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2010版药典黄曲霉毒素检验法（文字版）附录Ⅸ V 黄曲霉毒素测定法本法系用高效液相色谱法(附录ⅥD)侧定药材饮片剂制剂中的黄曲霉毒素(以黄曲霉毒B1、黄曲霉毒索B2、黄曲霉毒素G1和黄曲霉毒素G2总量计），除另有规定外，按下列方法测定。
色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-乙腈-水(10：18：42)为流动相，流速每分钟0.8ml；采用柱后衍生法检测。
衍生溶液为0.05%的碘溶液（取碘0.5g，加人甲醇100ml使溶解，用谁稀释至1000ml制成），衍生化泵流速每挣钟0.3ml衍生化温度70℃；以荧光检测器检测，激发波长λex=360nm(或365nm），发射波长λem=450nm。
两个相邻色谱峰的分离度应大于1.5。
混合对照品溶液的制备精密量取黄曲霉毒素混和标准品（黄曲霉毒B1、黄曲霉毒索B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2标示浓度分别为1.0ug/ml、0.3ug/ml、1.0ug/ml、0.3ug/ml）0.5ml，置10ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，作为储备液。
精密量取储备液1ml，置25ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，即得。
供试品溶液的制备取供试品粉末约15g（过二号筛），精密称定，加氯化钠3g，置于均质瓶中，精密加入70%甲醇溶液75ml，高速搅拌2分钟（搅拌速度大于11000转/分钟），离心5分钟（离心速度2500转/分钟），精密量取上清液15ml，置50ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜（0.45um）滤过，量取续滤液20.0ml，通过免疫亲和柱（AflaT-est@P），流速每分钟3ml，用水20ml洗脱，洗脱液弃去，使空气进入柱子，将水挤出柱子，再用适量甲醇洗脱，收集洗脱液，置2ml量瓶中，并用甲醇稀释至刻度，摇匀。
即得。
测定法分别精密吸取上述混和对照品溶液5ul、10ul、15ul、20ul、25ul，诸如液相色谱仪，测定峰面积，以峰面积为纵坐标，进样量为横坐标，绘制标准曲线，另精密吸取上述供试品溶液20-25ul，注入液相色谱仪，测定峰面积，从标准曲线上读出供试品中相当于黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒索B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2的量，计算，即得。
黄曲霉毒素测定法第一法本法系用高效液相色谱法（附录8）测定药材、饮片及制剂中的黄曲霉毒素（以黄曲霉毒素B1黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2总量计），除另有规定外，按下列方法测定。
色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-乙腈-水（40:18:42）为流动相，采用柱后衍生法检测，①碘衍生法：衍生溶液为0.05%的碘溶液（取碘0.5g，加入甲醇100ml使溶解，用水稀释至1000ml制成），衍生化泵流速每分钟0.3ml，衍生化温度70℃；②以光化学衍生法：光化学衍生器（254nm）；以荧光检测器检测，激发波长λex=360nm （或365nm），发射波长λem=450nm。
两个相邻色谱峰的分离度应大于1.5。
混合对照品溶液的制备精密量取黄曲霉毒素混合标准品（黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2标示浓度分别为1.0μg/ml、0.3μg/ml、1.0μg/ml、0.3μg/ml）0.5ml，置10ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，作为储备液。
精密量取储备液1ml，置25ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，即得。
供试品溶液的制备取供试品粉末约15g(过二号筛)，精密称定，置于均质瓶中，加入氯化钠3g，精密加入70%甲醇溶液75ml，高速搅拌2分钟（搅拌速度1100转/分钟），离心5分钟（离心速度2500转/分钟），精密量取上清液15ml，置50ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜（0.45μm）滤过，量取续滤液20.0ml，通过免疫亲合柱（AflaT-est@P）,流速每分钟3ml，用水20ml洗脱，洗脱液弃去，使空气进入柱子，将水挤出柱子，再用适量甲醇洗脱，收集洗脱液，置2ml量瓶中，并用水稀释至刻度，摇匀，即得。
