第三章细菌药敏试验及其耐药表型检测

第章细菌药敏试验及其耐药表型检测细菌药敏试验是临床细菌感染治疗中非常重要的检测手段，通过该技术可以检测不同抗生素对细菌的敏感性，进而为合理使用抗生素提供科学的依据。

然而，在临床应用过程中，随着抗生素不合理使用的增加，细菌耐药性也随之快速发展。

因此，针对不同耐药表型的检测越来越受到关注。

一、细菌药敏试验细菌药敏试验是一种用于判断细菌对不同抗生素敏感性的方法。

常见的细菌药敏试验方法包括纸片扩散法、E测试、革兰氏染色法、微量稀释法等。

其中纸片扩散法是最常用的一种方法，其原理是将待检细菌涂在琼脂平板上，然后在板上放置一些含有不同抗菌药物的试纸，细菌耐药性差的部分会被试纸上的抗生素杀灭，出现纯净孔（抑菌圈），通过抑菌圈的直径可以初步判断细菌对抗生素的敏感性或耐药性。

细菌药敏试验有很多应用价值，如能够帮助医生选择合适的抗生素治疗细菌感染，避免了不必要的抗生素使用，同时也可作为科研人员研究细菌抗药机制的工具，为抗菌药物的开发提供依据。

二、耐药表型检测随着细菌抗药性问题的不断加重，对不同耐药表型检测的需求也越来越迫切。

耐药表型是指细菌对特定抗生素的耐药情况。

由于不同的细菌及其不同的菌株对抗生素的敏感程度有所不同，因此抗菌药物在应用过程中会出现不同菌株对不同药物的耐药表型。

目前，针对不同耐药表型检测的方法主要有两种：基于分子生物学技术的方法和基于药敏试验的方法。

1. 基于分子生物学技术的方法基于分子生物学技术的方法是检测细菌耐药性最常用的方法之一。

该方法通过检测细菌中特定的基因或者基因片段，以此确定细菌耐药性的表型。

常见的基于分子生物学技术的方法包括PCR检测、基因芯片技术、实时荧光定量PCR等。

2. 基于药敏试验的方法基于药敏试验的方法是已经成熟的检测方法之一，其通过将药敏试验的结果与临床药物疗效相结合，进而确定细菌耐药性表型。

通过检测不同抗生素对不同菌株的敏感性，可以初步反映出细菌的耐药性状态。

当然，这种方法不仅涉及到耗时、耗材、人力等成本的问题，而且还受到试验条件、条件操作等方面的影响。

细菌耐药表型的检测（一）1. 葡萄球菌1.1 对β-内酰胺类药物1.1.1 耐药机制葡萄球菌对β-内酰胺类药物的耐药至少有三种不同的机制。

①产生添加的青霉素结合蛋白PBP2a；②大量产生灭活药物的β-内酰胺酶；③内源性的PBP被修饰（modified intrinsic PBPs，MOD-SA）降低了与药物的亲和力。

PBP2a由mecA基因编码，这个基因可能源自枯草杆菌，它所编码的PBP2a不但不与β-内酰胺类药物结合，而且能替代几种PBPs的功能，在细胞壁的合成中发挥转肽酶作用。

带有mecA基因的菌株可以是同质性的，在体外药敏试验中均表现耐药；也可以是异质性的，在体外试验中仅1/104-108个菌表现耐药。

大量产生β-内酰胺酶引起的耐药，是由于酶打开药物中的β-内酰胺环，使药物失去了与靶位（PBP）结合的能力，也称做药物被灭活。

MOD-SA型耐药是由于葡萄球菌原有的PBP1、2、4被修饰后降低了β-内酰胺类药物的亲和力。

表13-1 耐β-内酰胺类药物的葡萄球菌的苯唑西林表型分类苯唑西林mecA基因机制borderlinea耐药抑制剂作用β-内酰胺类交叉耐药其它药物交叉耐药R(同质性) + PBP2a - - + +R(异质性) + PBP2a ±- + +S - 产生β-内酰胺酶增加+ + - -R/S - PBP1、2、4被修饰+ - - -a：borderline耐药表型：稀释法中，苯唑西林MIC在2-8ug/ml之间，无明确终点；扩散法抑菌圈直径10-13mm，边缘不整齐。

