.1节）。
1.2.2 实验室检测及预报性
对氨基糖苷类的耐药性最好检测其耐药酶。临床可用的氨基糖苷类药物虽然并不多，但酶的种类、亚类却非常之多，因而只能在少量参考实验室进行此项工作。目前我们只能根据常规药敏试验中的某些表现推测其可能存在的耐药机制，修改实验室结果，预测临床疗效。下表列举了最常见的几种情况。
表13-2 葡萄球菌对氨基糖苷类药物的耐药预测
表型推论机制预测耐药
KmR TmS GmS AkS APH(3’) KmR TmS GmS AKI/R
KmR TmR GmS AkS ANT(4’) KmR TmR GmS AkI/R
GmR APH(2”)AAC(6’) 所有氨基糖苷类R（除链霉素外）
Km:卡那霉素Tm:妥布霉素Gm:庆大霉素AK:阿米卡星
R：耐药I：中介S：敏感
1.3 对糖肽类药物