测定法分别精密吸取上述混合对照品溶液5μl、10μl、15μl、20μl、25μl，注入液相色谱仪，测定峰面积，以峰面积为纵坐标，进样量为横坐标，绘制标准曲线。
黄曲霉毒素的测定方法本法用免疫亲和层析柱吸附并净化样品液中的黄曲霉毒素，采用高效液相色谱法测定药材中的黄曲霉毒素（以黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2总量计算）。
方法如下：色谱条件：色谱柱：150*4.6 mm 5um检测器：荧光检测器，激发波长365nm,发射波长455nm.，光化学柱后衍生法流动相：甲醇：水（45：55）流速： 0.8ml/min进样量：20ul混合对照品溶液的配制:取黄曲霉毒素（B1、B2、G1、G2）=2: 0.5: 2: 0.5（μg/ml）混合标准品储备液，配制一系列标准工作液，黄曲霉毒素标准品工作液的浓度为黄曲霉毒素（B1：B2：G1：G2）=0.5: 0.5: 0.125: 0.125(ng/ml)、黄曲霉毒素（B1：B2：G1：G2）=1: 0.25: 1: 0. 25(ng/ml)、黄曲霉毒素（B1：B2：G1：G2）=5: 2.5: 5: 2.5(ng/ml)、黄曲霉毒素（B1：B2：G1：G2）=10: 2.5: 10: 2.5(ng/ml)、黄曲霉毒素（B1：B2：G1：G2）=20: 5: 20: 5(ng/ml)供试品溶液的制备：精密称取粉碎的样品20.0g,精密加入70%甲醇100ml，加入氯化钠4g,振荡1个小时或高速搅拌2分钟，过滤：精密量取滤液5ml,加入PBS缓冲液（8.0g氯化钠、0.2g氯化钾、1.2g磷酸氢二钠、0.2g磷酸二氢钾溶解于约990ml水中，用浓盐酸调节PH至7.0，用水稀释至1L）45ml,用玻璃纤维滤纸过滤，滤液待测。
供试品溶液的净化：1.取出免疫亲和柱，恢复至室温，将上方塞子取出斜剪断，再插回亲和柱上，连接储样管和收集管；2.上样：准确量取过玻璃纤维滤纸的滤液10ml过柱，去掉免疫亲和柱下方堵头，调节开关，流速为1ml/min左右；3.清洗：液体排净后，加入10mlPBS溶液，清洗柱子，流速为3ml/min；4.洗脱：用1.0ml甲醇洗脱，建议将甲醇的量分2次加入（比如0.5ml×2），每次加入后，要让甲醇充分浸泡柱子里的凝胶2分钟，收集全部甲醇洗脱液，过滤膜，待检。
黄曲霉毒素检测方法
黄曲霉毒素是引起动物和人类食物中毒的常见真菌毒素之一。
为了确保食品的安全和质量，需要对食品样品中的黄曲霉毒素进行检测。
下面介绍几种常用的黄曲霉毒素检测方法。
1. 高效液相色谱法（HPLC）：HPLC是一种常用的分离、鉴定和测定食品中黄曲霉毒素的方法。
该方法使用高效液相色谱仪通过不同的分离柱，将样品中的黄曲霉毒素与其他组分分离开来，并根据其唯一的吸收特性进行检测和定量测定。
2. 气相色谱法（GC）：GC是一种基于样品中物质的挥发性的分离和检测方法，可以用于测定黄曲霉毒素B1和黄曲霉毒素B2。
该方法需要将样品进行预处理，如萃取、净化等，然后通过气相色谱仪进行分离和检测。
3. 免疫测定法：免疫测定法是一种基于抗原与抗体特异性结合的原理进行黄曲霉毒素检测的方法。
常见的免疫测定法包括酶联免疫吸附试验（ELISA）和放射免疫测定法（RIA）。
这些方法操作简便、快速，可以实现对大量样品的高通量检测。
4. 质谱法：质谱法是一种可靠的黄曲霉毒素检测方法。
质谱法主要包括质量光谱（MS）和质谱联用技术（LC-MS/MS）。
这些方法通过样品中黄曲霉毒素的特征峰进行检测和定量，并具有高灵敏度和高选择性的优势。
以上是几种常用的黄曲霉毒素检测方法，每种方法都有其优缺点，选用合适的方法应根据样品特性、设备条件、经济性和检
测需求来决定。
为了确保食品的安全，建议将不同的检测方法结合使用，以提高检测的准确性和可靠性。
中药材中黄曲霉毒素的测定方法优化及验证（ HPLC-FLD）2云南白药集团股份有限公司，云南昆明 650500摘要：目的：建立一个用液相色谱法测定中药材中黄曲霉毒素含量的方法。
方法：色谱柱：Agilent XDB-C18(5μm，4.6×250mm)；流动相: 甲醇-乙腈-水（30:16:54）；流量: 0.8 ml/min；荧光检测波长:激发波长360nm,发射波长450nm；柱温:30 ℃。
结果：根据药材基质的不同，优化得出相应满足方法要求的前处理方法并进行了验证。
结论：优化后方法可用于中药材中黄曲霉毒素含量的测定。
关键词：黄曲霉毒素；基质效应；FLD检测器；方法确认黄曲霉毒素（aflatoxins，AFTs）是黄曲霉和寄生曲霉等菌种产生的次生代谢产物[1]，毒性极强，可对肝脏造成不可逆的损害，还严重损害其他多种组织器官，并能致癌、致畸、致细胞突变[2]。