b：表示可以有例外情况1.1.2 实验室检测β-内酰胺酶检测采用酸法、碘法和头孢噻吩（nitrocefin）法3种方法任一种均可。

苯唑西林耐药性检测NCCLS推荐用琼脂筛选法。

我们的具体方法是配制含40g/L NaCl 的MH琼脂（加水量为应加量的9/10），高压灭菌后分装试管每管9ml，加盖无菌橡皮胶塞后4℃保存。

细菌耐药表型检测细菌耐药表型的检测细菌耐药机制：1.产生药物灭活酶：细菌通过耐药因子可产生破坏抗生素或使之失去抗菌活性的酶，使药物在作用于菌体前即被破坏或失效。

水解酶：主要是β内酰胺酶，包括广谱酶、超广谱酶、金属酶、AmpC酶。

钝化酶：氨基糖苷类钝化酶，使氨基糖苷类抗生素分子结构发生改变，使药物不易进入细菌体内。

修饰酶：2．抗菌药物作用靶位的改变：细菌通过改变药物作用靶位的结构来降低药物和细胞靶位的亲和力，引起对抗菌药物的耐药性。

如细菌可改变青霉素结合蛋白（PBP S）的结构，降低与β—内酰胺类抗生素的亲合力，减少细菌与β—内酰胺类抗生素的结合，从而对β—内酰胺类抗菌药物耐药。

3.细菌细胞膜通透性改变：抗菌药物不易进入由于细菌细胞壁或细胞膜通透性的改变，致使抗菌药物无法进入细胞内而发挥抗菌作用。

细菌可改变细胞壁的孔蛋白通道，使青霉素类、头孢菌素类和氨基糖苷类抗生素不能进入菌体；4.细菌将抗菌药物泵出细菌细胞外（外排泵）：细菌还可合成新的蛋白插入细胞膜即产生新的膜转运系统，对抗菌药物产生外排作用，近年来发现了许多临床常见致病菌具有与其多重耐药相关的主动外排系统或外排泵，如绿脓杆菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、肠球菌、淋球菌等，促使抗菌药物快速从菌体排出，从而导致细菌的耐药性。

总之,细菌耐药性机制是一个相当复杂的问题，其中，细菌产生灭活酶或钝化酶引起的耐药性在临床上具有重要意义。

多重耐药菌往往综合上述几种耐药机制，使之对许多抗微生物药物产生耐药。

细菌耐药性的发生和发展是抗微生物药物的广泛应用，特别是无指征滥用的后果。

一、β-内酰胺酶检测使用范围：葡萄球菌、肠球菌、流感嗜血杆菌、淋病奈瑟菌、卡它莫拉菌。

方法：头孢硝基噻吩显色法（Nitrocefin）：制配纸片→灭菌水湿润→涂测试菌（G+菌可直接挑待测菌；G-菌提取细菌裂解液）于纸片上，10min观察纸片颜色，显红色为阳性（葡萄球菌应放置1h内观察）。

临床意义：若β-内酰胺酶阳性，则提示:流感、淋病、卡它对青霉素、氨苄西林、阿莫西林耐药葡萄、肠球对青霉素、氨基、羧基、脲基青霉素耐药对产该酶的菌株禁止应用青霉素类、广谱青霉素类抗菌药物，应根据药敏试验结果应用含酶抑制剂药物或头孢菌素联合氨基糖苷类或氟喹诺酮类，根据情况可选用糖肽类及碳青霉烯类抗菌药物。

药敏试验与耐药监测制度1. 背景介绍1.1 医院药敏试验与耐药监测制度的目的是为了保障药物治疗的有效性和安全性，防备或掌控耐药菌株的传播和扩散，提高患者治疗效果和医疗质量。

1.2 本制度适用于医院各科室和试验室涉及药敏试验和耐药监测的相关工作人员。

2. 药敏试验管理2.1 药敏试验的目的是评估细菌对药物的抗药性，为临床供应合理的抗菌治疗方案。

药敏试验应由具备相应资质和专业技能的医疗人员负责。

2.2 药敏试验人员应具备相关的专业知识和操作技能，并经过相关培训和资格认证。

2.3 药敏试验应在合适的试验室环境下进行，确保试验室设备的正常运行并定期进行维护。

2.4 药敏试验应依照标准操作规程进行，确保结果的准确性和可靠性，并做好记录和归档工作。

2.5 药敏试验结果应及时向临床医生反馈，并帮助订立合理的治疗方案。

3. 耐药监测管理3.1 耐药监测的目的是及时了解和监测细菌对药物的耐药情况，采取相应的措施防备和掌控耐药菌株的传播和扩散。

3.2 耐药监测工作应由特地的耐药监测小组负责，小构成员应具备相关的专业知识和技能，并定期进行培训和沟通。

3.3 耐药监测应涵盖医院内各科室的临床标本和环境标本，监测范围包含革兰阳性菌、革兰阴性菌和真菌等。

3.4 耐药监测应建立一个完善的数据库，并定期进行数据分析和报告。

3.5 耐药监测结果应及时向相关部门汇报，并订立相应的防控策略。

4. 药敏试验与耐药监测质控4.1 药敏试验和耐药监测应建立质量管理体系，并订立相关的质量掌控标准和程序。

4.2 药敏试验和耐药监测的操作人员应严格依照规定的操作流程和质量掌控标准进行操作。

4.3 药敏试验和耐药监测设备应定期进行校准和维护，并记录相关情况。

4.4 药敏试验和耐药监测的结果应进行双盲复核，并进行结果的比对和分析，确保结果的准确性和可靠性。

4.5 药敏试验和耐药监测过程中发生的异常情况和问题应及时报告，进行分析和处理。

5. 相关违规行为处理5.1 对于违反本制度规定的人员，将依照医院相关纪律处分管理方法进行处理。

细菌耐药表型的检测细菌耐药机制：1.产生药物灭活酶：细菌通过耐药因子可产生破坏抗生素或使之失去抗菌活性的酶，使药物在作用于菌体前即被破坏或失效。

水解酶：主要是β内酰胺酶，包括广谱酶、超广谱酶、金属酶、AmpC酶。

钝化酶：氨基糖苷类钝化酶，使氨基糖苷类抗生素分子结构发生改变，使药物不易进入细菌体内。

修饰酶：2．抗菌药物作用靶位的改变：细菌通过改变药物作用靶位的结构来降低药物和细胞靶位的亲和力，引起对抗菌药物的耐药性。

如细菌可改变青霉素结合蛋白（PBP S）的结构，降低与β—内酰胺类抗生素的亲合力，减少细菌与β—内酰胺类抗生素的结合，从而对β—内酰胺类抗菌药物耐药。

3.细菌细胞膜通透性改变：抗菌药物不易进入由于细菌细胞壁或细胞膜通透性的改变，致使抗菌药物无法进入细胞内而发挥抗菌作用。

细菌可改变细胞壁的孔蛋白通道，使青霉素类、头孢菌素类和氨基糖苷类抗生素不能进入菌体；4.细菌将抗菌药物泵出细菌细胞外（外排泵）：细菌还可合成新的蛋白插入细胞膜即产生新的膜转运系统，对抗菌药物产生外排作用，近年来发现了许多临床常见致病菌具有与其多重耐药相关的主动外排系统或外排泵，如绿脓杆菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、肠球菌、淋球菌等，促使抗菌药物快速从菌体排出，从而导致细菌的耐药性。

总之,细菌耐药性机制是一个相当复杂的问题，其中，细菌产生灭活酶或钝化酶引起的耐药性在临床上具有重要意义。

多重耐药菌往往综合上述几种耐药机制，使之对许多抗微生物药物产生耐药。

细菌耐药性的发生和发展是抗微生物药物的广泛应用，特别是无指征滥用的后果。

一、β-内酰胺酶检测使用范围：葡萄球菌、肠球菌、流感嗜血杆菌、淋病奈瑟菌、卡它莫拉菌。

方法：头孢硝基噻吩显色法（Nitrocefin）：制配纸片→灭菌水湿润→涂测试菌（G+菌可直接挑待测菌；G-菌提取细菌裂解液）于纸片上，10min观察纸片颜色，显红色为阳性（葡萄球菌应放置1h内观察）。

临床意义：若β-内酰胺酶阳性，则提示:流感、淋病、卡它对青霉素、氨苄西林、阿莫西林耐药葡萄、肠球对青霉素、氨基、羧基、脲基青霉素耐药对产该酶的菌株禁止应用青霉素类、广谱青霉素类抗菌药物，应根据药敏试验结果应用含酶抑制剂药物或头孢菌素联合氨基糖苷类或氟喹诺酮类，根据情况可选用糖肽类及碳青霉烯类抗菌药物。

细菌耐药的监测方法一、细菌耐药监测的方法定义 AST 是一个检测细菌耐药性的是一个检测细菌耐药性的体外抑菌试验（ART）AST目的：检出细菌对抗生素的耐药性，预测临床治疗结果。