中药的基质背景复杂，色素黏液质及中药中不同有效成分都会给AFTs检测带来不同程度的影响，检测中容易出现假阳性结果，故亟需建立适用于中药检测的特殊前处理方式及结果校正曲线等新的AFTs 检测方法研究。
1仪器与材料1.1 样品：陈皮、肉豆蔻、延胡索、地龙、僵蚕、全蝎、水蛭、蜈蚣、土鳖虫、九香虫、槟榔、莲子、胖大海、大枣、麦芽、远志、马钱子、薏苡仁、柏子仁、桃仁、酸枣仁、使君子、决明子1.2 仪器：美国Agilent液相色谱仪1260(FLD检测器)。
1.3试剂乙腈、甲醇：色谱级；去离子水；氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化钾：分析纯。
黄曲霉毒素混合对照品：中国食品药品检定研究院。
2方法与结果2.1色谱条件以C18键合硅胶为填充剂；以甲醇-乙腈-水（40:18:42）为流动相；采用柱后衍生法检测，光化学衍生法：光化学衍生器（254nm）；检测器为FLD，λex =360nm，λem=450nm。
2.2样品处理取样品粉末15g，精密称定，置于离心管中，加氯化钠3g，精密加入75ml 70%甲醇溶液[3]，11000r/min均质2分钟，离心5分钟，取上清液15ml，置50ml量瓶中加水定容，摇匀，离心，用玻璃纤维滤纸过滤[3]，量取续滤液20ml，通过免疫亲合柱，用淋洗缓冲液20ml洗脱，洗脱液弃去，使柱子暴露在空气中5min，将水吹尽并用快速滤纸擦干亲和柱内壁，加1.5ml甲醇洗脱并收集于2ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，过滤，取续滤液，即得。
中药材中黄曲霉毒素检测方案
黄曲霉毒素介绍
黄曲霉毒素是一类真菌(如黄曲霉和寄生曲霉)的有毒的代谢产物，它们具有很强的致癌性，主要存在于药材、谷物、坚果、棉籽以及动物饲料相关的产品中。
其毒性远远高于氰化物、砷化物和有机农药的毒性，其中以B1毒性最大。
当人摄入量大时，可发生急性中毒，出现急性肝炎、出血性坏死、肝细胞脂肪变性和胆管增生。
当微量持续摄入，可造成慢性中毒，生长障碍，引起纤维性病变，致使纤维组织增生。
背景
各级食品药品监管部门不断加大中药生产流通监管力度，努力保持中药质量总体稳定。
国家食品药品监督管理局关于规范中药生产经营秩序严厉查处违法违规行为的通知(国食药监安[2012]187号中，要求加强对重金属及有害元素、农药残留、黄曲霉毒素等安全性指标的检测和控制，切实保证中药材质量和安全，另要求企业具备与生产品种相适应的检验设备和能力，严把质量检验关。
《国家药品安全“十二五”规划》，规划中明确提出“开展药品快速检验技术研究，搭建检验技术共享平台”、“加快推进药品快速检验技术在基层的应用，配置快速检验设备”、“加强县级机构快速检验能力建设”的要求。
中药中黄曲霉毒素的检测方法
2010版《药典》附录IX V 黄曲霉毒素测定采用高效液相色谱法，另外增补药典描述该法检测建立增加柱后光化学衍生法。
原理
样品经甲醇-水提取，提取液经过滤、稀释，滤液经过含有黄曲霉毒素特异抗体的免疫亲和柱层析净化，黄曲霉毒素交联在层析介质中的抗体上，此抗体对黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2具有专一性，用水将免疫亲和柱上杂质除去，以甲醇通过免疫亲和柱洗脱，再经光化学衍生器柱后衍生，以提高检测准确性。
主要试剂及耗材
气控操作架：含气泵
黄曲霉毒素免疫亲和柱1ml或3ml
光化学衍生器
玻璃微纤维滤纸：直径11cm、孔径1.5µm
玻璃试管：直径12mm，长75mm，无荧光特性
注射器：10ml、20ml
检测步骤
样品粉碎——提取——洗脱液进样、亲和柱净化——化学衍生——检测数值
气控操作架的使用说明：
在样品粉碎后需要过亲和柱净化，也就是怎么方便亲和柱使用操作的问题，气控操作架能有效地提高这个环节的工作效率：
1.连接组装好的气控操作架，将免疫亲和柱、注射器针筒与气控操作架连接;
2.将处理后的溶液上样;
3.调节空气泵旋钮以控制流速，使样液以1-2d/s的速度流出;
4.待样液完全排干，用去离子水或蒸馏水以2-3d/s的流速洗涤两次，每次10ml;
5.待液体完全排干，将样品瓶置于亲和柱下方，上样1ml甲醇以1d/s的速度流出至完全排干。
以上操作步骤是用免疫亲和柱--高效液相法检测中药中黄曲霉毒素的必经步骤，如使用气控操作架就能很好的固定亲和柱并以可控流速操作，既高效也能使操作误差减到最小。
使用光化学衍生器原因
由于黄曲霉具有较强的紫外吸收和产生荧光的特性，因此可以进行HPLC-紫外或荧光检测，但是同时黄曲霉毒素中的B1、G1由于其在含水的流动相中容易产生荧光淬灭，因此在很多的实验中都会采用衍生法测定黄曲霉毒素。
衍生的方法也很多：有柱前的，柱后的，在线的，由于在线的柱后光化学衍生有明显的优势，所以现在被增补为药典的微生物检测方法，优势主要在于(无需任何化学试剂、对人员无伤害;无需人员直接操作、避免误差; 无需担心衍生液腐蚀检测器)。