AST:（1）手工试验 1.纸片扩散法(S,I,R)2.稀释法(MIC)3. E test(MIC)（2）自动仪器 Vitek，Microscan，Phoenix（3）分子试验 PCR直接检测mecA基因（4）酶试验 Nitrocefin、ESBL检测(一)常规药敏试验1.细菌耐药表型检测：判断细菌对抗菌药物的耐药性可根据NCCLS标准，通过测量纸片扩散法、肉汤稀释法和E试验的抑菌圈直径、MIC值和IC值获得。

也可通过以下方法进行检测：（1）耐药筛选试验：以单一药物的单一浓度检测细菌的耐药性被称为耐药筛选试验，临床上常用于筛选耐甲氧西林葡萄球菌、万古霉素中介的葡萄球菌、耐万古霉素肠球菌及氨基糖苷类高水平耐药的肠球菌等。

（2）折点敏感试验：仅用特定的抗菌药物浓度（敏感、中介或耐药折点MIC），而不使用测定MIC时所用的系列对倍稀释抗生素浓度测试细菌对抗菌药物的敏感性，称为折点敏感试验。

（3）双纸片协同试验：双纸片协同试验是主要用于筛选产超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）革兰阴性杆菌的纸片琼脂扩散试验。

若指示药敏纸片在朝向阿莫西林/克拉维酸方向有抑菌圈扩大现象（协同），说明测试菌产生超广谱β-内酰胺酶（4）药敏试验的仪器化和自动化：全自动细菌鉴定及药敏分析仪如：Vitek-2、BD-Pheonix、Microscan等运用折点敏感试验的原理可半定量测定抗菌药物的MIC值。

2．β-内酰胺酶检测：主要有碘淀粉测定法（iodometric test）和头孢硝噻吩纸片法（nitrocefin test）。

临床常用头孢硝噻吩纸片法，β-内酰胺酶试验可快速检测流感嗜血杆菌、淋病奈瑟菌、卡他莫拉菌和肠球菌对青霉素的耐药性。

如β-内酰胺酶阳性，表示上述细菌对青霉素、氨苄西林、阿莫西林耐药；表示葡萄球菌和肠球菌对青霉素（包括氨基、羧基和脲基青霉素）耐药。

实验七细菌的药敏试验及耐药性检测【目的和要求】1.掌握纸片扩散法（K-B法）、液体稀释法两种药敏试验的原理和方法。

2.熟悉上述两种药敏试验方法的应用。

3.了解几种细菌耐药表型检测的原理、方法及意义。

【试剂与器材】1．培养基：一般需氧和兼性厌氧菌采用水解酪蛋白（M-H）琼脂或M-H液体培养基（pH7.2~7.4）。

对于营养要求高的细菌，则需在M-H培养基中加入其它营养成分。

2．抗菌药物纸片：直径为6.0~6.35mm的滤纸片上，含有一定量的某种抗菌药物。

市场有售，但生产厂家须获得国家食品药品监督管理局（SFDA）批准。

不同种类的待测菌药敏试验选择不同的抗菌药物，药敏纸片的选择见表7-1。

3．待测细菌接种普通营养琼脂经35℃16~18h的纯培养物。

4. 0.5%麦氏比浊管配制方法如下：0.048mol BaCl2 (1.17% W/V BaCl2 . 2H2O) 0.5ml0.18mol H2SO4 (1%, V/V) 99.5ml将二液置冰水浴中冷却后混合，置螺口试管中，放室温暗处保存。

用前混匀。

有效期为6个月。

5.其它：无菌生理盐水、无菌棉签、无菌试管、酒精灯、镊子、生物安全柜、培养箱等。

【实验内容】一、纸片扩散法（K-B法）药敏试验1．原理将含有定量的抗菌药物纸片贴在已接种待测细菌的琼脂平板表面，纸片上的药物随即溶于琼脂中，并沿纸片周围由高浓度向低浓度扩散，形成逐渐减少的梯度浓度。

在纸片周围，一定浓度的药物抑制了细菌的生长从而形成了透明的抑菌环，抑菌环的大小则反映了待测菌对该种药物的敏感程度。

K-B法是由Kirby - Bauer 建立，美国NCCLS推荐，目前为世界所公认的标准纸片扩散法（定性法）。

2．方法（1）培养基的准备：将无菌M-H琼脂加热融化，趁热倾注入无菌的直径90mm平皿中。

琼脂厚为4mm（约23~25ml培养基），琼脂凝固后塑料包装放4℃保存，在5日内用完，使用前应在37℃培养箱放置30min使表面干燥。